2024年3月1日发(作者：蔡如仪)
用16S rDNA方法鉴定细菌种属
一、实验目的
1. 掌握16S rDNA对细菌进行分类的原理及方法；
2. 掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。
二、实验原理
随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，仅几十bp，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分子量太大，分析较困难。而16S rRNA相对分子量在2kb左右，较为适合PCR扩增，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16SrRNA的编码基因是16SrDNA，但是要直接将16SrRNA提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase降解，因而利用16S rDNA鉴定细菌，其技术路线如下：
细菌培养液
DNA提取
基因组DNA
连接克隆载体
PCR扩增
16S rDNA片段
阳性克隆鉴定
片段回收
测 序
细菌基因组的提取：
菌体破碎
PCR的基本原理 ：
变性、退火、延伸
胞内可溶物质
分离出DNA 纯化DNA
二、操作步骤
1、细菌基因组DNA提取；
2、PCR扩增；
3、细菌基因组DNA及PCR产物的电泳检测；
4、扩增片段回收；
5、DNA片段测序。
三、结果处理与分析
在回收扩增片段时，紫外灯下条带呈现绿色荧光，将凝胶中绿色荧光部分切割分离出来，放入已称重的2ml离心管中，空的离心管为1.02g，放入回收的凝胶后为1.42g，，则凝胶为400mg，因此加入的Binding Buffer为1200μl。
我们小组选用B3 16S sequence，以下为制作进化树过程：
1、访问网址/，进入以下界面：
2、点击BLAST链接，进入如下界面：
3、点击nucleotide blast链接，进入如下界面：
4、将B3 16S sequence复制到上图所示的输入框内，并将Choose Search Set中的Database选择Others，如下图所示：
5、点击该网页下面的BLAST链接：
进入如下界面：
一会后，上图所示界面自动跳为如下界面：
6、在该界面下面所示的序列中勾选合适的序列
7、勾选合适的序列后，点击Get selected sequences链接，进入如下界面：
8、勾选15个结果，点击send to后Create File，文件格式设置为FASTA，如下图所示：
9、用MEGA-4.0软件打开上述下载后的sequence文件，如下图所示：
10、将未知序列B3导入
11、修改未知序列名称
12、点击Alignment——Align by ClustalW对所有序列进行比对排序，如下图所示：
13、删除前端和末端相对于B3多余的碱基序列，结果如下图所示：
14、点击data——Export Alignment——MEGA Format,将文件保存为MEG格式。中间出现如下弹窗时选择NO：
15、用MEGA-4.0软件打开上述MEG格式文件，点击Phylogeny——Bootstrap Test of
Phylogeny——Neighbor-Joining,如下图所示：
出现如下对话框
16、点击Phylogeny Test and options行右侧的绿色方框，在弹出的对话框中将Replications设置为1000，点击左下角的键，如下图所示：
17、点击Model行右侧的绿色方框，Nucleotide。点击Compute键，构建进化树如下图所示：
18、结论：
分析所绘制的进化树可以推论：B3菌株可能为Staphylococcus（葡萄球菌）。
电泳图谱：
2024年3月1日发(作者：蔡如仪)
用16S rDNA方法鉴定细菌种属
一、实验目的
1. 掌握16S rDNA对细菌进行分类的原理及方法；
2. 掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。
二、实验原理
随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，仅几十bp，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分子量太大，分析较困难。而16S rRNA相对分子量在2kb左右，较为适合PCR扩增，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16SrRNA的编码基因是16SrDNA，但是要直接将16SrRNA提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase降解，因而利用16S rDNA鉴定细菌，其技术路线如下：
细菌培养液
DNA提取
基因组DNA
连接克隆载体
PCR扩增
16S rDNA片段
阳性克隆鉴定
片段回收
测 序
细菌基因组的提取：
菌体破碎
PCR的基本原理 ：
变性、退火、延伸
胞内可溶物质
分离出DNA 纯化DNA
二、操作步骤
1、细菌基因组DNA提取；
2、PCR扩增；
3、细菌基因组DNA及PCR产物的电泳检测；
4、扩增片段回收；
5、DNA片段测序。
三、结果处理与分析
在回收扩增片段时，紫外灯下条带呈现绿色荧光，将凝胶中绿色荧光部分切割分离出来，放入已称重的2ml离心管中，空的离心管为1.02g，放入回收的凝胶后为1.42g，，则凝胶为400mg，因此加入的Binding Buffer为1200μl。
我们小组选用B3 16S sequence，以下为制作进化树过程：
1、访问网址/，进入以下界面：
2、点击BLAST链接，进入如下界面：
3、点击nucleotide blast链接，进入如下界面：
4、将B3 16S sequence复制到上图所示的输入框内，并将Choose Search Set中的Database选择Others，如下图所示：
5、点击该网页下面的BLAST链接：
进入如下界面：
一会后，上图所示界面自动跳为如下界面：
6、在该界面下面所示的序列中勾选合适的序列
7、勾选合适的序列后，点击Get selected sequences链接，进入如下界面：
8、勾选15个结果，点击send to后Create File，文件格式设置为FASTA，如下图所示：
9、用MEGA-4.0软件打开上述下载后的sequence文件，如下图所示：
10、将未知序列B3导入
11、修改未知序列名称
12、点击Alignment——Align by ClustalW对所有序列进行比对排序，如下图所示：
13、删除前端和末端相对于B3多余的碱基序列，结果如下图所示：
14、点击data——Export Alignment——MEGA Format,将文件保存为MEG格式。中间出现如下弹窗时选择NO：
15、用MEGA-4.0软件打开上述MEG格式文件，点击Phylogeny——Bootstrap Test of
Phylogeny——Neighbor-Joining,如下图所示：
出现如下对话框
16、点击Phylogeny Test and options行右侧的绿色方框，在弹出的对话框中将Replications设置为1000，点击左下角的键，如下图所示：
17、点击Model行右侧的绿色方框，Nucleotide。点击Compute键，构建进化树如下图所示：
18、结论：
分析所绘制的进化树可以推论：B3菌株可能为Staphylococcus（葡萄球菌）。
电泳图谱：