2024年2月24日发(作者：函尔真)
2020-2021敲减心磷脂酰基转移酶1对肝细胞脂肪变和氧化应激的影响及其机制（完整版）
非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除外酒精性和其他明确肝损伤因素所致的，以肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的代谢综合征，包括非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver，NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)和NASH相关性肝纤维化，可进展为肝硬化、肝癌。氧化应激在NAFLD的发生、发展中发挥重要作用。氧化应激产物如活性氧会损伤核酸、蛋白质和脂类，进而对细胞产生更大损伤。氧化应激也可诱导炎症因子的产生，从而加重肝脏炎症，进一步促进肝纤维化的发生[]。因此，氧化应激是NAFLD进展的中心环节。改善氧化应激是控制NAFLD进展的重要转折点。
近来研究提示自噬可减轻氧化应激并延缓NAFLD的进展[。据报道，NAFLD与肝脏自噬功能下调有关，而恢复自噬可逆转肝脂肪酸积累诱导的胰岛素抵抗]。心磷脂是定位于线粒体的磷脂，在维持线粒体结构和功能方面起重要作用，对线粒体嵴的发生，线粒体的融合、分裂，以及线粒体呼吸链复合物的形成至关重要[。心磷脂还参与自噬的整个过程，诱导功能失调的线粒体发生线粒体自噬[。研究表明，心磷脂酰基转移酶1(Acyl-CoA：lysocardiolipin acyltransferase 1，ALCAT1)可通过心磷脂的病理性重塑来调控线粒体功能障碍和氧化应激。ALCAT1表达上调在
衰老相关疾病(如肥胖、2型糖尿病和心脑血管疾病等)的线粒体功能障碍中起关键作用，靶向失活ALCAT1则可防止各种衰老相关疾病的发生[]。ALCAT1可通过加剧氧化应激反应并减弱丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinase，AKT)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian
target of rapamycin，mTOR)信号转导加剧肥厚性心肌病的病理进程[]。然而，关于ALCAT1在NAFLD中作用的研究较少。因此，本研究旨在通过构建脂肪肝细胞模型，探讨ALCAT1对NAFLD发生、发展的影响及其可能作用机制。
材料与方法
一、研究材料
人正常肝细胞(L-02细胞；中国科学院)，RPMI(Roswell Park Memorial
Institute)-1640培养基(美国Gibco公司)，荧光显微镜[奥林巴斯(中国)有限公司]，细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8，CCK-8；日本同仁化学研究所)，SMART®MMLV反转录试剂盒(日本TaKaRa公司)，SYBR绿色实时荧光定量PCR SuperMix试剂盒(美国ABI公司)，IL-6 ELISA试剂盒、TNF-α ELISA试剂盒(美国Prointech公司)，活性氧ELISA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)、丙二醛ELISA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal，4-HNE)ELISA试剂盒(上海邦景实业有限公司)，ALCAT1抗体(美国奥维亚系统生物公司)，β-肌动蛋白(β-actin)抗体、AKT抗体、磷酸化AKT抗体、mTOR抗体和酵母ATG6
同源物(Beclin1)抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)-Ⅰ、LC3-Ⅱ(美国Novus公司)，羊抗兔二抗(美国Jackson公司)。
二、脂肪肝细胞模型的建立和ALCAT1的表达鉴定
将L-02细胞在添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI-1640培养基中培养，培养条件为37 ℃，体积分数为0.05的CO2恒温、恒湿培养箱[]。铺96孔板，每孔1.0×104个细胞，以游离脂肪酸(free fatty acids，FFA；即亚油酸和棕榈酸混合浓度为0.5 mmol/L、混合比例为2∶1的混合物)处理细胞24 h，建立脂肪肝细胞模型。以1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)处理的L-02的细胞作为对照[]。然后用浓度为1 mg/L的尼罗红孵育10 min。在543 nm激发波长和598 nm发射波长下记录图像。在荧光显微镜下观察脂肪肝细胞模型L-02细胞脂质沉积情况。采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测ALCAT1在脂肪肝细胞模型中的表达情况。
三、ALCAT1 siRNA转染
使用Lipofectamine®2000将荧光素酰胺标记的ALCAT1小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)瞬时转染L-02细胞，选择3种序列的ALCAT1 siRNA片段，其中ALCAT1 siRNA1序列为5′-GCCUCAAAGCGAGUCUCAATT-3′(正向)和5′-UUGAGACUCGCUUUGAGGCTT-3′(反向)，ALCAT1 siRNA2序列为5′
-CCACUUCAACUCCUCAUAUTT-3′(正向)和5′-AUAUGAGGAGUUGAAGUGGTT-3′(反向)，ALCAT1 siRNA3序列为5′-GCUGCAAGAGA-GAAUAUUUTT-3′(正向)和5′-AAAUAUUCUCU-CUUGCAGCTT-3′(反向)。以空白对照(无siRNA转染的L-02细胞)和空载siRNA(以空载siRNA转染L-02细胞)作为阴性对照。空载siRNA序列为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′(正向)和5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′(反向)。将1 μg空载质粒和ALCAT1
siRNA质粒悬浮于200 μL无血清Opti MEM培养基中，分别形成siRNA/脂质体混合物。然后将混合物加入6孔板中，每孔1.0×104个细胞，转染6～48 h，用荧光显微镜观察转染效率。采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法测定3种ALCAT1 siRNA片段干预后ALCAT1基因和蛋白质的相对表达水平，选择干预效果最佳的ALCAT1 siRNA用于后续实验。
四、实时荧光定量PCR检测
去除细胞培养液后，PBS冲洗细胞3次，用TRIzol试剂从实验细胞中提取总RNA，用SMART®MMLV反转录试剂盒反转录合成cDNA。根据说明书，用SYBR绿色实时荧光定量PCR SuperMix试剂盒检测目的基因的表达。以β-actin基因作为管家基因[]。ALCAT1引物序列为5′-CACCCTACCTGT-GGCATTATTG-3′(正向)和5′-CCATTCTTGTCCG-ATGGTTCAT-3′(反向)；β-actin引物序列为5′-CATGTACGTTGCTATCC-AGGC-3′(正向)和5′-CTCCTTAATGTCACGCA-CGAT-3′(反向)。
五、透射电子显微镜下观察脂滴沉积、线粒体形态、自噬体结构
胰酶消化细胞，PBS洗涤，1 500 r/min(离心半径为14 cm)离心5 min，弃上清液，加入1 mL 2.5%戊二醛溶液固定过夜，PBS清洗。1%锇酸溶液4 ℃固定2 h，PBS清洗，分别用50%、70%、80%、90%乙醇梯度脱水各15 min，置于70%乙醇中过夜，用无水乙醇脱水，丙酮置换，包埋、切片。采用醋酸双氧铀和醋酸铅染色，置于透射电子显微镜下观察脂滴沉积、线粒体形态、自噬体结构。
六、CCK-8检测细胞活力
L-02细胞铺96孔板，每孔1.0×104个细胞，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中培养过夜。设立空白对照组、脂肪肝细胞模型组、ALCAT1干预组。空白对照组以常规RPMI-1640培养基培养L-02细胞48 h；脂肪肝细胞模型组以空载siRNA质粒转染L-02细胞24 h，然后用含FFA培养基处理细胞24 h；ALCAT1干预组先用ALCAT1 siRNA转染细胞24 h，然后以含FFA的培养基继续处理24 h。每孔加入10 μL
CCK-8溶液，37 ℃继续培养1 h。在酶联免疫检测仪450 nm波长处测量各孔的吸光度值。计算空白对照组、脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组的细胞活力。
七、蛋白质印迹法
采用蛋白质印迹法测定各组自噬体标志物LC3-Ⅱ和Beclin1，以及mTOR信号通路关键蛋白mTOR和磷酸化AKT的表达水平，具体方法如下。用含1 mmol/L苯甲基磺酰氟的冷冻裂解缓冲液提取L-02细胞样品中的蛋
白质。然后用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法检测试剂盒测定蛋白质浓度。将每个样品中的等量蛋白质运用12% SDS-PAGE分离蛋白质，然后转移至PVDF膜上。用5%牛奶在室温下封闭膜2 h，加入第一抗体在4 ℃孵育过夜，再加入HRP结合的山羊抗鼠第二抗体在室温下孵育1
h，然后用电化学发光系统检测印迹。第一抗体为β-actin、ALCAT1、AKT、磷酸化AKT、mTOR、Beclin1、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ(稀释比例均为1∶1 000)。第二抗体为HRP结合的羊抗鼠血清(稀释比例为1∶10 000)。
八、ELISA检测氧化应激产物和炎症因子的表达
收集空白对照组、脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组的细胞培养上清液，使用丙二醛、4-HNE和活性氧ELISA试剂盒检测氧化应激产物丙二醛、4-HNE和活性氧的表达，用IL-6和TNF-α ELISA试剂盒检测炎症因子IL-6和TNF-α的表达。
九、统计学方法
应用SPSS 22.0和GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析。呈正态分布的计量资料以 ±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间的比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
一、ALCAT1在脂肪肝细胞模型中的表达情况
尼罗红染色结果显示，FFA诱导建立的脂肪肝细胞模型组中L-02细胞呈现明显的脂滴沉积(图1)。实时荧光定量PCR检测结果显示，脂肪肝细胞模型组中ALCAT1的mRNA表达水平高于阴性对照组(9.26±0.83比1.02
±0.12)，差异有统计学意义(t＝9.82，P<0.05)。见图2，蛋白质印迹法检测结果显示，脂肪肝细胞模型组中ALCAT1的蛋白质表达水平高于阴性对照组(0.35±0.02比0.17±0.01)，差异有统计学意义(t＝6.83，P<0.05)。
图1免疫荧光显微镜下观察脂肪肝细胞模型细胞中脂滴沉积情况 低倍放大 A 阴性对照细胞核 DAPI染色 B 阴性对照 尼罗红染色 C
阴性对照 合成图片 D 脂肪肝细胞模型细胞核 DAPI染色 E 脂肪肝细胞模型 尼罗红染色 F 脂肪肝细胞模型 合成图片
二、ALCAT1 siRNA转染效果验证
见表1和图3，实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测结果显示，ALCAT1
siRNA1、ALCAT1 siRNA2和ALCAT1 siRNA3可不同程度地降低L-02细胞中ALCAT1在蛋白质和mRNA水平的表达，以ALCAT1 siRNA3的
干预效果最佳。因此，选择ALCAT1 siRNA3用于后续实验。
三、敲减ALCAT1对脂滴沉积、线粒体自噬和细胞活力的影响
透射电子显微镜结果显示，脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组的脂滴沉积量均高于空白对照组(17.67±3.52和7.67±0.33比4.33±0.33)，差异均有统计学意义(t＝3.76、7.07，P均<0.05)；ALCAT1干预组的脂滴沉积量低于脂肪肝细胞模型组(7.67±0.33比17.67±3.52)，差异有统计学意义(t＝2.82，P<0.05)。
透射电子显微镜下(图4)观察细胞的超微结构，结果表明，脂肪肝细胞模型组线粒体形态发生改变，线粒体肿胀程度高于空白对照组，而ALCAT1干预组肿胀线粒体数量少于脂肪肝细胞模型组；脂肪肝细胞模型组的自噬体数量多于空白对照组，而ALCAT1干预组的自噬体数量多于脂肪肝细胞模型组。
图4透射电子显微镜下空白对照组、脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组
细胞的超微结构 醋酸双氧铀和醋酸铅双重染色 A 空白对照组 低倍放大 B 空白对照组 中倍放大 C 空白对照组 高倍放大 D 脂肪肝细胞模型组 低倍放大 E 脂肪肝细胞模型组 中倍放大 F 脂肪肝细胞模型组 高倍放大 G ALCAT1干预组 低倍放大 H
ALCAT1干预组 中倍放大 I ALCAT1干预组 高倍放大
蛋白质印迹法结果(图5和图6)显示，脂肪肝细胞模型组的LC3-Ⅱ表达水平高于空白对照组(0.43±0.01比0.28±0.02)，差异有统计学意义(t＝7.32，P<0.05)；脂肪肝细胞模型组的Beclin1表达水平与空白对照组比较(0.93±0.05比0.98±0.05)，差异无统计学意义(P>0.05)；ALCAT1干预组的LC3-Ⅱ、Beclin1表达水平均高于脂肪肝细胞模型组(0.95±0.04比0.42±0.01、2.07±0.06比0.93±0.05)，差异均有统计学意义(t＝13.30、14.05，P均<0.05)；ALCAT1干预组的LC3-Ⅱ、Beclin1表达水平均高于空白对照组(0.95±0.04比0.28±0.02、2.07±0.06比0.98±0.05)，差异均有统计学意义(t＝15.63、13.02，P均<0.05)。
CCK-8检测结果显示，脂肪肝细胞模型组、ALCAT1干预组的细胞活力均低于空白对照组[(68.68±2.65)%和(79.39±1.78)%比(100.00±2.72)%]，差异均有统计学意义(t＝8.26、6.34，P<0.05)。ALCAT1干预组的细胞活力高于脂肪肝细胞模型组[(79.39±1.78)%比(68.68±2.65)%]，差异有统计学意义(t＝3.36，P<0.05)。
四、敲减ALCAT1对mTOR信号通路关键蛋白表达的影响
蛋白质印迹法检测结果(图7)显示，脂肪肝细胞模型组、ALCAT1干预组的mTOR表达水平均低于空白对照组(1.44±0.02和0.74±0.01比1.93±0.10)，差异均有统计学意义(t＝4.83、12.04，P均<0.05)，ALCAT1干预组mTOR的表达水平低于脂肪肝细胞模型组(0.74±0.01比1.44±0.02)，差异有统计学意义(t＝32.14，P<0.05)；脂肪肝细胞模型组、ALCAT1干预组磷酸化AKT的表达水平均低于空白对照组(0.14±0.01和0.07±0.01比0.28±0.01)，ALCAT1干预组磷酸化AKT的表达水平低于脂肪肝细胞模型组(0.07±0.01比0.14±0.01)，差异均有统计学意义(t＝8.59、14.10、5.96，P均<0.05)。
五、敲减ALCAT1对氧化应激产物和炎症因子表达的影响
见表2，ELISA检测结果显示，脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组的活性氧、丙二醛、4-HNE、IL-6和TNF-α的表达水平均高于空白对照组，差异均有统计学意义(t＝19.86、7.86、7.45、6.74、7.22、3.49、29.34、5.53、8.02、3.03，P均<0.05)；ALCAT1干预组的活性氧、4-HNE、IL-6和TNF-α的表达水均低于脂肪肝细胞模型组，差异均有统计学意义(t＝11.99、3.51、8.54、5.81，P均<0.05)；ALCAT1干预组丙二醛的表达水平与脂肪肝细胞模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。
表2空白对照组、脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组细胞中氧化应激产物和炎症因子的表达水平分析( ±s)
讨论
二次打击学说是NAFLD发生、发展的主要依据。肝细胞的脂滴沉积构成第1次打击，包括线粒体功能异常、氧化应激和炎症反应在内的第2次打击，导致NAFL进展为NASH。目前多采用以单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸诱导甲胎蛋白阳性肝癌细胞系(HepG2)或L-02细胞构建NAFLD体外细胞模型，来进一步研究NAFLD的病理机制[]。本课题组的前期研究发现，0.5 mmol/L的亚油酸和棕榈酸混合物(混合比例为2 ∶1)可建立较优的NAFLD模型[]，本研究选择此混合物建立脂肪肝细胞模型。
NAFLD发病机制复杂，研究表明，自噬与NAFLD的发生有关[]。自噬是自噬溶酶体通过降解亚细胞器和大分子物质来实现物质再利用的过程，在维持细胞能量平衡中发挥重要作用。自噬参与体内许多病理生理过程，包括细胞生长发育、组织损伤、重塑、衰老和癌症等，是NAFLD病程中的一种适应性反应，可通过防止过度脂肪堆积，清除受损的细胞器和有害物质，消除过量的活性氧和功能紊乱的线粒体，改善线粒体功能，减少氧化应激，从而控制炎症反应和肝纤维化进程[]。然而，自噬是一把双刃剑，在应激条件下，机体可通过激活自噬，清除受损细胞器和有害产物来促进
细胞存活，但在过度和持续压力诱导下的自噬可以诱导细胞凋亡。自噬与氧化应激相互作用，可通过去除肝细胞受损线粒体减少活性氧的形成，但当自噬被抑制时，受损的线粒体继续产生活性氧和有毒物质，形成恶性循环，进一步加重氧化应激和细胞损伤[]。目前自噬与NAFLD之间的关系仍存在争议[]。本研究结果发现，脂肪肝细胞模型细胞中自噬小体数量增加，自噬小体中有许多细胞器和脂滴，自噬生物标志物LC3-Ⅱ表达增加，活性氧、丙二醛和4-HNE表达增加。提示，NAFLD中存在线粒体肿胀，氧化应激产物表达增加；FFA可以激活体外脂肪肝细胞自噬，但自噬不能完全清除受损的细胞器(如线粒体等)，不能发挥充分的保护作用，进而导致NAFLD的进展。
近年来，心磷脂代谢紊乱已成为研究者关注的焦点[]。心磷脂易位于线粒体外膜被证明是一种识别信号，其引导受损的线粒体发生自噬，这是控制线粒体质量和细胞存活的关键步骤[]。病理性心磷脂重塑与许多衰老相关性疾病如糖尿病、肥胖、心血管疾病、癌症和神经退行性疾病等相关[]。ALCAT1通过增加心磷脂中二十二碳六烯酸和花生四烯酸等多不饱和脂肪酸侧链的比例，促进心磷脂重塑[]。ALCAT1催化的心磷脂重塑可导致多种代谢缺陷，包括氧化应激、线粒体DNA突变和线粒体功能障碍等[]。研究表明，ALCAT1在代谢性疾病和年龄相关疾病中的表达上调[ALCAT1的高表达可通过上调氧化应激和脂质过氧化加剧线粒体的氧化损伤[。本研究结果显示，脂肪肝细胞中ALCAT1的表达增加，肿胀、畸形的线粒体增加；敲减ALCAT1的表达，LC3-Ⅱ和Beclin1等自噬生物标志物的表达水平升高，自噬小体增加，畸形肿胀的线粒体减少，氧化应激产物活性氧、
4-HNE表达下调。提示靶向的ALCAT1失活减轻了脂肪肝细胞氧化应激和炎症反应。
自噬的调节涉及多种信号通路，其中磷酸肌醇3-激酶/AKT/mTOR信号通路是最经典的信号通路。mTOR是自噬的关键抑制剂[]。mTOR可调节细胞生长和增殖，整合生长因子和营养信号，从而控制细胞功能，包括脂质合成、线粒体活性和自噬[]。mTOR信号缺陷可导致肥胖和糖尿病等代谢紊乱疾病[]。本研究结果显示，脂肪肝细胞模型组、ALCAT1干预组的mTOR表达水平均低于空白对照组，脂肪肝细胞模型组磷酸化AKT的表达水平低于空白对照组，ALCAT1干预组磷酸化AKT的表达水平低于脂肪肝细胞模型组，差异均有统计学意义。提示，敲减ALCAT1可致脂肪肝细胞模型组中磷酸化AKT和mTOR表达进一步下降。敲减ALCAT1可能通过增加自噬，减轻肝细胞脂肪变及其氧化应激和炎症反应。
总之，本研究结果表明FFA混合物诱导脂肪肝细胞自噬增加，但其增加与细胞损伤不成比例。ALCAT1能抑制细胞自噬，引起线粒体肿胀，导致氧化应激和炎症反应。敲减ALCAT1通过抑制mTOR转录激活自噬，减轻肝细胞脂肪变、氧化应激和炎症反应。ALCAT1可能是体外NAFLD肝细胞脂肪变和氧化应激的潜在治疗靶点，但ALCAT1在在体NAFLD动物模型和NAFLD患者中的作用有待进一步研究。
2024年2月24日发(作者：函尔真)
2020-2021敲减心磷脂酰基转移酶1对肝细胞脂肪变和氧化应激的影响及其机制（完整版）
非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除外酒精性和其他明确肝损伤因素所致的，以肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的代谢综合征，包括非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver，NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)和NASH相关性肝纤维化，可进展为肝硬化、肝癌。氧化应激在NAFLD的发生、发展中发挥重要作用。氧化应激产物如活性氧会损伤核酸、蛋白质和脂类，进而对细胞产生更大损伤。氧化应激也可诱导炎症因子的产生，从而加重肝脏炎症，进一步促进肝纤维化的发生[]。因此，氧化应激是NAFLD进展的中心环节。改善氧化应激是控制NAFLD进展的重要转折点。
近来研究提示自噬可减轻氧化应激并延缓NAFLD的进展[。据报道，NAFLD与肝脏自噬功能下调有关，而恢复自噬可逆转肝脂肪酸积累诱导的胰岛素抵抗]。心磷脂是定位于线粒体的磷脂，在维持线粒体结构和功能方面起重要作用，对线粒体嵴的发生，线粒体的融合、分裂，以及线粒体呼吸链复合物的形成至关重要[。心磷脂还参与自噬的整个过程，诱导功能失调的线粒体发生线粒体自噬[。研究表明，心磷脂酰基转移酶1(Acyl-CoA：lysocardiolipin acyltransferase 1，ALCAT1)可通过心磷脂的病理性重塑来调控线粒体功能障碍和氧化应激。ALCAT1表达上调在
衰老相关疾病(如肥胖、2型糖尿病和心脑血管疾病等)的线粒体功能障碍中起关键作用，靶向失活ALCAT1则可防止各种衰老相关疾病的发生[]。ALCAT1可通过加剧氧化应激反应并减弱丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinase，AKT)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian
target of rapamycin，mTOR)信号转导加剧肥厚性心肌病的病理进程[]。然而，关于ALCAT1在NAFLD中作用的研究较少。因此，本研究旨在通过构建脂肪肝细胞模型，探讨ALCAT1对NAFLD发生、发展的影响及其可能作用机制。
材料与方法
一、研究材料
人正常肝细胞(L-02细胞；中国科学院)，RPMI(Roswell Park Memorial
Institute)-1640培养基(美国Gibco公司)，荧光显微镜[奥林巴斯(中国)有限公司]，细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8，CCK-8；日本同仁化学研究所)，SMART®MMLV反转录试剂盒(日本TaKaRa公司)，SYBR绿色实时荧光定量PCR SuperMix试剂盒(美国ABI公司)，IL-6 ELISA试剂盒、TNF-α ELISA试剂盒(美国Prointech公司)，活性氧ELISA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)、丙二醛ELISA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal，4-HNE)ELISA试剂盒(上海邦景实业有限公司)，ALCAT1抗体(美国奥维亚系统生物公司)，β-肌动蛋白(β-actin)抗体、AKT抗体、磷酸化AKT抗体、mTOR抗体和酵母ATG6
同源物(Beclin1)抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)-Ⅰ、LC3-Ⅱ(美国Novus公司)，羊抗兔二抗(美国Jackson公司)。
二、脂肪肝细胞模型的建立和ALCAT1的表达鉴定
将L-02细胞在添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI-1640培养基中培养，培养条件为37 ℃，体积分数为0.05的CO2恒温、恒湿培养箱[]。铺96孔板，每孔1.0×104个细胞，以游离脂肪酸(free fatty acids，FFA；即亚油酸和棕榈酸混合浓度为0.5 mmol/L、混合比例为2∶1的混合物)处理细胞24 h，建立脂肪肝细胞模型。以1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)处理的L-02的细胞作为对照[]。然后用浓度为1 mg/L的尼罗红孵育10 min。在543 nm激发波长和598 nm发射波长下记录图像。在荧光显微镜下观察脂肪肝细胞模型L-02细胞脂质沉积情况。采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测ALCAT1在脂肪肝细胞模型中的表达情况。
三、ALCAT1 siRNA转染
使用Lipofectamine®2000将荧光素酰胺标记的ALCAT1小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)瞬时转染L-02细胞，选择3种序列的ALCAT1 siRNA片段，其中ALCAT1 siRNA1序列为5′-GCCUCAAAGCGAGUCUCAATT-3′(正向)和5′-UUGAGACUCGCUUUGAGGCTT-3′(反向)，ALCAT1 siRNA2序列为5′
-CCACUUCAACUCCUCAUAUTT-3′(正向)和5′-AUAUGAGGAGUUGAAGUGGTT-3′(反向)，ALCAT1 siRNA3序列为5′-GCUGCAAGAGA-GAAUAUUUTT-3′(正向)和5′-AAAUAUUCUCU-CUUGCAGCTT-3′(反向)。以空白对照(无siRNA转染的L-02细胞)和空载siRNA(以空载siRNA转染L-02细胞)作为阴性对照。空载siRNA序列为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′(正向)和5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′(反向)。将1 μg空载质粒和ALCAT1
siRNA质粒悬浮于200 μL无血清Opti MEM培养基中，分别形成siRNA/脂质体混合物。然后将混合物加入6孔板中，每孔1.0×104个细胞，转染6～48 h，用荧光显微镜观察转染效率。采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法测定3种ALCAT1 siRNA片段干预后ALCAT1基因和蛋白质的相对表达水平，选择干预效果最佳的ALCAT1 siRNA用于后续实验。
四、实时荧光定量PCR检测
去除细胞培养液后，PBS冲洗细胞3次，用TRIzol试剂从实验细胞中提取总RNA，用SMART®MMLV反转录试剂盒反转录合成cDNA。根据说明书，用SYBR绿色实时荧光定量PCR SuperMix试剂盒检测目的基因的表达。以β-actin基因作为管家基因[]。ALCAT1引物序列为5′-CACCCTACCTGT-GGCATTATTG-3′(正向)和5′-CCATTCTTGTCCG-ATGGTTCAT-3′(反向)；β-actin引物序列为5′-CATGTACGTTGCTATCC-AGGC-3′(正向)和5′-CTCCTTAATGTCACGCA-CGAT-3′(反向)。
五、透射电子显微镜下观察脂滴沉积、线粒体形态、自噬体结构
胰酶消化细胞，PBS洗涤，1 500 r/min(离心半径为14 cm)离心5 min，弃上清液，加入1 mL 2.5%戊二醛溶液固定过夜，PBS清洗。1%锇酸溶液4 ℃固定2 h，PBS清洗，分别用50%、70%、80%、90%乙醇梯度脱水各15 min，置于70%乙醇中过夜，用无水乙醇脱水，丙酮置换，包埋、切片。采用醋酸双氧铀和醋酸铅染色，置于透射电子显微镜下观察脂滴沉积、线粒体形态、自噬体结构。
六、CCK-8检测细胞活力
L-02细胞铺96孔板，每孔1.0×104个细胞，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中培养过夜。设立空白对照组、脂肪肝细胞模型组、ALCAT1干预组。空白对照组以常规RPMI-1640培养基培养L-02细胞48 h；脂肪肝细胞模型组以空载siRNA质粒转染L-02细胞24 h，然后用含FFA培养基处理细胞24 h；ALCAT1干预组先用ALCAT1 siRNA转染细胞24 h，然后以含FFA的培养基继续处理24 h。每孔加入10 μL
CCK-8溶液，37 ℃继续培养1 h。在酶联免疫检测仪450 nm波长处测量各孔的吸光度值。计算空白对照组、脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组的细胞活力。
七、蛋白质印迹法
采用蛋白质印迹法测定各组自噬体标志物LC3-Ⅱ和Beclin1，以及mTOR信号通路关键蛋白mTOR和磷酸化AKT的表达水平，具体方法如下。用含1 mmol/L苯甲基磺酰氟的冷冻裂解缓冲液提取L-02细胞样品中的蛋
白质。然后用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法检测试剂盒测定蛋白质浓度。将每个样品中的等量蛋白质运用12% SDS-PAGE分离蛋白质，然后转移至PVDF膜上。用5%牛奶在室温下封闭膜2 h，加入第一抗体在4 ℃孵育过夜，再加入HRP结合的山羊抗鼠第二抗体在室温下孵育1
h，然后用电化学发光系统检测印迹。第一抗体为β-actin、ALCAT1、AKT、磷酸化AKT、mTOR、Beclin1、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ(稀释比例均为1∶1 000)。第二抗体为HRP结合的羊抗鼠血清(稀释比例为1∶10 000)。
八、ELISA检测氧化应激产物和炎症因子的表达
收集空白对照组、脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组的细胞培养上清液，使用丙二醛、4-HNE和活性氧ELISA试剂盒检测氧化应激产物丙二醛、4-HNE和活性氧的表达，用IL-6和TNF-α ELISA试剂盒检测炎症因子IL-6和TNF-α的表达。
九、统计学方法
应用SPSS 22.0和GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析。呈正态分布的计量资料以 ±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间的比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
一、ALCAT1在脂肪肝细胞模型中的表达情况
尼罗红染色结果显示，FFA诱导建立的脂肪肝细胞模型组中L-02细胞呈现明显的脂滴沉积(图1)。实时荧光定量PCR检测结果显示，脂肪肝细胞模型组中ALCAT1的mRNA表达水平高于阴性对照组(9.26±0.83比1.02
±0.12)，差异有统计学意义(t＝9.82，P<0.05)。见图2，蛋白质印迹法检测结果显示，脂肪肝细胞模型组中ALCAT1的蛋白质表达水平高于阴性对照组(0.35±0.02比0.17±0.01)，差异有统计学意义(t＝6.83，P<0.05)。
图1免疫荧光显微镜下观察脂肪肝细胞模型细胞中脂滴沉积情况 低倍放大 A 阴性对照细胞核 DAPI染色 B 阴性对照 尼罗红染色 C
阴性对照 合成图片 D 脂肪肝细胞模型细胞核 DAPI染色 E 脂肪肝细胞模型 尼罗红染色 F 脂肪肝细胞模型 合成图片
二、ALCAT1 siRNA转染效果验证
见表1和图3，实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测结果显示，ALCAT1
siRNA1、ALCAT1 siRNA2和ALCAT1 siRNA3可不同程度地降低L-02细胞中ALCAT1在蛋白质和mRNA水平的表达，以ALCAT1 siRNA3的
干预效果最佳。因此，选择ALCAT1 siRNA3用于后续实验。
三、敲减ALCAT1对脂滴沉积、线粒体自噬和细胞活力的影响
透射电子显微镜结果显示，脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组的脂滴沉积量均高于空白对照组(17.67±3.52和7.67±0.33比4.33±0.33)，差异均有统计学意义(t＝3.76、7.07，P均<0.05)；ALCAT1干预组的脂滴沉积量低于脂肪肝细胞模型组(7.67±0.33比17.67±3.52)，差异有统计学意义(t＝2.82，P<0.05)。
透射电子显微镜下(图4)观察细胞的超微结构，结果表明，脂肪肝细胞模型组线粒体形态发生改变，线粒体肿胀程度高于空白对照组，而ALCAT1干预组肿胀线粒体数量少于脂肪肝细胞模型组；脂肪肝细胞模型组的自噬体数量多于空白对照组，而ALCAT1干预组的自噬体数量多于脂肪肝细胞模型组。
图4透射电子显微镜下空白对照组、脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组
细胞的超微结构 醋酸双氧铀和醋酸铅双重染色 A 空白对照组 低倍放大 B 空白对照组 中倍放大 C 空白对照组 高倍放大 D 脂肪肝细胞模型组 低倍放大 E 脂肪肝细胞模型组 中倍放大 F 脂肪肝细胞模型组 高倍放大 G ALCAT1干预组 低倍放大 H
ALCAT1干预组 中倍放大 I ALCAT1干预组 高倍放大
蛋白质印迹法结果(图5和图6)显示，脂肪肝细胞模型组的LC3-Ⅱ表达水平高于空白对照组(0.43±0.01比0.28±0.02)，差异有统计学意义(t＝7.32，P<0.05)；脂肪肝细胞模型组的Beclin1表达水平与空白对照组比较(0.93±0.05比0.98±0.05)，差异无统计学意义(P>0.05)；ALCAT1干预组的LC3-Ⅱ、Beclin1表达水平均高于脂肪肝细胞模型组(0.95±0.04比0.42±0.01、2.07±0.06比0.93±0.05)，差异均有统计学意义(t＝13.30、14.05，P均<0.05)；ALCAT1干预组的LC3-Ⅱ、Beclin1表达水平均高于空白对照组(0.95±0.04比0.28±0.02、2.07±0.06比0.98±0.05)，差异均有统计学意义(t＝15.63、13.02，P均<0.05)。
CCK-8检测结果显示，脂肪肝细胞模型组、ALCAT1干预组的细胞活力均低于空白对照组[(68.68±2.65)%和(79.39±1.78)%比(100.00±2.72)%]，差异均有统计学意义(t＝8.26、6.34，P<0.05)。ALCAT1干预组的细胞活力高于脂肪肝细胞模型组[(79.39±1.78)%比(68.68±2.65)%]，差异有统计学意义(t＝3.36，P<0.05)。
四、敲减ALCAT1对mTOR信号通路关键蛋白表达的影响
蛋白质印迹法检测结果(图7)显示，脂肪肝细胞模型组、ALCAT1干预组的mTOR表达水平均低于空白对照组(1.44±0.02和0.74±0.01比1.93±0.10)，差异均有统计学意义(t＝4.83、12.04，P均<0.05)，ALCAT1干预组mTOR的表达水平低于脂肪肝细胞模型组(0.74±0.01比1.44±0.02)，差异有统计学意义(t＝32.14，P<0.05)；脂肪肝细胞模型组、ALCAT1干预组磷酸化AKT的表达水平均低于空白对照组(0.14±0.01和0.07±0.01比0.28±0.01)，ALCAT1干预组磷酸化AKT的表达水平低于脂肪肝细胞模型组(0.07±0.01比0.14±0.01)，差异均有统计学意义(t＝8.59、14.10、5.96，P均<0.05)。
五、敲减ALCAT1对氧化应激产物和炎症因子表达的影响
见表2，ELISA检测结果显示，脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组的活性氧、丙二醛、4-HNE、IL-6和TNF-α的表达水平均高于空白对照组，差异均有统计学意义(t＝19.86、7.86、7.45、6.74、7.22、3.49、29.34、5.53、8.02、3.03，P均<0.05)；ALCAT1干预组的活性氧、4-HNE、IL-6和TNF-α的表达水均低于脂肪肝细胞模型组，差异均有统计学意义(t＝11.99、3.51、8.54、5.81，P均<0.05)；ALCAT1干预组丙二醛的表达水平与脂肪肝细胞模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。
表2空白对照组、脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组细胞中氧化应激产物和炎症因子的表达水平分析( ±s)
讨论
二次打击学说是NAFLD发生、发展的主要依据。肝细胞的脂滴沉积构成第1次打击，包括线粒体功能异常、氧化应激和炎症反应在内的第2次打击，导致NAFL进展为NASH。目前多采用以单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸诱导甲胎蛋白阳性肝癌细胞系(HepG2)或L-02细胞构建NAFLD体外细胞模型，来进一步研究NAFLD的病理机制[]。本课题组的前期研究发现，0.5 mmol/L的亚油酸和棕榈酸混合物(混合比例为2 ∶1)可建立较优的NAFLD模型[]，本研究选择此混合物建立脂肪肝细胞模型。
NAFLD发病机制复杂，研究表明，自噬与NAFLD的发生有关[]。自噬是自噬溶酶体通过降解亚细胞器和大分子物质来实现物质再利用的过程，在维持细胞能量平衡中发挥重要作用。自噬参与体内许多病理生理过程，包括细胞生长发育、组织损伤、重塑、衰老和癌症等，是NAFLD病程中的一种适应性反应，可通过防止过度脂肪堆积，清除受损的细胞器和有害物质，消除过量的活性氧和功能紊乱的线粒体，改善线粒体功能，减少氧化应激，从而控制炎症反应和肝纤维化进程[]。然而，自噬是一把双刃剑，在应激条件下，机体可通过激活自噬，清除受损细胞器和有害产物来促进
细胞存活，但在过度和持续压力诱导下的自噬可以诱导细胞凋亡。自噬与氧化应激相互作用，可通过去除肝细胞受损线粒体减少活性氧的形成，但当自噬被抑制时，受损的线粒体继续产生活性氧和有毒物质，形成恶性循环，进一步加重氧化应激和细胞损伤[]。目前自噬与NAFLD之间的关系仍存在争议[]。本研究结果发现，脂肪肝细胞模型细胞中自噬小体数量增加，自噬小体中有许多细胞器和脂滴，自噬生物标志物LC3-Ⅱ表达增加，活性氧、丙二醛和4-HNE表达增加。提示，NAFLD中存在线粒体肿胀，氧化应激产物表达增加；FFA可以激活体外脂肪肝细胞自噬，但自噬不能完全清除受损的细胞器(如线粒体等)，不能发挥充分的保护作用，进而导致NAFLD的进展。
近年来，心磷脂代谢紊乱已成为研究者关注的焦点[]。心磷脂易位于线粒体外膜被证明是一种识别信号，其引导受损的线粒体发生自噬，这是控制线粒体质量和细胞存活的关键步骤[]。病理性心磷脂重塑与许多衰老相关性疾病如糖尿病、肥胖、心血管疾病、癌症和神经退行性疾病等相关[]。ALCAT1通过增加心磷脂中二十二碳六烯酸和花生四烯酸等多不饱和脂肪酸侧链的比例，促进心磷脂重塑[]。ALCAT1催化的心磷脂重塑可导致多种代谢缺陷，包括氧化应激、线粒体DNA突变和线粒体功能障碍等[]。研究表明，ALCAT1在代谢性疾病和年龄相关疾病中的表达上调[ALCAT1的高表达可通过上调氧化应激和脂质过氧化加剧线粒体的氧化损伤[。本研究结果显示，脂肪肝细胞中ALCAT1的表达增加，肿胀、畸形的线粒体增加；敲减ALCAT1的表达，LC3-Ⅱ和Beclin1等自噬生物标志物的表达水平升高，自噬小体增加，畸形肿胀的线粒体减少，氧化应激产物活性氧、
4-HNE表达下调。提示靶向的ALCAT1失活减轻了脂肪肝细胞氧化应激和炎症反应。
自噬的调节涉及多种信号通路，其中磷酸肌醇3-激酶/AKT/mTOR信号通路是最经典的信号通路。mTOR是自噬的关键抑制剂[]。mTOR可调节细胞生长和增殖，整合生长因子和营养信号，从而控制细胞功能，包括脂质合成、线粒体活性和自噬[]。mTOR信号缺陷可导致肥胖和糖尿病等代谢紊乱疾病[]。本研究结果显示，脂肪肝细胞模型组、ALCAT1干预组的mTOR表达水平均低于空白对照组，脂肪肝细胞模型组磷酸化AKT的表达水平低于空白对照组，ALCAT1干预组磷酸化AKT的表达水平低于脂肪肝细胞模型组，差异均有统计学意义。提示，敲减ALCAT1可致脂肪肝细胞模型组中磷酸化AKT和mTOR表达进一步下降。敲减ALCAT1可能通过增加自噬，减轻肝细胞脂肪变及其氧化应激和炎症反应。
总之，本研究结果表明FFA混合物诱导脂肪肝细胞自噬增加，但其增加与细胞损伤不成比例。ALCAT1能抑制细胞自噬，引起线粒体肿胀，导致氧化应激和炎症反应。敲减ALCAT1通过抑制mTOR转录激活自噬，减轻肝细胞脂肪变、氧化应激和炎症反应。ALCAT1可能是体外NAFLD肝细胞脂肪变和氧化应激的潜在治疗靶点，但ALCAT1在在体NAFLD动物模型和NAFLD患者中的作用有待进一步研究。