2024年3月8日发(作者：罕小翠)

实习三：系统发育分析-MEGA

一、实验目的

1.学会使用MEGA软件构建进化树。

2.了解如何分析构树结果，体会各种方法的差异。

二、实验内容

MEGA网址：/

（1）安装软件

下载MEGA5程序,按照默认将程序安装到自己的计算机。

（2）生成多条序列比对文件

点击开始－MEGA5－MEGA，启动程序。

点击Align图标-Edit/Build a Alignment，出现对话框有三个选项(Figure 2)。如果你手头有比对好的mas格式的文件，选择第２个选项Open a saved alignment session,否则,选择１（创建新的比对）或3(从文件输入序列)。

这里我们先选择第一个选项,点击OK。然后出现对话框，询问你的序列类型，如果是核酸序列，点击DNA。如果是蛋白质序列，选择Protein。如果不输入序列，选择Cancel(Figure 3)。

选择DNA（或Protein），出现新窗口Alignment Explorer,点主菜单Data-open-retrieve sequences

from file。

输入要比对的序列

选择序列文件（所有序列fasta格式，保存到一个文本文件txt中，改扩展名为 .fas）,打开，文件中的序列出现在窗口中（Figure 5）。

比对结果页面

点击Data-Export Alignment-MEGA Format，保存比对结果。然后点击Data-Exit AlnExplorer，程序询问是否要要保存现在的比对结果，已经保存过，点击否。

（3）进化树构建

点击主菜单File-Open a File/session，选择刚保存的meg文件（Figure 10），主窗口出现所选择文件的图标。

Figure 10 选择多条序列比对结果文件

Figure 11 选择成功后的页面

点击phylogeny图标，选择建树方法，共有五种方法可供选择：MLE, NJ, ME, UPGMA, MP。选择其中的一种（Figure 12）。

Figure 12 选择建树方法

出现窗口询问是否用刚激活的数据进行建树，点击Yes(Figure 13)。出现建树参数界面（Figure

14），黄色的部分参数都可以根据情况进行更改，选择的建树方法不同，参数选择界面会有所不同。

Figure 13 序列选择页面

Figure 14建树参数选择

若询问序列类型时选择Protein，则Figure 14中的Substitutions Type选择Amino acid。

点击Compute，进行分析，稍等片刻，出现构建好的进化树(Figure 15)。

Figure 15 生成进化树

MEGA生成的树可以直接复制、粘贴，不需截图软件处理（Figure 16）。

Figure 16 保存进化树图片到剪贴板

点击Figure 16中View-Tree/Branch Style-Radiation，可将Rectangular保存为无根图。

（4）再用其它四种方法进行进化树构建，步骤基本相同。

三、作业

利用前面实习搜索到的五个以上物种的直系同源核酸和蛋白质序列，用MEGA软件提供的五种建树方法分别构建进化树，简要说明操作步骤，分析核酸和蛋白质序列采用不同建树方法得到；的进化树有何异同。

作业 ：

直系同源核酸序列（Orthologous nucleic acid sequence）：

>Homo gi|71834858|ref|NM_001030050.1| Homo sapiens kallikrein-related peptidase 3 (KLK3),

transcript variant 6, mRNA

>Gorilla gi|426391900|ref|XM_004062255.1| PREDICTED: Gorilla gorilla gorilla kunitz-type

protease inhibitor 3-like (LOC101143605), mRNA

>Scrofa gi|47523115|ref|NM_213871.1| Sus scrofa plasmin trypsin inhibitor (UPTI), mRNA

>Rattus gi|57114321|ref|NM_001008881.1| Rattus norvegicus serine peptidase inhibitor, Kunitz

type 5 (Spint5p), mRNA

>Oryctolagus gi|291411216|ref|XM_002721843.1| PREDICTED: Oryctolagus cuniculus cationic

trypsinogen-like (LOC100339353), mRNA

直系同源蛋白质序列（Orthologous protein sequence）：

>Homo gi|71834858|ref|NM_001030050.1| Homo sapiens kallikrein-related peptidase 3 (KLK3),

transcript variant 6, mRNA

>Gorilla gi|426391900|ref|XM_004062255.1| PREDICTED: Gorilla gorilla gorilla kunitz-type

protease inhibitor 3-like (LOC101143605), mRNA

>Scrofa gi|47523115|ref|NM_213871.1| Sus scrofa plasmin trypsin inhibitor (UPTI), mRNA

>Rattus gi|57114321|ref|NM_001008881.1| Rattus norvegicus serine peptidase inhibitor, Kunitz

type 5 (Spint5p), mRNA

>Oryctolagus gi|291411216|ref|XM_002721843.1| PREDICTED: Oryctolagus cuniculus cationic

trypsinogen-like (LOC100339353), mRNA

直系同源核酸序列建树：

法：

Oryctolagus

mRNAttuRasARN

msARNmfa

crogorilla

mRNA1

由系统发育树可以看出，Oryctolagus和Scrofa的亲缘关系较近，Homo和Gorilla亲缘关系较近，Scrofa除了与Oryctolagus亲缘关系较近外，与其他物种的亲缘关系均较远。其中，Oryctolagus和Scrofa的亲缘关系最近。

法：

Homo

mRNA

goARNm

rillascrofa

mRNA

Homo

mRNAARNs

mttuRaOryctolagus

mRNA1

由系统发育树可以看出，NJ方法建树与ML方法结果基本类似。Rattus和Gorilla的亲缘关系较近，Oryctolagus和Scrofa的亲缘关系较近，Scrofa除了与Oryctolagus亲缘关系较近外，与其他物种的亲缘关系均较远。其中，Oryctolagus和Scrofa的亲缘关系最近。

法：

ARNs

mttuRascrofa

mRNArigoARNmlla

Oryctolagus

mRNAHomo mRNA1

由系统发育树可以看出ME方法建树与NJ方法建树结果一致。Rattus和Gorilla的亲缘关系较近，Oryctolagus和Scrofa的亲缘关系较近，Scrofa除了与Oryctolagus亲缘关系较近外，与其他物种的亲缘关系均较远。其中，Oryctolagus和Scrofa的亲缘关系最近。

法：

mRNARattusroscNARmfa

Oryctolagus mRNAHomo

mRNA43210

由系统发育树可以看出UPGMA方法建树结果与其他方法建树结果差异较大。Rattus和Gorilla的亲缘关系较近，Oryctolagus和Scrofa的亲缘关系较近。Gorilla除了与Rattus亲缘关系较近外，与其他物种亲缘关系较远。

法：

Homo mRNA gorilla mRNA Rattus mRNA scrofa mRNA Oryctolagus mRNA

直系同源蛋白质序列建树：

法：

Oryctolagus mRNAHomo

mRNARNAm

sttuRaNAmRilla

gorARN

mofascr20

由系统发育树可以看出，Oryctolagus和Homo的亲缘关系较近，Gorilla和Scrofa的亲缘关系较近，Oryctolagus除了与Homo亲缘关系较近外，与其他物种的亲缘关系均较远。其中，Oryctolagus和Homo亲缘关系最近。

法：

RNARattus

mo

mHomRNAgorilla mRNAscARNa

mrofRNA

m0.5us

Ocryltoag

由系统发育树可以看出ML方法建树与NJ方法建树结果一致。Rattus和Gorilla的亲缘关系较近，Oryctolagus和Scrofa的亲缘关系较近，Scrofa除了与Oryctolagus亲缘关系较近外，与其他物种的亲缘关系均较远。其中，Oryctolagus和Scrofa的亲缘关系最近。

法：

RNARattus

mo

mHomRNAgorilla mRNAOltocrysARNm

facro

musgaRNA0.5

由系统发育树可以看出ME方法建树结果与NJ，ML方法建树结果基

本一致。Rattus和Gorilla的亲缘关系较近，Oryctolagus和Scrofa的亲缘关系较近，Scrofa除了与Oryctolagus亲缘关系较近外，与其他物种的亲缘关系均较远。其中，Oryctolagus和Scrofa的亲缘关系最近。

法：

Homo

mRNAscroNARmfa

lagusOrycto

mRNAgorilla

mRNARattus

mRNA0.0

1.41.21.00.80.60.40.2

由系统发育树可以看出，Scrofa和Homo的亲缘关系较近，Rattus和Gorilla亲缘关系较近，Homo除了与Scrofa亲缘关系较近外，与其他物种的亲缘关系均较远。其中，Scrofa和Homo的亲缘关系最近。

法：

gorilla mRNA Rattus mRNA Homo mRNA scrofa mRNA Oryctolagus mRNA

此法不能做无根树。

建树方法差异分析：

同源直系核酸序列构建系统发育树差异较大，而同源直系蛋白质序列构建的系统发育树差异较小。各种建树方法中，ME方法和NJ方法构建的系统发育树较为类似。UPGMA方法与其他方法差异较大。ML是通过概率计算来找到最能反映一组序列中变异的系统树，它采用标准的概率模型分析序列中的各种变异。NJ用一个自下而上的聚类方法创建表现型树，该法要求知识的分类（例如，物种或序列），以形成树群每对之间的距离。UPGMA采用序列的聚类算法，使用群集与未加权对组法对集团与算术平均构建距离树，是构造树最简单的方法。

2024年3月8日发(作者：罕小翠)

实习三：系统发育分析-MEGA

一、实验目的

1.学会使用MEGA软件构建进化树。

2.了解如何分析构树结果，体会各种方法的差异。

二、实验内容

MEGA网址：/

（1）安装软件

下载MEGA5程序,按照默认将程序安装到自己的计算机。

（2）生成多条序列比对文件

点击开始－MEGA5－MEGA，启动程序。

点击Align图标-Edit/Build a Alignment，出现对话框有三个选项(Figure 2)。如果你手头有比对好的mas格式的文件，选择第２个选项Open a saved alignment session,否则,选择１（创建新的比对）或3(从文件输入序列)。

这里我们先选择第一个选项,点击OK。然后出现对话框，询问你的序列类型，如果是核酸序列，点击DNA。如果是蛋白质序列，选择Protein。如果不输入序列，选择Cancel(Figure 3)。

选择DNA（或Protein），出现新窗口Alignment Explorer,点主菜单Data-open-retrieve sequences

from file。

输入要比对的序列

选择序列文件（所有序列fasta格式，保存到一个文本文件txt中，改扩展名为 .fas）,打开，文件中的序列出现在窗口中（Figure 5）。

比对结果页面

点击Data-Export Alignment-MEGA Format，保存比对结果。然后点击Data-Exit AlnExplorer，程序询问是否要要保存现在的比对结果，已经保存过，点击否。

（3）进化树构建

点击主菜单File-Open a File/session，选择刚保存的meg文件（Figure 10），主窗口出现所选择文件的图标。

Figure 10 选择多条序列比对结果文件

Figure 11 选择成功后的页面

点击phylogeny图标，选择建树方法，共有五种方法可供选择：MLE, NJ, ME, UPGMA, MP。选择其中的一种（Figure 12）。

Figure 12 选择建树方法

出现窗口询问是否用刚激活的数据进行建树，点击Yes(Figure 13)。出现建树参数界面（Figure

14），黄色的部分参数都可以根据情况进行更改，选择的建树方法不同，参数选择界面会有所不同。

Figure 13 序列选择页面

Figure 14建树参数选择

若询问序列类型时选择Protein，则Figure 14中的Substitutions Type选择Amino acid。

点击Compute，进行分析，稍等片刻，出现构建好的进化树(Figure 15)。

Figure 15 生成进化树

MEGA生成的树可以直接复制、粘贴，不需截图软件处理（Figure 16）。

Figure 16 保存进化树图片到剪贴板

点击Figure 16中View-Tree/Branch Style-Radiation，可将Rectangular保存为无根图。

（4）再用其它四种方法进行进化树构建，步骤基本相同。

三、作业

利用前面实习搜索到的五个以上物种的直系同源核酸和蛋白质序列，用MEGA软件提供的五种建树方法分别构建进化树，简要说明操作步骤，分析核酸和蛋白质序列采用不同建树方法得到；的进化树有何异同。

作业 ：

直系同源核酸序列（Orthologous nucleic acid sequence）：

>Homo gi|71834858|ref|NM_001030050.1| Homo sapiens kallikrein-related peptidase 3 (KLK3),

transcript variant 6, mRNA

>Gorilla gi|426391900|ref|XM_004062255.1| PREDICTED: Gorilla gorilla gorilla kunitz-type

protease inhibitor 3-like (LOC101143605), mRNA

>Scrofa gi|47523115|ref|NM_213871.1| Sus scrofa plasmin trypsin inhibitor (UPTI), mRNA

>Rattus gi|57114321|ref|NM_001008881.1| Rattus norvegicus serine peptidase inhibitor, Kunitz

type 5 (Spint5p), mRNA

>Oryctolagus gi|291411216|ref|XM_002721843.1| PREDICTED: Oryctolagus cuniculus cationic

trypsinogen-like (LOC100339353), mRNA

直系同源蛋白质序列（Orthologous protein sequence）：

>Homo gi|71834858|ref|NM_001030050.1| Homo sapiens kallikrein-related peptidase 3 (KLK3),

transcript variant 6, mRNA

>Gorilla gi|426391900|ref|XM_004062255.1| PREDICTED: Gorilla gorilla gorilla kunitz-type

protease inhibitor 3-like (LOC101143605), mRNA

>Scrofa gi|47523115|ref|NM_213871.1| Sus scrofa plasmin trypsin inhibitor (UPTI), mRNA

>Rattus gi|57114321|ref|NM_001008881.1| Rattus norvegicus serine peptidase inhibitor, Kunitz

type 5 (Spint5p), mRNA

>Oryctolagus gi|291411216|ref|XM_002721843.1| PREDICTED: Oryctolagus cuniculus cationic

trypsinogen-like (LOC100339353), mRNA

直系同源核酸序列建树：

法：

Oryctolagus

mRNAttuRasARN

msARNmfa

crogorilla

mRNA1

由系统发育树可以看出，Oryctolagus和Scrofa的亲缘关系较近，Homo和Gorilla亲缘关系较近，Scrofa除了与Oryctolagus亲缘关系较近外，与其他物种的亲缘关系均较远。其中，Oryctolagus和Scrofa的亲缘关系最近。

法：

Homo

mRNA

goARNm

rillascrofa

mRNA

Homo

mRNAARNs

mttuRaOryctolagus

mRNA1

由系统发育树可以看出，NJ方法建树与ML方法结果基本类似。Rattus和Gorilla的亲缘关系较近，Oryctolagus和Scrofa的亲缘关系较近，Scrofa除了与Oryctolagus亲缘关系较近外，与其他物种的亲缘关系均较远。其中，Oryctolagus和Scrofa的亲缘关系最近。

法：

ARNs

mttuRascrofa

mRNArigoARNmlla

Oryctolagus

mRNAHomo mRNA1

由系统发育树可以看出ME方法建树与NJ方法建树结果一致。Rattus和Gorilla的亲缘关系较近，Oryctolagus和Scrofa的亲缘关系较近，Scrofa除了与Oryctolagus亲缘关系较近外，与其他物种的亲缘关系均较远。其中，Oryctolagus和Scrofa的亲缘关系最近。

法：

mRNARattusroscNARmfa

Oryctolagus mRNAHomo

mRNA43210

由系统发育树可以看出UPGMA方法建树结果与其他方法建树结果差异较大。Rattus和Gorilla的亲缘关系较近，Oryctolagus和Scrofa的亲缘关系较近。Gorilla除了与Rattus亲缘关系较近外，与其他物种亲缘关系较远。

法：

Homo mRNA gorilla mRNA Rattus mRNA scrofa mRNA Oryctolagus mRNA

直系同源蛋白质序列建树：

法：

Oryctolagus mRNAHomo

mRNARNAm

sttuRaNAmRilla

gorARN

mofascr20

由系统发育树可以看出，Oryctolagus和Homo的亲缘关系较近，Gorilla和Scrofa的亲缘关系较近，Oryctolagus除了与Homo亲缘关系较近外，与其他物种的亲缘关系均较远。其中，Oryctolagus和Homo亲缘关系最近。

法：

RNARattus

mo

mHomRNAgorilla mRNAscARNa

mrofRNA

m0.5us

Ocryltoag

由系统发育树可以看出ML方法建树与NJ方法建树结果一致。Rattus和Gorilla的亲缘关系较近，Oryctolagus和Scrofa的亲缘关系较近，Scrofa除了与Oryctolagus亲缘关系较近外，与其他物种的亲缘关系均较远。其中，Oryctolagus和Scrofa的亲缘关系最近。

法：

RNARattus

mo

mHomRNAgorilla mRNAOltocrysARNm

facro

musgaRNA0.5

由系统发育树可以看出ME方法建树结果与NJ，ML方法建树结果基

本一致。Rattus和Gorilla的亲缘关系较近，Oryctolagus和Scrofa的亲缘关系较近，Scrofa除了与Oryctolagus亲缘关系较近外，与其他物种的亲缘关系均较远。其中，Oryctolagus和Scrofa的亲缘关系最近。

法：

Homo

mRNAscroNARmfa

lagusOrycto

mRNAgorilla

mRNARattus

mRNA0.0

1.41.21.00.80.60.40.2

由系统发育树可以看出，Scrofa和Homo的亲缘关系较近，Rattus和Gorilla亲缘关系较近，Homo除了与Scrofa亲缘关系较近外，与其他物种的亲缘关系均较远。其中，Scrofa和Homo的亲缘关系最近。

法：

gorilla mRNA Rattus mRNA Homo mRNA scrofa mRNA Oryctolagus mRNA

此法不能做无根树。

建树方法差异分析：

同源直系核酸序列构建系统发育树差异较大，而同源直系蛋白质序列构建的系统发育树差异较小。各种建树方法中，ME方法和NJ方法构建的系统发育树较为类似。UPGMA方法与其他方法差异较大。ML是通过概率计算来找到最能反映一组序列中变异的系统树，它采用标准的概率模型分析序列中的各种变异。NJ用一个自下而上的聚类方法创建表现型树，该法要求知识的分类（例如，物种或序列），以形成树群每对之间的距离。UPGMA采用序列的聚类算法，使用群集与未加权对组法对集团与算术平均构建距离树，是构造树最简单的方法。