2024年1月8日发(作者：渠若云)

6・南通大学学报(医学版)Journal

of

Nantong

University

(Medical

Sciences)

2021

:

41

(1)D0I:10.16424/32-1807/r.2021.01.002G蛋白耦联胆汁酸受体激动剂INT777

通过激活AMPK信号通路抑制施万细胞成髓鞘过程*

关晋东：丁杰，刘晓宇，孙诚***(南通大学教育部/江苏省神经再生重点实验室/神经再生协同创新中心，南通226001)［摘

要］目的：研究G蛋白耦联胆汁酸受体(G-protein-coupled

bile

acid

receptor

1,

GPBAR1,同时也被称为TGR5)

特异性激动剂6琢-乙基-23(S)-甲基胆酸［6

alpha-ethyl-23(S)-methylcholic

acid,

INT777［对原代施万细胞髓鞘形成的影响

并初步探讨其可能的作用机制遥方法:用5

滋mol/L的INT777处理二丁酰环腺苷酸(dibutyryl

cyclic

adenoslne

phosphate,

dbcAMP)诱导分化原代施万细胞成髓鞘模型，用免疫印迹(Western

Blot)方法检测髓磷脂蛋白表达量的变化遥同时，提取

施万细胞总核糖核酸后用定量聚合酶链式反应试验检测INT777对髓鞘形成过程相关分子基因表达的影响遥另外，用

Western

Blot方法检测INT777对单磷酸腺苷活化蛋白激酶/核糖体蛋白S6激酶(adenosine

5'-monophosphate-activated

protein

kinase/ribosomal

S6

kinase,

AMPK/S6K)信号途径的影响遥结果:在dbcAMP诱导分化原代施万细胞成髓鞘过程中，

5

滋mol/L

INT777的处理抑制了髓鞘早期生长因子20,八聚体结合转录因子6,髓磷脂蛋白的表达，且5滋mol/L

INT777

处理激活了

AMPK的活性，抑制了雷帕霉素作用靶点信号通路遥结论：INT777抑制dbcAMP诱导的施万细胞成髓鞘过

程，这种抑制作用可能是通过激活施万细胞AMPK活性、抑制S6K活性实现的遥［关键词］施万细胞曰髓鞘曰6琢-乙基-23(S)-甲基胆酸曰单磷酸腺苷活化蛋白激酶［中图分类号］R338.1

［文献标志码］A

［文章编号］1674-7887(2021)01-0006-05G-protein-coupled

bile

acid

receptor

agonists

INT777

inhibits

myelination

of

Schwann

cells

by

activating

AMPK

signaling

pathwayGUAN

Jindong**,

DING

Jie, LIU

Xiaoyu,

SUN

Cheng***

*('Key

Laboratory

of

Neuroregeneration

of

Jiangsu

and

Ministry

ofEducation,

Co-innovation

Center

of

Neuroregeneration,

Nantong

University,

Nantong

226001)［Abstract］

Objective:

To

investigate

the

effects

of

G-protein-coupled

bile

acid

receptor

1(GPBAR1,

also

known

as

TGR5)specific

agonist

6

alpha-ethyl-23(S)-methylcholic

acid(INT777)

on

myelination

in

primary

Schwann

cells

and

the

underlying

mechanisms.

Methods:

Primary

Schwann

cells

were

treated

with

5

滋mol/L

INT777

and

dibutiryl

cyclic

adenoslne

phosphate

(dbcAMP),

and

the

changes

of

myelin

protein

zero

were

detected

by

Western

Blot.

Meanwhile,

the

total

RNA

was

extracted

from

Schwann

cells

and

quantitative

real

time

polymerase

chain

reaction

was

employed

for

detecting

myelin

gene

expression.

In

addition,

the

effect

of

INT777

on

the

adenosine

5'

-monophosphate

-activated

protein

kinase/ribosomal

protein

S6

kinase

(AMPK/S6K)

signaling

pathway

was

examined

by

Western

Blot.

Results:

Treatment

with

5

滋mol/L

INT777

inhibited

the

expression

of

myelin

early

growth

response

-2,

octamer

-binding

transcription

factor

6,

and

myelin

protein

zero

during

dbcAMP-induced

myelination

of

differentiated

Schwann

cells,

and

treatment

with

5

滋mol/L

INT777

activated

AMPK

activity

and

inhibited

mTOR

signaling

pathway.

Conclusion:

INT777

attenuates

dbcAMP-induced

myelination

of

Schwann

cells,

which

may

be

achieved

by

activating

AMPK

and inhibiting

S6K

activity.［Key

words］

Schwann

cell;

myelination;

6

alpha-ethyl-23(S)-methylcholic

acid;

adenosine

5'-monophosphate-activated

protein kinase外周神经系统(peripheral

nervous

system,

PNS)

在机体内分布广泛且起到介导靶器官与中枢神经系

统信号传递的重要作用。轴突的髓鞘化是神经系统

髓鞘形成这一重要任务由施万细胞完成。外周神经

髓鞘形成过程是一个严谨的、由多种转录因子参与

调控的复杂生理过程叫

这些转录因子包括SRY盒

传递神经冲动信号，执行其功能的基础保障,髓鞘化

过程异常会导致多种疾病的发生［1］o外周神经中执行

*

［基金项目］国家自然科学基金青年基金资助项目(81701222)转录因子

10(SRY-box

transcription

factor

10, Sox10)，

八聚体结合转录因子

6(octamer-binding

transcription

**

［作者简介］关晋东，男，汉族，生于1995年10月，山西省晋城市人，硕士在读，研究方向:外周神经发育及损伤修复机制的研究。***

［通信作者］

孙诚，电话**************,E-mail:

********************.cn

关晋东，等.G蛋白耦联胆汁酸受体激动剂INT777通过激活AMPK信号通路抑制施万细胞成髓鞘过程7・factor-6,

Oct6),髓鞘早期生长因子

20(early

growth

response-2,

Krox20)，髓磷脂蛋白(myelin

protein

zero,

MPZ)等。G蛋白耦联胆汁酸受体(G-protein-coupled

bile

acid

receptor

1,

GPBAR1,同时也被称为

TGR5),在

多种组织和器官中有不同水平的表达，功能多样耳

有报道网指出TGR5可通过激活环磷酸腺苷(cyclic

adenosine

monophsphate,

cAMP)-单磷酸腺苷活化蛋

白

激酶(adenosine

5'

-monophosphate

-activated

pro­tein

kinase,

AMPK)信号通路调节恶性肿瘤的发生发

展过程。6a-乙基-23(S)-甲基胆酸［6

alpha-ethyl-23(S)-methylcholic

acid,

INT777］是

TGR5

特异性激动

剂,具有毒性低、效价高等特点。研究冋发现施万细胞

与背根神经节(dorsal

root

ganglia,

DRG)神经兀共培

养模型中，二丁酰环腺苷酸(dibutyryl

cyclic

adenoslne

phosphate,

dbcAMP)的添加能促进细胞分化,加速髓

鞘化进程。本研究旨在通过激动剂INT777处理原代

施万细胞，明确其对外周神经髓鞘化进程的作用,

并初步探讨其作用机制。1材料与方法1.1实验动物

出生1d的SD大鼠红皮30只购

于南通大学实验动物中心。1.2

实验试剂

Forsklin,

HRG(human

Heregulin-1)、

dbcAMP、Trizol、ComC

(Compound

C)均购于

MERCK

公司，DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、胎牛血清均购

于

Gibco

公司，SuperScript

IV/RT-PCR

Kit

Applied

Biosystem

SYBR

Green

Mix

购于

Thermo

Fisher

公

司,SDS-PAGE凝胶购于碧云天生物公司,细胞裂解

液

RIPA,5xSDS-PAGE

电泳缓冲液、5xSDS-PAGE

Loading

buffer、10xTrans

buffer10x三羟甲基氨基甲

烷盐酸盐溶液(Tris

buffered

saline

tween,

TBST)均在

实验室自配。1.3

实验方法1.3.1施万细胞培养施万细胞的分离纯化参考前

人方法，进行稍许改良冋。出生1d的SD红皮鼠,5%

乙醇消毒,置于冰盒上冷冻麻醉。沿着坐骨神经走向

迅速分离,使神经充分暴露,尽快取出坐骨神经剪碎

并放置于预冷的DMEM培养基中,1

000

g离心

5

min,弃上清。随后加入1

mL浓度为3

mg/mL的胶

原酶溶液37益孵育30

min,

1

000

g离心5

min,弃

上清。加入胰蛋白酶溶液37益孵育10

min,弃上清，

加入完全培养基重悬，过400目筛网，并在中皿培养。

过夜后，换含

10

滋mol/L

阿糖胞^(Cytarabine,

Ara-C)

培养

48

ho

随后换含

2

滋mol/L

Forskolin

和

50

ng/mL

HRG的培养基，继续培养细胞。当密度达到接触抑

制时，吸出上清液，用1

mL含Thy1.1抗体的培养基

重悬细胞，冰上孵育1h,1

000

g离心5

min,弃上

清。再用1

mL含补体的培养基37益孵育1

h,离心，

DMEM高糖培养基重悬种于中皿等待后续实验。本

实验严格遵守南通大学动物实验伦理委员会要求,

保障实验动物福利。1.3.2

施万细胞处理

5

滋mol/L的INT777处理施

万细胞，分为4组:对照组(NC)、dbcAMP处理组(终

浓度为

1

mmol/L)、INT777

处理组及

dbcAMP

+

INT777处理组。随后,为了进一步验证可能的作用

机制，将施万细胞分为4组:对照组(NC)、dbcAMP处理

组(终浓度为1

mmol/L)、dbcAMP+INT777处理组及

dbcAMP+INT777

+ComC(终浓度为

10

nmol/L)处理

组。药物处理24

h后收样用于后续研究。1.3.3施万细胞总RNA提取实验过程严格按照

说明书步骤进行。通过Trizol试剂裂解施万细胞，经

氯仿变性及异丙醇沉淀后,最终获得高质量的总

RNAo测定浓度,定量至1滋g后逆转录成cDNA第

1链,4益保存用于后续定量实时聚合酶链式反应试

验(quantitative

real

time

polymerase

chain

reaction,

qPCR)研究。1.3.4施万细胞总蛋白质提取所有的步骤均在冰

上进行。

药物处理后的施万细胞中加入预冷的细胞

裂解液RIPA

250滋L,用一次性细胞刮将细胞刮离，

收集于1.5

mL的离心管中。冰上敷育30

min,期间

不断震荡，4益，12

000

r/min离心20

min后，通过

BCA方法进行蛋白质定量。各组样品蛋白浓度调至

相同水平，加入上样缓冲液，混匀后于100益加热

5

min,冷却至室温用于后续Western

Blot分析。1.3.5细胞免疫荧光细胞种于24孔板中预先放

置的玻片上，处理完毕后弃上清，多聚甲醛固定。磷

酸缓冲盐溶液(phosphate

buffer

saline,

PBS)洗

3

遍后

室温封闭0.5

h,—抗过夜。第2天PBS洗净一抗，二

抗室温孵育2

h,PBS洗3遍后染核。最后在载玻片

上滴加荧光封片剂,将玻片正面盖在载玻片上，蔡司

荧光显微镜拍照分析。1.3.6

qPCR按照Thermo

Fisher公司说明书要求

进行实验，每个样品做3个生物学重复，对结果中的

Cq值，按照2盘。方法进行计算分析。引物序列为：

18S

rRNA

正向引物:5'

-AGCTCCAATAGCGTATAT-

TAAAG-3';负向弓丨物：5'

-CGGTCCTATTCCATTAT-

TCCTA

-3'。Krox20

正向引物：5'

-TGGGTTTAAG-

8・南通大学学报（医学版）2021

:

41(1)TATGGCTGTATA-3';负向弓【物：5'-AGTTAGTGGT-

TCTGTGTTAGA-3'。MPZ

正向引物：5'

-GGATAA

GAAATAGCGGTTAGC-3';负向弓丨物：5'-TTGAGG-

CTGGTTCTACTG

-3'。Oct6

正

向引物：5'

-TTCC

-

TAATTTCTGACCCATCT-3';负

向引物：5'

-GCAAT-

AAAGATACAAAGAGAATGG-3'。1.3.7

Western

Blot预先制备十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶，加样后进行电泳和转膜。室温封闭1

h,

一抗4益过夜。隔天用含有吐温的TBST洗净一抗,

注:A,

DAPI标记施万细胞核;B,

TGR5定位于施万细胞的膜

和胞质中；C,

MERGE,

DAPI与TGR5的合图。图1

TRG5在原代施万细胞中的表达定位■

NCQ

dbcAMP=

INT777MINT777+dbcAMP*****室温孵育二抗1

h,TBST洗净，最后配置显影液显影。

614"*******1.3.8统计学方法采用SPSS

25.0统计学软件进

行数据分析,以軃s表示，两组间比较采用t检验，组

间比较采用one-way

ANOVA检验,P<0.05为差异

1_'12-有统计学意义。2

结

果0Krox20

Od6

MPZ注：*P<0.05,

**P<0.01,

***P<0.001。2.1

TGR5在施万细胞的定位通过细胞免疫荧光技术观察TGR5在施万细胞中的表达情况，结果显示

图2INT777抑制dbcAMP诱导施万细胞成髓鞘模型中髓鞘相关基因的表达TGR5表达于施万细胞的膜与细胞质中（图1）。因此,

施万细胞体外添加激动剂INT777可有效激活TGR5。过Western印迹技术探究INT777抑制髓鞘基因表

达的可能机制，其中dbcAMP可有效诱导体外施万

2.2

INT777抑制髓鞘相关因子的表达

qPCR技术

检测INT777与dbcAMP诱导分化施万细胞成髓鞘

之间的关系。结果显示,5

滋mol/L的INT777处理可

显著抑制髓鞘相关基因如6及MPZ的

表达（图

2）。细胞髓鞘的分化形成，因而通常用作阳性对照组。实

验结果显示INT777促进了

p-AMPK的表达，抑制

p-ERK与p-S6K的活性（图3）,因此，推测INT777

可能是通过激活AMPK进而抑制S6K活性来抑制

施万细胞的成髓鞘过程。2.3

INT777激活施万细胞p-AMPK信号通路

通AdbcAMP

-

INT777

-

+

-

B-

+

++p-S6K/0-actinz55

■z

'L50

L'55

0

0p-AMPK/AMPKp-ERK/ERKMPZ/0-actinp-S6K

［「-----—p-AMPK

|

一

一

•-—INT777

-

-

+

+

dbcAMP

-

+

-

+注:A,Western

Blot

结果;B,A

图的统计结果。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

o

图3

INT777影响dbcAMP诱导施万细胞成髓鞘模型中AMPK/S6K信号通路2.4

ComC促进施万细胞髓鞘的形成

ComC是

AMPK特异性的抑制剂,之前的实验结果显示INT777

通过激活施万细胞AMPK活性抑制了髓鞘相关基

3

讨

论PNS中的外周神经纤维是传输神经冲动的主要

载体,而外周神经纤维主要由轴突、髓鞘和结缔组织

因的表达,为进一步证实这个猜想,随后在细胞内加

入10

nmol/L

ComC来抑制AMPK活性，qPCR及

构成的神经内膜组成，

其中影响神经冲动传导的关

键是髓鞘叫髓鞘主要是由施万细胞以1：1模式包裹

Western

Blot结果显示相对于INT777处理组而言，

ComC与INT777双处理后逆转了

INT777对髓鞘基

因表达的抑制效果（图4）。直径>1滋m的轴突而形成的阻施万细胞不仅在维持

外周神经稳态和髓鞘发育过程中发挥重要作用，且

关晋东，等.G蛋白耦联胆汁酸受体激动剂INT777通过激活AMPK信号通路抑制施万细胞成髓鞘过程9・A

・NC

5

4

3

2

1

0口

dbcAMPB

ComC

dbcAMP

INT777

口INT777+dbcAMP

酬

INT777+dbcAMP+ComC**_*

-

-

-

-

+

-

-

+

+

+++^首戈之电Krox20

Octo

MPZp-AMPK/AMPKp-S6K/0-actin

2.5-■

2.0p-ERK/ERK!I***

|

****

匕

U***

MPZ/p-actin**

*

**

***11.0

0

”|

<■--------~1

~I--------1■

r-----~~""I1.51.00.50.0INT777

-

-

+

+

-++0.0++++++++dbcAMP

-

+

+

++++++ComC

-

-

-

+注:A,qPCR结果;B,

Western

Blot

结果;C,B

图的统计结果。**P<0.01,***P<0.001图4ComC挽救INT777对施万细胞髓鞘相关基因表达的抑制作用能修复损伤的髓鞘[9]o外周神经髓鞘形成过程分为预髓鞘阶段和成熟

髓鞘阶段,是一个严谨的、由多种转录因子参与调控

果显示在施万细胞中5

滋mol/L

INT777的处理激活

了

AMPK,推测这一现象可能与INT777浓度有关。

INT777

Deoxycholic

acid、TGR5

Receptor

Agonist

等

都是TGR5的激活剂，其中INT777因其特异性佳,

的复杂生理过程。研究问表明，转录因子Sox10与

Oct6主要存在于预髓鞘阶段,Sox10是施万细胞形

成髓鞘并维持其稳定所必需的，且能激活Oct6,从

而启动施万细胞进入预髓鞘化阶段。Sox10与Oct6

协同作用可诱导转录因子Krox20的表达，从而促使

效果好,毒性小而常被研究者使用。研究凹指出,溶

血磷脂酸LPA通过刺激施万细胞等胶质细胞来调

节氯喹和TGR5激动剂INT777引起的神经元反

应，如瘙痒、疼痛等症状。有研究㈣报道指出脂肪细

胞及肝脏细胞经INT777处理显著地提高了胞内

预髓鞘阶段向髓鞘化阶段转变。Krox20因子一方面

可激活大量髓鞘化基因如MPZ及髓磷脂碱性蛋白

cAMP的表达，提高了细胞能量代谢效率,而INT777

在dbcAMP诱导的原代施万细胞成髓鞘模型中是否

也发挥着同样的作用及具体的作用机制有待进一步

研究。(myelin

basic

protein,

MBP)的表达，另一方面可抑制

去髓鞘化基因(Sox2、c-Jun)的表达,通过这两方面的

作用，促进稳定成熟的髓鞘套的形成问。虽然对外周

神经髓鞘形成过程的研究很多，但具体的作用机制

众所周知,AMPK的活化可以延缓合成代谢反

应,降低能量消耗,已有报道01指出AMPK可以负向

调控外周神经髓鞘的发育。

施万细胞中

LKB1-AMPK

并不十分清楚。TGR5属于GPCR家庭成员，可以调节能量平衡

和糖代谢过程，促进胰岛素的分泌和生物合成[12],

参与多种肿瘤的发生发展过程[13],可激活炎症因子

而产生抗炎、利胆作用[14],也可减轻肝脏炎症，抑制

和mTOR信号网络调节轴突完整性和髓鞘的形

成㈣。本研究中,INT777的处理抑制了髓鞘相关因

子Krox20、Oct6及MPZ的表达，且促进了

p-AMPK

动脉粥样硬化斑块形成问。TGR5作为膜受体，可与

相应配体结合内化到细胞质中，在核因子-kB、蛋白

的表达,这与前人㈣报道一致。mTOR信号通路是调

控外周神经髓鞘发育的经典的信号途径,而p-S6K

是非常关键的调控因子㈣。髓鞘形成是一种代谢性

生理过程,mT0R信号通路作为一种协调细胞代谢

激酶B(protein

kinase

B,

PKB)和细胞外信号调节激

酶(extracellular

regulated

protein

kinase,

ERK)等信号

通路中发挥重要作用皿叫该受体经典的下游靶标是

的信号中枢，被认为是髓鞘形成的关键信号㈤。本研

究显示INT777的处理提高了

p-AMPK的表达，抑

cAMP(由乙酰辅酶A催化ATP后形成)，可直接提高

体内PKA活性，抑制AMPK活性两。但是,本研究结

制了

p-S6K的活性，表明该药物对外周神经髓鞘的

-10・南通大学学报（医学版）2021

:

41(1)影响可能是通过激活AMPK,抑制S6K活性来发挥

作用的。为进一步验证这一猜想,在INT777处理的

施万细胞中又同时添加了

AMPK的抑制剂ComC,

通过Western

Blot等证实ComC的添加逆转了

INT777对髓鞘发育过程的抑制现象。表明INT777

可能通过AMPK信号通路发挥其对髓鞘化过程的

影响。总之,INT777可抑制dbcAMP诱导的施万细胞

髓鞘化过程，并且是通过激活

AMPK

活性，抑制

S6K

活性来实现的。[参考文献][1]

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et

al.

The

G-protein-coupled

bile

acid

receptor,

Gpbar1(TGR5),

negatively

reg­ulates

hepatic

inflammatory

response

through

antagonizing

nuclear

factor

资

light-chain

enhancer

of

activated

B

cells

(NF-kB)

in

mice[J].

Hepatology,

2011,

54(4):1421-1432.[15]

POLS

T

W, NOMURA

M,

HARACH

T,

et

al.

TGR5

acti­vation

inhibits

atherosclerosis

by

reducing

macrophage

inflammation

and

lipid

loading[J].

Cell

Metab,

2011,

14:747-757.(6)[16]

KITA

T,

TSUBOSAKA

Y,

HORI

M,

et

al.

Bile

acid

re­ceptor

TGR5

agonism

induces

NO

production

and

reduces

monocyte

adhesion

in

vascular

endothelial

cells[J].

Arte-

rioscler

Thromb

Vasc

Biol,

2013,

33(7):663-1669.[17]

MASYUK

A

I,

HUANG

B

Q,

RADTKE

B

N,

et

al.

Ciliary

subcellular

localization

of

TGR5

determines

the

cholangio-

cyte functional

response

to

bile

acid

signaling[J].

Am

J

Phys­iol

Gastrointest

Liver

Physiol,

2013,

304(11):G1013-G1024.[18]

MACZEWSKY

J,

KAISER

J,

GRESCH

A,

et

al.

TGR5

activation

promotes

stimulus

-secretion

coupling

of

pan­creatic

茁-cells

via

a PKA-dependent

pathwayJ].

Diabetes,

2019,

68(2):324-336.[19]

ROBERING

J

W,

GEBHARDT

L,

WOLF

K,

et

osphatidic

acid

activates

satellite

glia

cells

and

schwann

cells[J].

Glia,

2019,

67(5):999-1012.[20]

PATHAK

P,

LIU

H,

BOEHME

S,

et

al.

Farnesoid

X

re­ceptor

induces

Takeda

G-protein

receptor

5

cross-talk

to

regulate

bile

acid

synthesis

and

hepatic

metabolism[J].

J

Biol

Chem,

2017,

292(26):11055-11069.[21]

LIU

X,

PENG

S,

ZHAO

Y,

et

al.

AMPK

negatively

regu­lates

peripheral

myelination

via

activation

of

c-Jun[J].

Mol

Neurobiol,

2017,

54(5):3554-3564.[22]

BEIROWSKI

B.

The LKB1-AMPK

and

mTORC1

metabolic

signaling

networks

in

Schwann

cells

control

axon

integrity

and

myelination:

assembling

and

upholding

nerves

by

metabolic

signaling

in

Schwann

cells[J].

Bioessays,

2019,

41(1):e1800075.[23]

ROBERING J

W,

GEBHARDT

L,

WOLF

K,

et

al.

Lysophos­phatidic

acid

activates

satellite

glia

cells

and

Schwann

cells[J].

Glia,

2019,

67(5):999-1012.[24]

TAVARES

M

R, PAVAN

I

C,

AMARAL C

L,

et

al.

TheS6K

protein

family

in

health

and

disease[J].

Life

Sci,

2015,

131:1-10.[25]

FIGLIA

G,

GERBER

D,

SUTER

U.

Myelination

and

mTOR[J].

Glia,

201&

66(4):693-707.[收稿日期]2020-07-13

2024年1月8日发(作者：渠若云)

6・南通大学学报(医学版)Journal

of

Nantong

University

(Medical

Sciences)

2021

:

41

(1)D0I:10.16424/32-1807/r.2021.01.002G蛋白耦联胆汁酸受体激动剂INT777

通过激活AMPK信号通路抑制施万细胞成髓鞘过程*

关晋东：丁杰，刘晓宇，孙诚***(南通大学教育部/江苏省神经再生重点实验室/神经再生协同创新中心，南通226001)［摘

要］目的：研究G蛋白耦联胆汁酸受体(G-protein-coupled

bile

acid

receptor

1,

GPBAR1,同时也被称为TGR5)

特异性激动剂6琢-乙基-23(S)-甲基胆酸［6

alpha-ethyl-23(S)-methylcholic

acid,

INT777［对原代施万细胞髓鞘形成的影响

并初步探讨其可能的作用机制遥方法:用5

滋mol/L的INT777处理二丁酰环腺苷酸(dibutyryl

cyclic

adenoslne

phosphate,

dbcAMP)诱导分化原代施万细胞成髓鞘模型，用免疫印迹(Western

Blot)方法检测髓磷脂蛋白表达量的变化遥同时，提取

施万细胞总核糖核酸后用定量聚合酶链式反应试验检测INT777对髓鞘形成过程相关分子基因表达的影响遥另外，用

Western

Blot方法检测INT777对单磷酸腺苷活化蛋白激酶/核糖体蛋白S6激酶(adenosine

5'-monophosphate-activated

protein

kinase/ribosomal

S6

kinase,

AMPK/S6K)信号途径的影响遥结果:在dbcAMP诱导分化原代施万细胞成髓鞘过程中，

5

滋mol/L

INT777的处理抑制了髓鞘早期生长因子20,八聚体结合转录因子6,髓磷脂蛋白的表达，且5滋mol/L

INT777

处理激活了

AMPK的活性，抑制了雷帕霉素作用靶点信号通路遥结论：INT777抑制dbcAMP诱导的施万细胞成髓鞘过

程，这种抑制作用可能是通过激活施万细胞AMPK活性、抑制S6K活性实现的遥［关键词］施万细胞曰髓鞘曰6琢-乙基-23(S)-甲基胆酸曰单磷酸腺苷活化蛋白激酶［中图分类号］R338.1

［文献标志码］A

［文章编号］1674-7887(2021)01-0006-05G-protein-coupled

bile

acid

receptor

agonists

INT777

inhibits

myelination

of

Schwann

cells

by

activating

AMPK

signaling

pathwayGUAN

Jindong**,

DING

Jie, LIU

Xiaoyu,

SUN

Cheng***

*('Key

Laboratory

of

Neuroregeneration

of

Jiangsu

and

Ministry

ofEducation,

Co-innovation

Center

of

Neuroregeneration,

Nantong

University,

Nantong

226001)［Abstract］

Objective:

To

investigate

the

effects

of

G-protein-coupled

bile

acid

receptor

1(GPBAR1,

also

known

as

TGR5)specific

agonist

6

alpha-ethyl-23(S)-methylcholic

acid(INT777)

on

myelination

in

primary

Schwann

cells

and

the

underlying

mechanisms.

Methods:

Primary

Schwann

cells

were

treated

with

5

滋mol/L

INT777

and

dibutiryl

cyclic

adenoslne

phosphate

(dbcAMP),

and

the

changes

of

myelin

protein

zero

were

detected

by

Western

Blot.

Meanwhile,

the

total

RNA

was

extracted

from

Schwann

cells

and

quantitative

real

time

polymerase

chain

reaction

was

employed

for

detecting

myelin

gene

expression.

In

addition,

the

effect

of

INT777

on

the

adenosine

5'

-monophosphate

-activated

protein

kinase/ribosomal

protein

S6

kinase

(AMPK/S6K)

signaling

pathway

was

examined

by

Western

Blot.

Results:

Treatment

with

5

滋mol/L

INT777

inhibited

the

expression

of

myelin

early

growth

response

-2,

octamer

-binding

transcription

factor

6,

and

myelin

protein

zero

during

dbcAMP-induced

myelination

of

differentiated

Schwann

cells,

and

treatment

with

5

滋mol/L

INT777

activated

AMPK

activity

and

inhibited

mTOR

signaling

pathway.

Conclusion:

INT777

attenuates

dbcAMP-induced

myelination

of

Schwann

cells,

which

may

be

achieved

by

activating

AMPK

and inhibiting

S6K

activity.［Key

words］

Schwann

cell;

myelination;

6

alpha-ethyl-23(S)-methylcholic

acid;

adenosine

5'-monophosphate-activated

protein kinase外周神经系统(peripheral

nervous

system,

PNS)

在机体内分布广泛且起到介导靶器官与中枢神经系

统信号传递的重要作用。轴突的髓鞘化是神经系统

髓鞘形成这一重要任务由施万细胞完成。外周神经

髓鞘形成过程是一个严谨的、由多种转录因子参与

调控的复杂生理过程叫

这些转录因子包括SRY盒

传递神经冲动信号，执行其功能的基础保障,髓鞘化

过程异常会导致多种疾病的发生［1］o外周神经中执行

*

［基金项目］国家自然科学基金青年基金资助项目(81701222)转录因子

10(SRY-box

transcription

factor

10, Sox10)，

八聚体结合转录因子

6(octamer-binding

transcription

**

［作者简介］关晋东，男，汉族，生于1995年10月，山西省晋城市人，硕士在读，研究方向:外周神经发育及损伤修复机制的研究。***

［通信作者］

孙诚，电话**************,E-mail:

********************.cn

关晋东，等.G蛋白耦联胆汁酸受体激动剂INT777通过激活AMPK信号通路抑制施万细胞成髓鞘过程7・factor-6,

Oct6),髓鞘早期生长因子

20(early

growth

response-2,

Krox20)，髓磷脂蛋白(myelin

protein

zero,

MPZ)等。G蛋白耦联胆汁酸受体(G-protein-coupled

bile

acid

receptor

1,

GPBAR1,同时也被称为

TGR5),在

多种组织和器官中有不同水平的表达，功能多样耳

有报道网指出TGR5可通过激活环磷酸腺苷(cyclic

adenosine

monophsphate,

cAMP)-单磷酸腺苷活化蛋

白

激酶(adenosine

5'

-monophosphate

-activated

pro­tein

kinase,

AMPK)信号通路调节恶性肿瘤的发生发

展过程。6a-乙基-23(S)-甲基胆酸［6

alpha-ethyl-23(S)-methylcholic

acid,

INT777］是

TGR5

特异性激动

剂,具有毒性低、效价高等特点。研究冋发现施万细胞

与背根神经节(dorsal

root

ganglia,

DRG)神经兀共培

养模型中，二丁酰环腺苷酸(dibutyryl

cyclic

adenoslne

phosphate,

dbcAMP)的添加能促进细胞分化,加速髓

鞘化进程。本研究旨在通过激动剂INT777处理原代

施万细胞，明确其对外周神经髓鞘化进程的作用,

并初步探讨其作用机制。1材料与方法1.1实验动物

出生1d的SD大鼠红皮30只购

于南通大学实验动物中心。1.2

实验试剂

Forsklin,

HRG(human

Heregulin-1)、

dbcAMP、Trizol、ComC

(Compound

C)均购于

MERCK

公司，DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、胎牛血清均购

于

Gibco

公司，SuperScript

IV/RT-PCR

Kit

Applied

Biosystem

SYBR

Green

Mix

购于

Thermo

Fisher

公

司,SDS-PAGE凝胶购于碧云天生物公司,细胞裂解

液

RIPA,5xSDS-PAGE

电泳缓冲液、5xSDS-PAGE

Loading

buffer、10xTrans

buffer10x三羟甲基氨基甲

烷盐酸盐溶液(Tris

buffered

saline

tween,

TBST)均在

实验室自配。1.3

实验方法1.3.1施万细胞培养施万细胞的分离纯化参考前

人方法，进行稍许改良冋。出生1d的SD红皮鼠,5%

乙醇消毒,置于冰盒上冷冻麻醉。沿着坐骨神经走向

迅速分离,使神经充分暴露,尽快取出坐骨神经剪碎

并放置于预冷的DMEM培养基中,1

000

g离心

5

min,弃上清。随后加入1

mL浓度为3

mg/mL的胶

原酶溶液37益孵育30

min,

1

000

g离心5

min,弃

上清。加入胰蛋白酶溶液37益孵育10

min,弃上清，

加入完全培养基重悬，过400目筛网，并在中皿培养。

过夜后，换含

10

滋mol/L

阿糖胞^(Cytarabine,

Ara-C)

培养

48

ho

随后换含

2

滋mol/L

Forskolin

和

50

ng/mL

HRG的培养基，继续培养细胞。当密度达到接触抑

制时，吸出上清液，用1

mL含Thy1.1抗体的培养基

重悬细胞，冰上孵育1h,1

000

g离心5

min,弃上

清。再用1

mL含补体的培养基37益孵育1

h,离心，

DMEM高糖培养基重悬种于中皿等待后续实验。本

实验严格遵守南通大学动物实验伦理委员会要求,

保障实验动物福利。1.3.2

施万细胞处理

5

滋mol/L的INT777处理施

万细胞，分为4组:对照组(NC)、dbcAMP处理组(终

浓度为

1

mmol/L)、INT777

处理组及

dbcAMP

+

INT777处理组。随后,为了进一步验证可能的作用

机制，将施万细胞分为4组:对照组(NC)、dbcAMP处理

组(终浓度为1

mmol/L)、dbcAMP+INT777处理组及

dbcAMP+INT777

+ComC(终浓度为

10

nmol/L)处理

组。药物处理24

h后收样用于后续研究。1.3.3施万细胞总RNA提取实验过程严格按照

说明书步骤进行。通过Trizol试剂裂解施万细胞，经

氯仿变性及异丙醇沉淀后,最终获得高质量的总

RNAo测定浓度,定量至1滋g后逆转录成cDNA第

1链,4益保存用于后续定量实时聚合酶链式反应试

验(quantitative

real

time

polymerase

chain

reaction,

qPCR)研究。1.3.4施万细胞总蛋白质提取所有的步骤均在冰

上进行。

药物处理后的施万细胞中加入预冷的细胞

裂解液RIPA

250滋L,用一次性细胞刮将细胞刮离，

收集于1.5

mL的离心管中。冰上敷育30

min,期间

不断震荡，4益，12

000

r/min离心20

min后，通过

BCA方法进行蛋白质定量。各组样品蛋白浓度调至

相同水平，加入上样缓冲液，混匀后于100益加热

5

min,冷却至室温用于后续Western

Blot分析。1.3.5细胞免疫荧光细胞种于24孔板中预先放

置的玻片上，处理完毕后弃上清，多聚甲醛固定。磷

酸缓冲盐溶液(phosphate

buffer

saline,

PBS)洗

3

遍后

室温封闭0.5

h,—抗过夜。第2天PBS洗净一抗，二

抗室温孵育2

h,PBS洗3遍后染核。最后在载玻片

上滴加荧光封片剂,将玻片正面盖在载玻片上，蔡司

荧光显微镜拍照分析。1.3.6

qPCR按照Thermo

Fisher公司说明书要求

进行实验，每个样品做3个生物学重复，对结果中的

Cq值，按照2盘。方法进行计算分析。引物序列为：

18S

rRNA

正向引物:5'

-AGCTCCAATAGCGTATAT-

TAAAG-3';负向弓丨物：5'

-CGGTCCTATTCCATTAT-

TCCTA

-3'。Krox20

正向引物：5'

-TGGGTTTAAG-

8・南通大学学报（医学版）2021

:

41(1)TATGGCTGTATA-3';负向弓【物：5'-AGTTAGTGGT-

TCTGTGTTAGA-3'。MPZ

正向引物：5'

-GGATAA

GAAATAGCGGTTAGC-3';负向弓丨物：5'-TTGAGG-

CTGGTTCTACTG

-3'。Oct6

正

向引物：5'

-TTCC

-

TAATTTCTGACCCATCT-3';负

向引物：5'

-GCAAT-

AAAGATACAAAGAGAATGG-3'。1.3.7

Western

Blot预先制备十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶，加样后进行电泳和转膜。室温封闭1

h,

一抗4益过夜。隔天用含有吐温的TBST洗净一抗,

注:A,

DAPI标记施万细胞核;B,

TGR5定位于施万细胞的膜

和胞质中；C,

MERGE,

DAPI与TGR5的合图。图1

TRG5在原代施万细胞中的表达定位■

NCQ

dbcAMP=

INT777MINT777+dbcAMP*****室温孵育二抗1

h,TBST洗净，最后配置显影液显影。

614"*******1.3.8统计学方法采用SPSS

25.0统计学软件进

行数据分析,以軃s表示，两组间比较采用t检验，组

间比较采用one-way

ANOVA检验,P<0.05为差异

1_'12-有统计学意义。2

结

果0Krox20

Od6

MPZ注：*P<0.05,

**P<0.01,

***P<0.001。2.1

TGR5在施万细胞的定位通过细胞免疫荧光技术观察TGR5在施万细胞中的表达情况，结果显示

图2INT777抑制dbcAMP诱导施万细胞成髓鞘模型中髓鞘相关基因的表达TGR5表达于施万细胞的膜与细胞质中（图1）。因此,

施万细胞体外添加激动剂INT777可有效激活TGR5。过Western印迹技术探究INT777抑制髓鞘基因表

达的可能机制，其中dbcAMP可有效诱导体外施万

2.2

INT777抑制髓鞘相关因子的表达

qPCR技术

检测INT777与dbcAMP诱导分化施万细胞成髓鞘

之间的关系。结果显示,5

滋mol/L的INT777处理可

显著抑制髓鞘相关基因如6及MPZ的

表达（图

2）。细胞髓鞘的分化形成，因而通常用作阳性对照组。实

验结果显示INT777促进了

p-AMPK的表达，抑制

p-ERK与p-S6K的活性（图3）,因此，推测INT777

可能是通过激活AMPK进而抑制S6K活性来抑制

施万细胞的成髓鞘过程。2.3

INT777激活施万细胞p-AMPK信号通路

通AdbcAMP

-

INT777

-

+

-

B-

+

++p-S6K/0-actinz55

■z

'L50

L'55

0

0p-AMPK/AMPKp-ERK/ERKMPZ/0-actinp-S6K

［「-----—p-AMPK

|

一

一

•-—INT777

-

-

+

+

dbcAMP

-

+

-

+注:A,Western

Blot

结果;B,A

图的统计结果。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

o

图3

INT777影响dbcAMP诱导施万细胞成髓鞘模型中AMPK/S6K信号通路2.4

ComC促进施万细胞髓鞘的形成

ComC是

AMPK特异性的抑制剂,之前的实验结果显示INT777

通过激活施万细胞AMPK活性抑制了髓鞘相关基

3

讨

论PNS中的外周神经纤维是传输神经冲动的主要

载体,而外周神经纤维主要由轴突、髓鞘和结缔组织

因的表达,为进一步证实这个猜想,随后在细胞内加

入10

nmol/L

ComC来抑制AMPK活性，qPCR及

构成的神经内膜组成，

其中影响神经冲动传导的关

键是髓鞘叫髓鞘主要是由施万细胞以1：1模式包裹

Western

Blot结果显示相对于INT777处理组而言，

ComC与INT777双处理后逆转了

INT777对髓鞘基

因表达的抑制效果（图4）。直径>1滋m的轴突而形成的阻施万细胞不仅在维持

外周神经稳态和髓鞘发育过程中发挥重要作用，且

关晋东，等.G蛋白耦联胆汁酸受体激动剂INT777通过激活AMPK信号通路抑制施万细胞成髓鞘过程9・A

・NC

5

4

3

2

1

0口

dbcAMPB

ComC

dbcAMP

INT777

口INT777+dbcAMP

酬

INT777+dbcAMP+ComC**_*

-

-

-

-

+

-

-

+

+

+++^首戈之电Krox20

Octo

MPZp-AMPK/AMPKp-S6K/0-actin

2.5-■

2.0p-ERK/ERK!I***

|

****

匕

U***

MPZ/p-actin**

*

**

***11.0

0

”|

<■--------~1

~I--------1■

r-----~~""I1.51.00.50.0INT777

-

-

+

+

-++0.0++++++++dbcAMP

-

+

+

++++++ComC

-

-

-

+注:A,qPCR结果;B,

Western

Blot

结果;C,B

图的统计结果。**P<0.01,***P<0.001图4ComC挽救INT777对施万细胞髓鞘相关基因表达的抑制作用能修复损伤的髓鞘[9]o外周神经髓鞘形成过程分为预髓鞘阶段和成熟

髓鞘阶段,是一个严谨的、由多种转录因子参与调控

果显示在施万细胞中5

滋mol/L

INT777的处理激活

了

AMPK,推测这一现象可能与INT777浓度有关。

INT777

Deoxycholic

acid、TGR5

Receptor

Agonist

等

都是TGR5的激活剂，其中INT777因其特异性佳,

的复杂生理过程。研究问表明，转录因子Sox10与

Oct6主要存在于预髓鞘阶段,Sox10是施万细胞形

成髓鞘并维持其稳定所必需的，且能激活Oct6,从

而启动施万细胞进入预髓鞘化阶段。Sox10与Oct6

协同作用可诱导转录因子Krox20的表达，从而促使

效果好,毒性小而常被研究者使用。研究凹指出,溶

血磷脂酸LPA通过刺激施万细胞等胶质细胞来调

节氯喹和TGR5激动剂INT777引起的神经元反

应，如瘙痒、疼痛等症状。有研究㈣报道指出脂肪细

胞及肝脏细胞经INT777处理显著地提高了胞内

预髓鞘阶段向髓鞘化阶段转变。Krox20因子一方面

可激活大量髓鞘化基因如MPZ及髓磷脂碱性蛋白

cAMP的表达，提高了细胞能量代谢效率,而INT777

在dbcAMP诱导的原代施万细胞成髓鞘模型中是否

也发挥着同样的作用及具体的作用机制有待进一步

研究。(myelin

basic

protein,

MBP)的表达，另一方面可抑制

去髓鞘化基因(Sox2、c-Jun)的表达,通过这两方面的

作用，促进稳定成熟的髓鞘套的形成问。虽然对外周

神经髓鞘形成过程的研究很多，但具体的作用机制

众所周知,AMPK的活化可以延缓合成代谢反

应,降低能量消耗,已有报道01指出AMPK可以负向

调控外周神经髓鞘的发育。

施万细胞中

LKB1-AMPK

并不十分清楚。TGR5属于GPCR家庭成员，可以调节能量平衡

和糖代谢过程，促进胰岛素的分泌和生物合成[12],

参与多种肿瘤的发生发展过程[13],可激活炎症因子

而产生抗炎、利胆作用[14],也可减轻肝脏炎症，抑制

和mTOR信号网络调节轴突完整性和髓鞘的形

成㈣。本研究中,INT777的处理抑制了髓鞘相关因

子Krox20、Oct6及MPZ的表达，且促进了

p-AMPK

动脉粥样硬化斑块形成问。TGR5作为膜受体，可与

相应配体结合内化到细胞质中，在核因子-kB、蛋白

的表达,这与前人㈣报道一致。mTOR信号通路是调

控外周神经髓鞘发育的经典的信号途径,而p-S6K

是非常关键的调控因子㈣。髓鞘形成是一种代谢性

生理过程,mT0R信号通路作为一种协调细胞代谢

激酶B(protein

kinase

B,

PKB)和细胞外信号调节激

酶(extracellular

regulated

protein

kinase,

ERK)等信号

通路中发挥重要作用皿叫该受体经典的下游靶标是

的信号中枢，被认为是髓鞘形成的关键信号㈤。本研

究显示INT777的处理提高了

p-AMPK的表达，抑

cAMP(由乙酰辅酶A催化ATP后形成)，可直接提高

体内PKA活性，抑制AMPK活性两。但是,本研究结

制了

p-S6K的活性，表明该药物对外周神经髓鞘的

-10・南通大学学报（医学版）2021

:

41(1)影响可能是通过激活AMPK,抑制S6K活性来发挥

作用的。为进一步验证这一猜想,在INT777处理的

施万细胞中又同时添加了

AMPK的抑制剂ComC,

通过Western

Blot等证实ComC的添加逆转了

INT777对髓鞘发育过程的抑制现象。表明INT777

可能通过AMPK信号通路发挥其对髓鞘化过程的

影响。总之,INT777可抑制dbcAMP诱导的施万细胞

髓鞘化过程，并且是通过激活

AMPK

活性，抑制

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