2024年2月16日发(作者：胥彭湃)
V1.0，20170915
Bio-Rad QX200微滴式数字PCR
实验操作指南
地区：中国
版本：1.0
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V1.0，20170915
QX200实验流程简介
样本核酸提取
2 / 19
制备微滴
PCR
扩增
检测微滴
数据分析
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目 录
流程简介 .................................................................................................. 错误!未定义书签。
第一章 实验耗材清单 ............................................................................... 错误!未定义书签。
第二章 QX200实验流程 .......................................................................... 错误!未定义书签。
第三章 QX200软件操作 .................................................................................................... 10
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第一章 实验耗材信息
1. 耗材列表：
a) DG8 Catridges（货号：1864008）
b) DG8 Gaskets（货号：1863009）
c) Droplet Generator oil for probes （货号：1863005）
d) ddPCR Droplet Reader oil（货号：1863004）
e) ddPCR Supermix for probes （货号：1863026）
f) Pierceable Foil Heat Seal（货号：1814040）
g) PCR Plate 96,semi-skirted（货号：12001925）
h) 8连管
i) 1.5ml Tubes
j) 96-well plate holder
k) Eppendorf tube rack
l) Rainning multiple-channel Pipettes&tips (50ul,100ul)
m) pipettor and tips - 10ul
n) pipettor and tips - 100ul
o) pipettor and tips - 200ul
p) Generator oil 储液槽
q) 无酶水
2. 设备列表：
r) Droplet generator （货号：1864002）
s) Dropler reader（货号：1864003）
t) PX1 PCR plate sealer（货号：1814000）
u) Thermal cycler(T100 货号：1861096 OR C1000 Touch 货号：1851196)
v) 小型离心机(1.5ml tube and 8连管适配器)
w) 漩涡震荡仪
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第二章 QX200实验流程
一、标本的提取
1. 组织样本DNA的提取
组织样本DNA的提取使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit，详细方法参照试剂盒说明书
2. 血浆样本的ctDNA提取
cfDNA的提取使用 QIAamp DNA blood mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)，采用Spin
Procedure方案。详细方法参照试剂盒说明书
二、QX200实验
Bio-Rad QX200™ Droplet™ Digital PCR系统工作流程如下图，包括ddPCR反应液配制、微滴制备、PCR扩增、微滴读取、数据分析，显示结果6个步骤
1. 先打开QX200 Droplet Reader后面电源，预热至少30分钟后打开电脑和QuantaSoft软件；
2. 配制ddPCR 反应液
A. 配制20ul探针法定量反应体系，选用适宜的探针法预混液（注：RNA作为模板时选择One-Step RT-ddPCR Kit for Probes），推荐终浓度900nM Primer+250nM Probe，振荡混匀，离心除气泡，注意20ul体系中所加样本核酸含量不要超过规定检测范围(1~100000拷贝片段化核酸或者1~20000拷贝完整基因组DNA)，如完整的人类基因组DNA不要超过66ng/20ul，可提前用限制性内切酶处理样本可提高检测浓度。另外，用质粒作为模板时建议酶切以消除复杂结构，做CNV实验时必须对DNA模板进行高频酶切；
B. 配制20ul染料法定量反应体系，选用QX200 ddPCR EvaGreen Supermix，推荐终浓度100nM Primer，单孔模板检测范围为1~30000拷贝片段化核酸或者1~20000拷贝完整基因组DNA，其他同上。
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Reaction Components
Component Volume Per Reaction (µl)
10
variable(探针法推荐引物终浓度900nM，探针终浓度250nM；染料法推荐引物终浓度100nM)
2 × ddPCR
Supermix for Probes (no dUTP)/
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix
primers/probe
H2O
DNA Sample
variable
variable
Final Volume 20 μl
3. 将一个新的DG8 cartridge放入holder中，注意缺口方向；
4. 将20ul样品反应体系加入到DG8 cartridge中间一排的8个孔内，不足8个样品时用稀释一倍的20ul 1×buffer control补足（探针法和染料法用不同的buffer control），建议使用Rainin的8通道20ul排枪和20ul枪头（不能用200ul枪头），加样时枪头接近孔一侧底部，与侧壁呈大约15°角，缓慢打出液体，打出一部分后慢慢提升枪头位置再打出余下液体，不要将枪按至超过第一档位置以免引入气泡；
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5. 在DG8 cartridge最底下一排8个孔中各加入70ul微滴生成油（DG Oil，探针法与染料法用不同的生成油），同样不能有空着的孔；
6. 盖上胶垫（gasket），注意两边的小孔都要钩牢；
7. 将以上holder轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴，注意仪器上指示灯状态，一般约2分钟完成；
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8. 微滴生成于cartridge最上面一排孔内，建议使用Rainin的8通道P-50排枪和200ul枪头小心缓慢吸取，调整吸取体积为40ul，将holder放平，枪头以与孔壁呈30~45°角放入，轻触孔底，约5秒吸取40ul，再同样缓慢地打入96孔板相应位置孔内（约5秒），枪头贴近孔壁接近孔底，注意封上盖以防油挥发，每次弃去已使用过的cartridge和胶垫；
9. 转移油滴进入96孔板内完成后，将膜有红线标记的一面（反光亮面）朝上置于96孔板上并固定好，用预热好的PX1热封仪对其进行封膜，推荐的运行程序为：180℃，5s，需确认各样品孔是否密封好，一般情况下无需颠倒方向进行二次封膜；
10. 封好膜之后应该在30分钟内进行PCR反应，或者放于4℃冰箱4小时之内进行PCR，可在任意一台96孔PCR仪上完成，注意升降温速度≤2.5℃/s。
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A．探针法推荐反应条件：
热循环步骤
酶热启动
变性
退火延伸
酶灭活
保温
B．染料法推荐反应条件：
热循环步骤
酶热启动
变性
退火延伸
酶灭活
保温
温度℃
95
95
Variable（根据引物Tm）
90
4
注：PCR仪热盖温度设为105℃，反应体积设为40微升温度℃
95
94
60
98
4
时间
10min
30 sec
1 min
10 min
infinite
变温速率
~2℃/sec
~2℃/sec
~2℃/sec
~2℃/sec
~2℃/sec
循环数
1
40
1
1
时间
5min
30 sec
1 min
2min
infinite
变温速率
~2℃/sec
~2℃/sec
~2℃/sec
~2℃/sec
~2℃/sec
循环数
1
40
1
1
11. 查看微滴读取仪上状态指示灯指示是否正常(以英文说明书上为准)；
12. 将之前完成PCR的96孔板放入plate holder中组装好，注意板斜角方位，如下图所示：
13. 组装好之后轻轻地平稳放入微滴读取仪中，如图：
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注意： 建议每次实验之前做一次Flush System，若一周以上未使用建议先做一次Prime再做Flush System。
第三章 QX200软件操作
打开QuantaSoft软件之后对96孔板中样品信息进行Setup，主要是提供实验名称、实验类型（ABS、CNV、RED）、assay以及探针信息等，完成后即可进行Run，结束后结果会被自动Analyze，人工核实修正后保存结果，即完成了一次QX200实验。QuantaSoft软件提供了进行微滴式数字PCR三个步骤的导航键，导航键在窗口的左侧，总控实验的所有过程。
Setup - 输入样品信息、方法与实验
Run - 开始运行并控制仪器
Analyze - 计算分析核酸浓度
QuantaSoft可打开以下文件类型：
Template（*.qlt）- 用户定义96孔板的输出文件（不含数据）
Raw data（*.qlb）- ddPCR孔板上每个孔的未处理原始数据
Rsults（*.qlp）- 包含用户定义的96孔板和其中经过处理的数据
Comma-separated values（*.csv） - 在一个Excel能打开的表格内输出分析后的数据
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3.1 设置
文件名
储存或读取之前的实验设定和数据
新建、储存或读取模板（仅包括设定）
数据高级分析和设定的选项
打开实验编辑器
实验设定
开始运行
仪器维护选项（只有连接上微滴读取仪才分析数据
停止运行或离开程序
会出现，实验进行前可运行）
孔板图
QuantaSoft软件的设定界面. 孔板图是显示96孔板每孔设定信息、实验方式和分析方式的图表。实验运行之后，它还会显示每孔的浓度信息。
1）点击Setup开始键入样品信息、实验方法和分析方法。
○打开另一次试验的储存文件（设置和数据）：
点击Plate〉Load并选择文件
○打开储存的实验模板（仅有设置，没有实验数据）：
点击Template〉Load并选择文件
○创建一个新的模板：点击Template〉New
点击Template〉Load后，在模板读取窗口中选择Overwrite可以覆盖已经打开的孔板的设定信息（实验类型、方法、样品信息等等）。
2）输入文件名，然后开始使用孔板编辑器和实验编辑器来调整你实验的设置。点击Options来进入数据分析和设定的高级选项。
3.1.1 使用孔板编辑器
使用孔板编辑器来设置孔板（样品、实验方式、检测方式），样品和实验方式。样品 11 / 19
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和实验方式都有指定颜色编码而且可以为了在孔板内更容易辨别而自定义颜色。
Reset – 还原为初始设置
Apply – 应用设置且不推出编辑器界面
Cancel – 不保存改动直接关闭编辑器
OK – 保存设置并退出孔板编辑器
孔板编辑器（可以选择对一个样品同时进行FAM和VIC/HAX两种荧光通道的绝对定量检测）
Unused – 不使用该荧光通道
Unknow – 将该通道信号设定为未知样品
Reference – 将该通道信号设定为内参（CNV、RED或比率计算都需要内参）
Positive – 阳性对照
Negative – 阴性对照
Blank – 不分析该孔
NTC –
无模板对照
方法选项
1) 在孔板图上双击你需要编辑孔打开孔板编辑器。选择的孔以灰色高亮表示，孔板编辑器会出现在界面上部。
。按住键盘上的Ctrl键点击多个孔就可以选中多个孔编辑。
。按住键盘上的Shift键点击第一个和最后一个孔可以选中中间的一系列孔。
。双击孔板图左上角可以对孔板内的所有孔全选。
。双击行上的数字或者列上的字母可以选中一整行或者一整列。
2) 在样品面板中，输入样品名Name并在Experiment下拉列表里选择实验方式。所有预存的实验方式都会出现在下拉列表里，下拉表底部还有一个选项Add Experiment可以使用实验编辑器新建或编辑一种实验方法。
3) 在Supermix下拉列表中选择所用的试剂盒（必须选择，选择后一旦运行实验就无法改变）。
4) 定义Target 1（第一通道，FAM荧光检测通道）和Target 2（第二通道，VIC/HEX荧光检测通道），给每个检测通道定义一个目标名称Name和类型Type。
你输入的样品信息和实验方法会显示在右上方的Applied Well Settings方格中。如果你完成了设置，点击Apply或者OK来储存信息。储存后设置信息会在孔板图的样品方格中显示。
小贴士：
你可以在不推出孔板编辑器的情况下在孔板图中换选其他孔。
点击Name边上的Auto Inc框，可以对选择孔附加上样品或者基因名称的序号叠加。
使用windows快捷键可以复制、剪切、黏贴、删除所选择孔的信息。（复制按Ctrl+c， 12 / 19
剪切按Ctrl+x，撤销按Ctrl+z，黏贴按Ctrl+v，删除按Delete，等等）
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3.1.2 使用实验编辑器
使用实验编辑器可以编辑实验类型。进入孔板编辑器或者点击Experiment窗口下的New或者Edit（双击一个实验名称）在Experiment下拉列表里选择Add experiment打开实验编辑器。有三种实验类型：绝对定量（ABS）、稀有事件监测（RED）、拷贝数变异检测（CNV）。软件本身就包含了一个预存实验的列表，但你可以新建并储存自定义的实验方式。软件即使升级的话也会保留你储存过的现有实验方式。
你输入的设置的简要信息会Applied Well Settings方格中显示。当你完成后，点击Apply或者OK就可以保存实验信息。储存后设置信息会在孔板图的样品方格中显示。
如果多个孔的样品名称、实验方法、检测目标名称和检测类型都一致的话，软件会定义这些孔可以合并，你可以在分析数据的时候合并分析（merged）这些孔的数据。
拷贝数选项（只有CNV实验才会有）
定义实验的颜色编码
实验编辑器. 显示的是CNV实验的选项
3.1.3 使用高级设置
在设置界面中点击Options可以看到所有有关数据收集和分析的高级设置选项。
隐藏高级选项
用高版本软件处理数据
输出所选孔的荧光增量数据到一个csv文件
根据行（选中）或列（不选）来选择孔
设定阈值线颜色
高级设置选项.
3.2 运行
1) 点击左侧导航栏里的Run可按照设定好的实验方案运行仪器。
2) 运行开始后会弹出运行选项窗口，可以选择检测的发光基团或染色剂，也可以选择。
。如果在孔板编辑器里选择了探针法试剂盒的话，就会出现探针发光基团选择：FAM和HEX，或者FAM和VIC。
。如果在孔板编辑器里选择了燃料法试剂盒的话，就会出现EvaGreen染料设置。
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运行选项.
3) 最多一分钟以后，导航栏上的停止按钮边上会出现一个绿色圆形图案，并且通过间歇性闪烁来表示机器正在运行。正在检测的和已经检测过的空会在孔板图中以绿色高亮显示。
4) 每个孔检测分析完以后，数据会在顶部导航区域中显示。当检测完成以后所有数据会被重新分析一遍，得到最后的数据结果。
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按微滴数排列的通道1（FAM）荧光增量
按微滴数排列的通道2（VIC/HEX）荧光增量
按通道2荧光增量排列的微滴数
切换数据显示模式（大图或者列表）
已分析孔
运行指示
孔内数据串
按通道1荧光增量排列的微滴数
样品名
实验名
通道1浓度读数
开始运行后的软件界面
通道2浓度读数
3.3 数据分析
在软件“Setup”窗口的 “plate”框内选择“load”（文件名后缀为.qlp的文件），然后点击“Analyze”打开并分析数据。数据分析界面分为三个窗口：
结果列表
— Results table：显示所选反应孔的全部结果
— Well selector：允许选择用来分析的孔
— Processed data/graphical display：显示所选孔的图形数据
复制图像按钮及打印图像按钮
数据分析界面. 显示中的数据为一次CNV实验的结果
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Y轴显示选项
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状态显示：
OK – 自动分析成功
CHECK – 自动分析未成功；需使用手动分析工具得到浓度
Multi – 多孔同时数据自动分析的结果
Manual – 手动分析数据结果
在图表显示窗里观察表格
输出数据到CSV文
按荧光检测通道来选择数据
选择数据是否合并分析（需要多个孔的样品名称、实验方法、检测目标名称和检测类型都一致）
选择列表数据中不同通道的数据是顺序排列还是间隔排列
3.3.1查看各个通道数据（一维图）
点击“1D Amplitude”查看每个通道下所选反应孔的数据。使用通道选择按钮可选择需显示的通道。在这个界面下可以对每个通道进行阈值线的调节以指定阳性和阴性微滴。
在查看单个孔时，可使用以下方式改变阈值线：
▪ 使用单孔阈值线工具。指定的阈值线呈现水平粉色直线。
或者
▪ 在“Set Threshold”框内键入阈值。
在查看多个孔时，按照以下方式改变阈值：
▪ 使用单孔阈值线工具改变每个单孔的阈值。数据点图中垂直方向的黄色直线将每个孔的微滴图分开。而指定的阈值线是水平粉色直线。
▪
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使用多孔阈值线工具改变所有孔的阈值（阈值线是水平粉色直线）。
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▪ 为单孔或多孔手工设置阈值，在点图下方的“Set Threshold”框内键入阈值并点击“Set Threshold”或直接回车确定。
点击“Auto Analyze”转换为自动阈值设定和计算模式。也可在二维图中调节阈值（见2）。
3.3.2查看聚类图 （2维荧光增量）
点击“2D Amplitude”查看通道1和通道2聚类图。此图允许手工或自动调节阈值用以对每个检测通道进行阳性和阴性微滴指定。
▪ 点击“Auto Analyze”重设阈值
▪ 手工指定阈值：
— 使用阈值十字线指定整个点图的分类区域（仅在热图模式下可选）
— 使用椭圆，矩形或套索阈值调节工具来分类点图区域：点击相应工具按钮，然后在“Working cluster selector”点击区域类型，使用工具选择相应区域。
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3.3.3 查看浓度数据
在反应板图中每个目标基因的浓度数据会显示在反应孔中并会在结果列表中列出。点击“Concentration”在浓度图中可以看到浓度数据。使用通道选择按钮选择要显示的通道。误差线反映总误差或95%泊松置信度。这些数据可以导出到其他应用程序中分析（例如，Excel）。
3.3.4 查看拷贝数数据
点击“Copy Number”查看所选反应孔/样品的拷贝数。
3.3.5 查看比例数据
点击“Ratio”查看所选反应孔/样品的比例数据。使用选择键选择显示比例（位置样:内参）或分数含量（%，样品百分比）；选择“Inverse”显示反向比例。
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3.3.6 查看微滴个数
点击“Events”查看所选反应孔/样品中数出的微滴数目。使用选择键选择要显示的通道。查看阳性、阴性或总微滴数，或以上选项的任意组合。
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制备微滴
PCR
扩增
检测微滴
数据分析
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流程简介 .................................................................................................. 错误!未定义书签。
第一章 实验耗材清单 ............................................................................... 错误!未定义书签。
第二章 QX200实验流程 .......................................................................... 错误!未定义书签。
第三章 QX200软件操作 .................................................................................................... 10
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第一章 实验耗材信息
1. 耗材列表：
a) DG8 Catridges（货号：1864008）
b) DG8 Gaskets（货号：1863009）
c) Droplet Generator oil for probes （货号：1863005）
d) ddPCR Droplet Reader oil（货号：1863004）
e) ddPCR Supermix for probes （货号：1863026）
f) Pierceable Foil Heat Seal（货号：1814040）
g) PCR Plate 96,semi-skirted（货号：12001925）
h) 8连管
i) 1.5ml Tubes
j) 96-well plate holder
k) Eppendorf tube rack
l) Rainning multiple-channel Pipettes&tips (50ul,100ul)
m) pipettor and tips - 10ul
n) pipettor and tips - 100ul
o) pipettor and tips - 200ul
p) Generator oil 储液槽
q) 无酶水
2. 设备列表：
r) Droplet generator （货号：1864002）
s) Dropler reader（货号：1864003）
t) PX1 PCR plate sealer（货号：1814000）
u) Thermal cycler(T100 货号：1861096 OR C1000 Touch 货号：1851196)
v) 小型离心机(1.5ml tube and 8连管适配器)
w) 漩涡震荡仪
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第二章 QX200实验流程
一、标本的提取
1. 组织样本DNA的提取
组织样本DNA的提取使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit，详细方法参照试剂盒说明书
2. 血浆样本的ctDNA提取
cfDNA的提取使用 QIAamp DNA blood mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)，采用Spin
Procedure方案。详细方法参照试剂盒说明书
二、QX200实验
Bio-Rad QX200™ Droplet™ Digital PCR系统工作流程如下图，包括ddPCR反应液配制、微滴制备、PCR扩增、微滴读取、数据分析，显示结果6个步骤
1. 先打开QX200 Droplet Reader后面电源，预热至少30分钟后打开电脑和QuantaSoft软件；
2. 配制ddPCR 反应液
A. 配制20ul探针法定量反应体系，选用适宜的探针法预混液（注：RNA作为模板时选择One-Step RT-ddPCR Kit for Probes），推荐终浓度900nM Primer+250nM Probe，振荡混匀，离心除气泡，注意20ul体系中所加样本核酸含量不要超过规定检测范围(1~100000拷贝片段化核酸或者1~20000拷贝完整基因组DNA)，如完整的人类基因组DNA不要超过66ng/20ul，可提前用限制性内切酶处理样本可提高检测浓度。另外，用质粒作为模板时建议酶切以消除复杂结构，做CNV实验时必须对DNA模板进行高频酶切；
B. 配制20ul染料法定量反应体系，选用QX200 ddPCR EvaGreen Supermix，推荐终浓度100nM Primer，单孔模板检测范围为1~30000拷贝片段化核酸或者1~20000拷贝完整基因组DNA，其他同上。
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Reaction Components
Component Volume Per Reaction (µl)
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variable(探针法推荐引物终浓度900nM，探针终浓度250nM；染料法推荐引物终浓度100nM)
2 × ddPCR
Supermix for Probes (no dUTP)/
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix
primers/probe
H2O
DNA Sample
variable
variable
Final Volume 20 μl
3. 将一个新的DG8 cartridge放入holder中，注意缺口方向；
4. 将20ul样品反应体系加入到DG8 cartridge中间一排的8个孔内，不足8个样品时用稀释一倍的20ul 1×buffer control补足（探针法和染料法用不同的buffer control），建议使用Rainin的8通道20ul排枪和20ul枪头（不能用200ul枪头），加样时枪头接近孔一侧底部，与侧壁呈大约15°角，缓慢打出液体，打出一部分后慢慢提升枪头位置再打出余下液体，不要将枪按至超过第一档位置以免引入气泡；
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5. 在DG8 cartridge最底下一排8个孔中各加入70ul微滴生成油（DG Oil，探针法与染料法用不同的生成油），同样不能有空着的孔；
6. 盖上胶垫（gasket），注意两边的小孔都要钩牢；
7. 将以上holder轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴，注意仪器上指示灯状态，一般约2分钟完成；
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8. 微滴生成于cartridge最上面一排孔内，建议使用Rainin的8通道P-50排枪和200ul枪头小心缓慢吸取，调整吸取体积为40ul，将holder放平，枪头以与孔壁呈30~45°角放入，轻触孔底，约5秒吸取40ul，再同样缓慢地打入96孔板相应位置孔内（约5秒），枪头贴近孔壁接近孔底，注意封上盖以防油挥发，每次弃去已使用过的cartridge和胶垫；
9. 转移油滴进入96孔板内完成后，将膜有红线标记的一面（反光亮面）朝上置于96孔板上并固定好，用预热好的PX1热封仪对其进行封膜，推荐的运行程序为：180℃，5s，需确认各样品孔是否密封好，一般情况下无需颠倒方向进行二次封膜；
10. 封好膜之后应该在30分钟内进行PCR反应，或者放于4℃冰箱4小时之内进行PCR，可在任意一台96孔PCR仪上完成，注意升降温速度≤2.5℃/s。
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A．探针法推荐反应条件：
热循环步骤
酶热启动
变性
退火延伸
酶灭活
保温
B．染料法推荐反应条件：
热循环步骤
酶热启动
变性
退火延伸
酶灭活
保温
温度℃
95
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Variable（根据引物Tm）
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注：PCR仪热盖温度设为105℃，反应体积设为40微升温度℃
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时间
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~2℃/sec
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循环数
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11. 查看微滴读取仪上状态指示灯指示是否正常(以英文说明书上为准)；
12. 将之前完成PCR的96孔板放入plate holder中组装好，注意板斜角方位，如下图所示：
13. 组装好之后轻轻地平稳放入微滴读取仪中，如图：
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注意： 建议每次实验之前做一次Flush System，若一周以上未使用建议先做一次Prime再做Flush System。
第三章 QX200软件操作
打开QuantaSoft软件之后对96孔板中样品信息进行Setup，主要是提供实验名称、实验类型（ABS、CNV、RED）、assay以及探针信息等，完成后即可进行Run，结束后结果会被自动Analyze，人工核实修正后保存结果，即完成了一次QX200实验。QuantaSoft软件提供了进行微滴式数字PCR三个步骤的导航键，导航键在窗口的左侧，总控实验的所有过程。
Setup - 输入样品信息、方法与实验
Run - 开始运行并控制仪器
Analyze - 计算分析核酸浓度
QuantaSoft可打开以下文件类型：
Template（*.qlt）- 用户定义96孔板的输出文件（不含数据）
Raw data（*.qlb）- ddPCR孔板上每个孔的未处理原始数据
Rsults（*.qlp）- 包含用户定义的96孔板和其中经过处理的数据
Comma-separated values（*.csv） - 在一个Excel能打开的表格内输出分析后的数据
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3.1 设置
文件名
储存或读取之前的实验设定和数据
新建、储存或读取模板（仅包括设定）
数据高级分析和设定的选项
打开实验编辑器
实验设定
开始运行
仪器维护选项（只有连接上微滴读取仪才分析数据
停止运行或离开程序
会出现，实验进行前可运行）
孔板图
QuantaSoft软件的设定界面. 孔板图是显示96孔板每孔设定信息、实验方式和分析方式的图表。实验运行之后，它还会显示每孔的浓度信息。
1）点击Setup开始键入样品信息、实验方法和分析方法。
○打开另一次试验的储存文件（设置和数据）：
点击Plate〉Load并选择文件
○打开储存的实验模板（仅有设置，没有实验数据）：
点击Template〉Load并选择文件
○创建一个新的模板：点击Template〉New
点击Template〉Load后，在模板读取窗口中选择Overwrite可以覆盖已经打开的孔板的设定信息（实验类型、方法、样品信息等等）。
2）输入文件名，然后开始使用孔板编辑器和实验编辑器来调整你实验的设置。点击Options来进入数据分析和设定的高级选项。
3.1.1 使用孔板编辑器
使用孔板编辑器来设置孔板（样品、实验方式、检测方式），样品和实验方式。样品 11 / 19
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和实验方式都有指定颜色编码而且可以为了在孔板内更容易辨别而自定义颜色。
Reset – 还原为初始设置
Apply – 应用设置且不推出编辑器界面
Cancel – 不保存改动直接关闭编辑器
OK – 保存设置并退出孔板编辑器
孔板编辑器（可以选择对一个样品同时进行FAM和VIC/HAX两种荧光通道的绝对定量检测）
Unused – 不使用该荧光通道
Unknow – 将该通道信号设定为未知样品
Reference – 将该通道信号设定为内参（CNV、RED或比率计算都需要内参）
Positive – 阳性对照
Negative – 阴性对照
Blank – 不分析该孔
NTC –
无模板对照
方法选项
1) 在孔板图上双击你需要编辑孔打开孔板编辑器。选择的孔以灰色高亮表示，孔板编辑器会出现在界面上部。
。按住键盘上的Ctrl键点击多个孔就可以选中多个孔编辑。
。按住键盘上的Shift键点击第一个和最后一个孔可以选中中间的一系列孔。
。双击孔板图左上角可以对孔板内的所有孔全选。
。双击行上的数字或者列上的字母可以选中一整行或者一整列。
2) 在样品面板中，输入样品名Name并在Experiment下拉列表里选择实验方式。所有预存的实验方式都会出现在下拉列表里，下拉表底部还有一个选项Add Experiment可以使用实验编辑器新建或编辑一种实验方法。
3) 在Supermix下拉列表中选择所用的试剂盒（必须选择，选择后一旦运行实验就无法改变）。
4) 定义Target 1（第一通道，FAM荧光检测通道）和Target 2（第二通道，VIC/HEX荧光检测通道），给每个检测通道定义一个目标名称Name和类型Type。
你输入的样品信息和实验方法会显示在右上方的Applied Well Settings方格中。如果你完成了设置，点击Apply或者OK来储存信息。储存后设置信息会在孔板图的样品方格中显示。
小贴士：
你可以在不推出孔板编辑器的情况下在孔板图中换选其他孔。
点击Name边上的Auto Inc框，可以对选择孔附加上样品或者基因名称的序号叠加。
使用windows快捷键可以复制、剪切、黏贴、删除所选择孔的信息。（复制按Ctrl+c， 12 / 19
剪切按Ctrl+x，撤销按Ctrl+z，黏贴按Ctrl+v，删除按Delete，等等）
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3.1.2 使用实验编辑器
使用实验编辑器可以编辑实验类型。进入孔板编辑器或者点击Experiment窗口下的New或者Edit（双击一个实验名称）在Experiment下拉列表里选择Add experiment打开实验编辑器。有三种实验类型：绝对定量（ABS）、稀有事件监测（RED）、拷贝数变异检测（CNV）。软件本身就包含了一个预存实验的列表，但你可以新建并储存自定义的实验方式。软件即使升级的话也会保留你储存过的现有实验方式。
你输入的设置的简要信息会Applied Well Settings方格中显示。当你完成后，点击Apply或者OK就可以保存实验信息。储存后设置信息会在孔板图的样品方格中显示。
如果多个孔的样品名称、实验方法、检测目标名称和检测类型都一致的话，软件会定义这些孔可以合并，你可以在分析数据的时候合并分析（merged）这些孔的数据。
拷贝数选项（只有CNV实验才会有）
定义实验的颜色编码
实验编辑器. 显示的是CNV实验的选项
3.1.3 使用高级设置
在设置界面中点击Options可以看到所有有关数据收集和分析的高级设置选项。
隐藏高级选项
用高版本软件处理数据
输出所选孔的荧光增量数据到一个csv文件
根据行（选中）或列（不选）来选择孔
设定阈值线颜色
高级设置选项.
3.2 运行
1) 点击左侧导航栏里的Run可按照设定好的实验方案运行仪器。
2) 运行开始后会弹出运行选项窗口，可以选择检测的发光基团或染色剂，也可以选择。
。如果在孔板编辑器里选择了探针法试剂盒的话，就会出现探针发光基团选择：FAM和HEX，或者FAM和VIC。
。如果在孔板编辑器里选择了燃料法试剂盒的话，就会出现EvaGreen染料设置。
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运行选项.
3) 最多一分钟以后，导航栏上的停止按钮边上会出现一个绿色圆形图案，并且通过间歇性闪烁来表示机器正在运行。正在检测的和已经检测过的空会在孔板图中以绿色高亮显示。
4) 每个孔检测分析完以后，数据会在顶部导航区域中显示。当检测完成以后所有数据会被重新分析一遍，得到最后的数据结果。
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按微滴数排列的通道1（FAM）荧光增量
按微滴数排列的通道2（VIC/HEX）荧光增量
按通道2荧光增量排列的微滴数
切换数据显示模式（大图或者列表）
已分析孔
运行指示
孔内数据串
按通道1荧光增量排列的微滴数
样品名
实验名
通道1浓度读数
开始运行后的软件界面
通道2浓度读数
3.3 数据分析
在软件“Setup”窗口的 “plate”框内选择“load”（文件名后缀为.qlp的文件），然后点击“Analyze”打开并分析数据。数据分析界面分为三个窗口：
结果列表
— Results table：显示所选反应孔的全部结果
— Well selector：允许选择用来分析的孔
— Processed data/graphical display：显示所选孔的图形数据
复制图像按钮及打印图像按钮
数据分析界面. 显示中的数据为一次CNV实验的结果
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Y轴显示选项
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状态显示：
OK – 自动分析成功
CHECK – 自动分析未成功；需使用手动分析工具得到浓度
Multi – 多孔同时数据自动分析的结果
Manual – 手动分析数据结果
在图表显示窗里观察表格
输出数据到CSV文
按荧光检测通道来选择数据
选择数据是否合并分析（需要多个孔的样品名称、实验方法、检测目标名称和检测类型都一致）
选择列表数据中不同通道的数据是顺序排列还是间隔排列
3.3.1查看各个通道数据（一维图）
点击“1D Amplitude”查看每个通道下所选反应孔的数据。使用通道选择按钮可选择需显示的通道。在这个界面下可以对每个通道进行阈值线的调节以指定阳性和阴性微滴。
在查看单个孔时，可使用以下方式改变阈值线：
▪ 使用单孔阈值线工具。指定的阈值线呈现水平粉色直线。
或者
▪ 在“Set Threshold”框内键入阈值。
在查看多个孔时，按照以下方式改变阈值：
▪ 使用单孔阈值线工具改变每个单孔的阈值。数据点图中垂直方向的黄色直线将每个孔的微滴图分开。而指定的阈值线是水平粉色直线。
▪
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使用多孔阈值线工具改变所有孔的阈值（阈值线是水平粉色直线）。
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▪ 为单孔或多孔手工设置阈值，在点图下方的“Set Threshold”框内键入阈值并点击“Set Threshold”或直接回车确定。
点击“Auto Analyze”转换为自动阈值设定和计算模式。也可在二维图中调节阈值（见2）。
3.3.2查看聚类图 （2维荧光增量）
点击“2D Amplitude”查看通道1和通道2聚类图。此图允许手工或自动调节阈值用以对每个检测通道进行阳性和阴性微滴指定。
▪ 点击“Auto Analyze”重设阈值
▪ 手工指定阈值：
— 使用阈值十字线指定整个点图的分类区域（仅在热图模式下可选）
— 使用椭圆，矩形或套索阈值调节工具来分类点图区域：点击相应工具按钮，然后在“Working cluster selector”点击区域类型，使用工具选择相应区域。
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3.3.3 查看浓度数据
在反应板图中每个目标基因的浓度数据会显示在反应孔中并会在结果列表中列出。点击“Concentration”在浓度图中可以看到浓度数据。使用通道选择按钮选择要显示的通道。误差线反映总误差或95%泊松置信度。这些数据可以导出到其他应用程序中分析（例如，Excel）。
3.3.4 查看拷贝数数据
点击“Copy Number”查看所选反应孔/样品的拷贝数。
3.3.5 查看比例数据
点击“Ratio”查看所选反应孔/样品的比例数据。使用选择键选择显示比例（位置样:内参）或分数含量（%，样品百分比）；选择“Inverse”显示反向比例。
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3.3.6 查看微滴个数
点击“Events”查看所选反应孔/样品中数出的微滴数目。使用选择键选择要显示的通道。查看阳性、阴性或总微滴数，或以上选项的任意组合。
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