2024年2月24日发(作者：英正平)
理化检验-化学分册PTCA(PARTB:.)2007年第43卷10工作简报褪色光度法测定羟自由基及常见食物的抗氧化活性张 东,刘志江,高俊杰,余 萍(沈阳理工大学环境与化学工程学院,沈阳110168)摘 要:在用稀硫酸调节至pH4的溶液中,生物染色剂玫瑰桃红R能被由Fenton反应产生的羟自由基(・OH)氧化而褪色。根据在520nm波长处所测得的吸光度的消褪的程度(ΔA=A0-A1),实现了羟自由基存在量的光度测定,应用此方法还测定了自由基消除率,作为选择清除剂的判据;还测定了几种常见食品的抗氧化活性。从方法的操作和所测得的结果证明该方法具有操作简单、方便且稳定而经济。关键词:褪色光度法;羟自由基;抗氧化活性;食品中图分类号:O657.3 文献标识码:A 文章编号:100124020(203Color2FadingPhotometricDeterminationofHydroxylFreeRadicalandAnti2OxidationActivityofSomeCommonFoodstuffsZHANGDong,LIUZhi2jiang,GAOJun2jie,YUPing(CollegeofEnvironmentalandChemicalEngineering,ShenyangUniversityofScienceandEngineering,Shenyang110168,China)Abstract:InasolutionofpH4adjustedwithdil.H2SO4,bordeauxredwasoxidizedanddecolorizedbyhydroxylfreeradical(・OH)uringthemagnitudeofintensityofcolor2fading(ΔA=A0-A1)atthewavelengthof520nm,theamountof・posedmethodwasalsousedtodeterminedtheanti2oxidationactivityandusedavengingratesortheanti2oxidationactivityofsomecommonfoodstuffsweredeterminedbythismethod,whichwasprovedtobequitesimple,stable,ds:Color2fadingphotometry;Hydroxylfreeradical;Anti2oxidationactivity;Foodstuff 羟自由基是一种氧化能力很强的自由基,生物体内的羟自由基可使糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂肪类发生氧化[123]。对羟自由基的研究在生命科学、环境和食品科学领域中受到了广泛的重视,而测定羟自由基和筛选抗羟自由基氧化物质是一项重要内容。目前,离体检测羟自由基方法有电子共振自旋捕集法(ESR)[4]、化学发光法[5]、高效液相色谱法[6]、荧光法[7,8]、电化学法[9]等。这些方法有的操收稿日期:2006207216作者简介:张东(1974-),男,满族,吉林伊通人,工程师,主要 从事仪器分析和环境监测工作。作复杂,有的仪器试剂特殊或昂贵,使其应用受到了限制。分光光度法以其仪器价格低廉、操作简便而被广泛应用,用于羟自由基测定研究已有报道[10212]。试验发现:在一定条件下,玫瑰桃红R能被羟自由基氧化而褪色,而且褪色程度(ΔA)与羟自由基的量在一定范围内呈正比关系,据此建立了测定羟自由基的方法。并应用于测定食物水提取液对羟自由基的清除率。该方法操作简便,灵敏度较高,稳定性好,可作为一种筛选羟自由基清除剂的方法,有较高的推广应用价值。・852・
理化检验-化学分册张东等:褪色光度法测定羟自由基及常见食物的抗氧化活性1 方法原理由玫瑰桃红R可以看出,生色基-N=N-与两个萘环组成的大共轭体系是生色基团,其最大吸收波长为520nm左右。当加入过氧化氢和Fe2+时,过氧化氢和Fe2+发生Fenton反应,产生羟自由基,羟自由基是一种很强的亲电试剂,它进攻玫瑰桃红R的大共轭体系,使-N=N-和萘酚基之间的键断裂[13],大共轭体系受到破坏,在520nm波长处的吸收峰消失。通过测定玫瑰桃红R在520nm波长处的吸光度的变化,可间接测定出羟自由基的生成量。反应机理如下:按2.2.1步骤操作,在调pH为4后,向其中一支比色管中加入羟自由基清除剂,再分别加入等量的Fenton试剂,定容,摇匀。室温下反应20min后,分别测定吸光度,加羟自由基清除剂的溶液的吸光度记为A2。羟自由基清除率(F)按下式计算:F=A2-A1×100%A0-A12.2.3 食物中水提取物清除羟自由基能力的测定称取天然食物10.00g,捣碎,加入蒸馏水100mL,匀浆,密塞浸泡4h后,离心分离,移取上清液1.00mL测定。3 结果与讨论3.1 吸收光谱曲线按试验方法,分别扫描吸收光谱曲线,见图1。2 试验部分2.1 仪器与试剂7562MC紫外2可见分光光度计;pHS23C型酸1.玫瑰桃红R溶液(Bordeaux2Red) 2.1+0.005mmolFe2+3.1+0.01mmolH2O24.1+0.005mmolFe2++0.01mmolH2O25.1+0.01mmolFe2++0.02mmolH2O26.0.01mmolFe2++0.02mmolH2O2度计。玫瑰桃红R溶液:2.0×10-3mol・L-1;硫酸溶)标准溶液:0.01mol・液:0.1mol・L-1;铁(ⅡL-1(现用现配);过氧化氢溶液:0.05mol・L-1过氧化图1 吸收光谱Fig.1 Absorptionspectra氢配制,用KMnO4标准溶液标定,2～8℃冰箱内保存;抗坏血酸、苯甲酸和硫脲溶液的浓度均为0.01mol・L-1。试剂均为分析纯,水为蒸馏水。2.2 试验方法2.2.1 羟自由基的测定常温下过氧化氢基本不能氧化玫瑰桃红R褪色,当加入Fenton试剂,产生的羟自由基很容易氧化玫瑰桃红R褪色。所有曲线最大吸收波长均在520nm处,试验选用520nm作为测定波长。3.2 酸度的影响取两支50mL比色管,加水至40mL,再分别加入2.0×10-3mol・L-1玫瑰桃红R溶液6.0mL,用0.1mol・L-1硫酸调pH为4后,向其中一支比色管中加入一定量的Fenton试剂(过氧化氢和硫酸铁溶液),另一支不加Fenton试剂,分别用水稀至刻度,同时摇匀。在室温下反应20min,以水为参比,用0.5cm比色皿,在520nm波长处分别测定加与不加Fenton试剂的吸光度(A1、A0)和吸光度差值ΔA=(A0-A1)。2.2.2 羟自由基清除率的测定分别用0.1mol・L-1硫酸溶液调节不同的pH后,按试验方法测定吸光度。结果表明:当体系的起始pH为4时,ΔA最大。选用体系的起始pH为4的硫酸体系。3.3 玫瑰桃红R溶液用量的选择试验结果表明:随着玫瑰桃红R溶液用量的增加,ΔA值增大,当用量超过5.5mL以后,ΔA值不再增加。试验选用2.0×10-3mol・L-1玫瑰桃红R溶液6.0mL。・853・
理化检验-化学分册3.4 过氧化氢和Fe2+对羟自由基测定的干扰张东等:褪色光度法测定羟自由基及常见食物的抗氧化活性按试验方法,调pH为4后,分别加入不同量的过氧化氢溶液或不同量的Fe2+,室温下反应20min,测定吸光度。结果表明:0.05mol・L-1过氧化氢溶液0.4mL以内,吸光度不发生变化,用量过多,过氧化氢可以把玫瑰桃红R氧化。而Fe2+单独存在时不与玫瑰桃红R反应。为了避免过氧化氢对测定的干扰,0.05mol・L-1过氧化氢溶液用量应控制在0.4mL以内。3.5 [H2O2]/[Fe2+]摩尔比对羟自由基产量的影响取0.05mol・L过氧化氢溶液0.2mL,分别加入不同量的Fe2+,当[H2O2]/[Fe2+](摩尔比)为1～3时,羟自由基产率高。3.6 反应温度与反应时间的影响取三份40mL蒸馏水,分别加入玫瑰桃红R溶液,调pH为4后,向其中一份加入过氧化氢溶液0.2mL;一份加入过氧化氢溶液0.2mL和Fe2+溶液0.5mL;第三份不加。在不同反应温度下反应,结果表明:温度越高,反应速度越快,但温度超过60℃,过氧化氢与玫瑰桃红R反应速度加快,干扰测定,室温下20min反应完全。试验选择在室温下反应20min测定。3.7 稳定性和精密度按试验方法,反应20min后,室温下放置不同时间,ΔA在2h内保持不变(未做上限)。对过氧化氢初始浓度为0.01mmoL・L,[H2O2]/[Fe](摩尔比)为2的溶液测定11次,RSD为1.1%。3.8 线性范围和检出限由于在Fenton反应中,反应物过氧化氢与产物・OH的物质的量比为1∶1,因此,可用过氧化氢的浓度与ΔA值的线性关系表示羟自由基的量与ΔA值的线性关系。回归方程为:ΔA=-0.0169+1876.666C(r=0.9939),线性范围为0.015mmol・L-1以内。-12+-11.硫脲(Thiourea) 2.苯甲酸(Benzoicacid)3.抗坏血酸(Ascorbicacid)图2 抗氧化剂与清除率的量效关系Fig.2 Relationshipbetweenantioxidantandscavengingrate量效关系,本方法可用于筛选羟自由基清除剂及其清除羟自由基机理的研究。4.2 天然食物对羟自由基的清除作用按试验方法,分别测定了几种常见食物纯水浸泡提取液对羟自由基的清除率,结果见表1。表1 多种常见食物对羟自由基的清除率的测定值Tab.1 Valuesofrateofscavengingof16kindsoffoodstuffsagainsthydroxylfreeradical食物名称Nameoffoodstuff清除率ScavengingrateF/%20.769.310.540.661.042.09.36.2食物名称Nameoffoodstuff清除率ScavengingrateF/%68.19.624.519.36.83.73.58.6花生核桃黄豆生姜黑芝麻紫皮蒜胡萝卜青椒菠菜番茄油菜香菜茄子黄瓜大白菜香菇参考文献:[1] cessandtheoriesofaging[J].AnnClinLabSci,1995,25(1):1212.[2] AmesBN,ShigenagaMK,ts,antioxidants,andthedegenerativediseaseofaging[J].ProcNatlAcadSciUSA,1993,90(17):791527922.[3] dicalsandantioxidants:apersonalview[J].NutrRev,1994,52(8):2532265.[4] 从建波,孙存普,莫简.自旋捕集短寿命自由基的低温方法检出限为5.734×10-6mol・L-1。4 羟自由基清除剂的作用4.1 常用羟自由基清除剂的作用抗坏血酸、苯甲酸和硫脲都是常用的羟自由基清除剂[14],检测此三种物质对羟自由基的清除率以反证本法有效性(图2)。用本法检测抗氧化剂清除羟自由基均有明显的・854・保存[J].生物化学与生物物理进展,1993,20(4):3262327.(下转第857页)
理化检验-化学分册表3 两种方法测定样品中钾和钠的结果比较Tab.3 Comparisonofresultsofdeterminationofpotassiumcontentandsodiumcontentinboratesamplesbyflamephotometry(FP)andatomicabsorptionspectrometry(AAS)张金平等:差示火焰光度法测定硼酸盐中钾和钠2.4 加标回收试验分别对钾和钠进行样品加标回收试验,测定结果见表4。参考文献:-[1] 曹吉林,白鹏,王世昌.25℃Na+,K+//Cl-,SO242原子吸收光谱法测定值样品SamplesFoundbyAASρ/(mg・L-1)K1#2#3#4#5#火焰光度法测定值FoundbyFPρ/(mg・L-1)K45.5044.7543.7545.2543.00Na50.0030.7034.7041.70相对误差Relativeerror/%K-2.67Na3.09H3BO32H2O体系相平衡研究[J].海湖盐与化工,1998,21(4):25.[2] 桑世华,唐明林,殷辉安,等.298K时KCl2K2CO32K2B4O72H2O相平衡及平衡液相物化性质的研究[J].Na48.5031.9035.4040.7046.7544.1045.4045.9042.201.47-3.76-3.63-1.98-1.421.90[8]四川大学学报:工程科学版,2001,33(6):60.[3] 桑世华,唐明林,殷辉安,等.Na2B4O72K2B4O72H2O三2.46元体系288K相平衡研究[J].海湖盐与化工,2001,31(1):17.--[4] 桑世华,唐明林,殷辉安,等.Li+(K+)/CO2,B4O2372误差绝对值≤3.76%,由t检验和F检验也可知,t
2024年2月24日发(作者：英正平)
理化检验-化学分册PTCA(PARTB:.)2007年第43卷10工作简报褪色光度法测定羟自由基及常见食物的抗氧化活性张 东,刘志江,高俊杰,余 萍(沈阳理工大学环境与化学工程学院,沈阳110168)摘 要:在用稀硫酸调节至pH4的溶液中,生物染色剂玫瑰桃红R能被由Fenton反应产生的羟自由基(・OH)氧化而褪色。根据在520nm波长处所测得的吸光度的消褪的程度(ΔA=A0-A1),实现了羟自由基存在量的光度测定,应用此方法还测定了自由基消除率,作为选择清除剂的判据;还测定了几种常见食品的抗氧化活性。从方法的操作和所测得的结果证明该方法具有操作简单、方便且稳定而经济。关键词:褪色光度法;羟自由基;抗氧化活性;食品中图分类号:O657.3 文献标识码:A 文章编号:100124020(203Color2FadingPhotometricDeterminationofHydroxylFreeRadicalandAnti2OxidationActivityofSomeCommonFoodstuffsZHANGDong,LIUZhi2jiang,GAOJun2jie,YUPing(CollegeofEnvironmentalandChemicalEngineering,ShenyangUniversityofScienceandEngineering,Shenyang110168,China)Abstract:InasolutionofpH4adjustedwithdil.H2SO4,bordeauxredwasoxidizedanddecolorizedbyhydroxylfreeradical(・OH)uringthemagnitudeofintensityofcolor2fading(ΔA=A0-A1)atthewavelengthof520nm,theamountof・posedmethodwasalsousedtodeterminedtheanti2oxidationactivityandusedavengingratesortheanti2oxidationactivityofsomecommonfoodstuffsweredeterminedbythismethod,whichwasprovedtobequitesimple,stable,ds:Color2fadingphotometry;Hydroxylfreeradical;Anti2oxidationactivity;Foodstuff 羟自由基是一种氧化能力很强的自由基,生物体内的羟自由基可使糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂肪类发生氧化[123]。对羟自由基的研究在生命科学、环境和食品科学领域中受到了广泛的重视,而测定羟自由基和筛选抗羟自由基氧化物质是一项重要内容。目前,离体检测羟自由基方法有电子共振自旋捕集法(ESR)[4]、化学发光法[5]、高效液相色谱法[6]、荧光法[7,8]、电化学法[9]等。这些方法有的操收稿日期:2006207216作者简介:张东(1974-),男,满族,吉林伊通人,工程师,主要 从事仪器分析和环境监测工作。作复杂,有的仪器试剂特殊或昂贵,使其应用受到了限制。分光光度法以其仪器价格低廉、操作简便而被广泛应用,用于羟自由基测定研究已有报道[10212]。试验发现:在一定条件下,玫瑰桃红R能被羟自由基氧化而褪色,而且褪色程度(ΔA)与羟自由基的量在一定范围内呈正比关系,据此建立了测定羟自由基的方法。并应用于测定食物水提取液对羟自由基的清除率。该方法操作简便,灵敏度较高,稳定性好,可作为一种筛选羟自由基清除剂的方法,有较高的推广应用价值。・852・
理化检验-化学分册张东等:褪色光度法测定羟自由基及常见食物的抗氧化活性1 方法原理由玫瑰桃红R可以看出,生色基-N=N-与两个萘环组成的大共轭体系是生色基团,其最大吸收波长为520nm左右。当加入过氧化氢和Fe2+时,过氧化氢和Fe2+发生Fenton反应,产生羟自由基,羟自由基是一种很强的亲电试剂,它进攻玫瑰桃红R的大共轭体系,使-N=N-和萘酚基之间的键断裂[13],大共轭体系受到破坏,在520nm波长处的吸收峰消失。通过测定玫瑰桃红R在520nm波长处的吸光度的变化,可间接测定出羟自由基的生成量。反应机理如下:按2.2.1步骤操作,在调pH为4后,向其中一支比色管中加入羟自由基清除剂,再分别加入等量的Fenton试剂,定容,摇匀。室温下反应20min后,分别测定吸光度,加羟自由基清除剂的溶液的吸光度记为A2。羟自由基清除率(F)按下式计算:F=A2-A1×100%A0-A12.2.3 食物中水提取物清除羟自由基能力的测定称取天然食物10.00g,捣碎,加入蒸馏水100mL,匀浆,密塞浸泡4h后,离心分离,移取上清液1.00mL测定。3 结果与讨论3.1 吸收光谱曲线按试验方法,分别扫描吸收光谱曲线,见图1。2 试验部分2.1 仪器与试剂7562MC紫外2可见分光光度计;pHS23C型酸1.玫瑰桃红R溶液(Bordeaux2Red) 2.1+0.005mmolFe2+3.1+0.01mmolH2O24.1+0.005mmolFe2++0.01mmolH2O25.1+0.01mmolFe2++0.02mmolH2O26.0.01mmolFe2++0.02mmolH2O2度计。玫瑰桃红R溶液:2.0×10-3mol・L-1;硫酸溶)标准溶液:0.01mol・液:0.1mol・L-1;铁(ⅡL-1(现用现配);过氧化氢溶液:0.05mol・L-1过氧化图1 吸收光谱Fig.1 Absorptionspectra氢配制,用KMnO4标准溶液标定,2～8℃冰箱内保存;抗坏血酸、苯甲酸和硫脲溶液的浓度均为0.01mol・L-1。试剂均为分析纯,水为蒸馏水。2.2 试验方法2.2.1 羟自由基的测定常温下过氧化氢基本不能氧化玫瑰桃红R褪色,当加入Fenton试剂,产生的羟自由基很容易氧化玫瑰桃红R褪色。所有曲线最大吸收波长均在520nm处,试验选用520nm作为测定波长。3.2 酸度的影响取两支50mL比色管,加水至40mL,再分别加入2.0×10-3mol・L-1玫瑰桃红R溶液6.0mL,用0.1mol・L-1硫酸调pH为4后,向其中一支比色管中加入一定量的Fenton试剂(过氧化氢和硫酸铁溶液),另一支不加Fenton试剂,分别用水稀至刻度,同时摇匀。在室温下反应20min,以水为参比,用0.5cm比色皿,在520nm波长处分别测定加与不加Fenton试剂的吸光度(A1、A0)和吸光度差值ΔA=(A0-A1)。2.2.2 羟自由基清除率的测定分别用0.1mol・L-1硫酸溶液调节不同的pH后,按试验方法测定吸光度。结果表明:当体系的起始pH为4时,ΔA最大。选用体系的起始pH为4的硫酸体系。3.3 玫瑰桃红R溶液用量的选择试验结果表明:随着玫瑰桃红R溶液用量的增加,ΔA值增大,当用量超过5.5mL以后,ΔA值不再增加。试验选用2.0×10-3mol・L-1玫瑰桃红R溶液6.0mL。・853・
理化检验-化学分册3.4 过氧化氢和Fe2+对羟自由基测定的干扰张东等:褪色光度法测定羟自由基及常见食物的抗氧化活性按试验方法,调pH为4后,分别加入不同量的过氧化氢溶液或不同量的Fe2+,室温下反应20min,测定吸光度。结果表明:0.05mol・L-1过氧化氢溶液0.4mL以内,吸光度不发生变化,用量过多,过氧化氢可以把玫瑰桃红R氧化。而Fe2+单独存在时不与玫瑰桃红R反应。为了避免过氧化氢对测定的干扰,0.05mol・L-1过氧化氢溶液用量应控制在0.4mL以内。3.5 [H2O2]/[Fe2+]摩尔比对羟自由基产量的影响取0.05mol・L过氧化氢溶液0.2mL,分别加入不同量的Fe2+,当[H2O2]/[Fe2+](摩尔比)为1～3时,羟自由基产率高。3.6 反应温度与反应时间的影响取三份40mL蒸馏水,分别加入玫瑰桃红R溶液,调pH为4后,向其中一份加入过氧化氢溶液0.2mL;一份加入过氧化氢溶液0.2mL和Fe2+溶液0.5mL;第三份不加。在不同反应温度下反应,结果表明:温度越高,反应速度越快,但温度超过60℃,过氧化氢与玫瑰桃红R反应速度加快,干扰测定,室温下20min反应完全。试验选择在室温下反应20min测定。3.7 稳定性和精密度按试验方法,反应20min后,室温下放置不同时间,ΔA在2h内保持不变(未做上限)。对过氧化氢初始浓度为0.01mmoL・L,[H2O2]/[Fe](摩尔比)为2的溶液测定11次,RSD为1.1%。3.8 线性范围和检出限由于在Fenton反应中,反应物过氧化氢与产物・OH的物质的量比为1∶1,因此,可用过氧化氢的浓度与ΔA值的线性关系表示羟自由基的量与ΔA值的线性关系。回归方程为:ΔA=-0.0169+1876.666C(r=0.9939),线性范围为0.015mmol・L-1以内。-12+-11.硫脲(Thiourea) 2.苯甲酸(Benzoicacid)3.抗坏血酸(Ascorbicacid)图2 抗氧化剂与清除率的量效关系Fig.2 Relationshipbetweenantioxidantandscavengingrate量效关系,本方法可用于筛选羟自由基清除剂及其清除羟自由基机理的研究。4.2 天然食物对羟自由基的清除作用按试验方法,分别测定了几种常见食物纯水浸泡提取液对羟自由基的清除率,结果见表1。表1 多种常见食物对羟自由基的清除率的测定值Tab.1 Valuesofrateofscavengingof16kindsoffoodstuffsagainsthydroxylfreeradical食物名称Nameoffoodstuff清除率ScavengingrateF/%20.769.310.540.661.042.09.36.2食物名称Nameoffoodstuff清除率ScavengingrateF/%68.19.624.519.36.83.73.58.6花生核桃黄豆生姜黑芝麻紫皮蒜胡萝卜青椒菠菜番茄油菜香菜茄子黄瓜大白菜香菇参考文献:[1] cessandtheoriesofaging[J].AnnClinLabSci,1995,25(1):1212.[2] AmesBN,ShigenagaMK,ts,antioxidants,andthedegenerativediseaseofaging[J].ProcNatlAcadSciUSA,1993,90(17):791527922.[3] dicalsandantioxidants:apersonalview[J].NutrRev,1994,52(8):2532265.[4] 从建波,孙存普,莫简.自旋捕集短寿命自由基的低温方法检出限为5.734×10-6mol・L-1。4 羟自由基清除剂的作用4.1 常用羟自由基清除剂的作用抗坏血酸、苯甲酸和硫脲都是常用的羟自由基清除剂[14],检测此三种物质对羟自由基的清除率以反证本法有效性(图2)。用本法检测抗氧化剂清除羟自由基均有明显的・854・保存[J].生物化学与生物物理进展,1993,20(4):3262327.(下转第857页)
理化检验-化学分册表3 两种方法测定样品中钾和钠的结果比较Tab.3 Comparisonofresultsofdeterminationofpotassiumcontentandsodiumcontentinboratesamplesbyflamephotometry(FP)andatomicabsorptionspectrometry(AAS)张金平等:差示火焰光度法测定硼酸盐中钾和钠2.4 加标回收试验分别对钾和钠进行样品加标回收试验,测定结果见表4。参考文献:-[1] 曹吉林,白鹏,王世昌.25℃Na+,K+//Cl-,SO242原子吸收光谱法测定值样品SamplesFoundbyAASρ/(mg・L-1)K1#2#3#4#5#火焰光度法测定值FoundbyFPρ/(mg・L-1)K45.5044.7543.7545.2543.00Na50.0030.7034.7041.70相对误差Relativeerror/%K-2.67Na3.09H3BO32H2O体系相平衡研究[J].海湖盐与化工,1998,21(4):25.[2] 桑世华,唐明林,殷辉安,等.298K时KCl2K2CO32K2B4O72H2O相平衡及平衡液相物化性质的研究[J].Na48.5031.9035.4040.7046.7544.1045.4045.9042.201.47-3.76-3.63-1.98-1.421.90[8]四川大学学报:工程科学版,2001,33(6):60.[3] 桑世华,唐明林,殷辉安,等.Na2B4O72K2B4O72H2O三2.46元体系288K相平衡研究[J].海湖盐与化工,2001,31(1):17.--[4] 桑世华,唐明林,殷辉安,等.Li+(K+)/CO2,B4O2372误差绝对值≤3.76%,由t检验和F检验也可知,t