2024年3月9日发(作者：焉曼珍)
园 艺 学 报 2008,35(2):227-232
ActaHorticulturaeSinica
病毒诱导的基因沉默在番茄组织中的特异性分析
杨迎伍,李正国,MondherBouzayen
11*2
2
(
1
重庆大学生物工程学院基因工程研究中心,重庆市功能基因及调控技术重点实验室,重庆400044;
INRA/INP-ENSA果实基因组及生物技术实验室,法国图卢兹31326)
UMR990
摘 要:病毒诱导的基因沉默(VIGS)是植物基因功能研究的新技术。以组成型表达gusA基因的转
基因番茄为材料,通过VIGS技术沉默gusA基因,对VIGS在番茄中的组织特异性进行了初步分析。结果
表明,VIGS技术能有效地诱导gusA基因在番茄植株的叶片、花、果实、侧枝、主茎及茎分枝点等部位和
组织中沉默,证明VIGS在番茄中具有较强的系统性沉默特征。
关键词:番茄;病毒诱导的基因沉默;基因功能;组织特异性;烟草脆裂病毒
中图分类号:S64112 文献标识码:A 文章编号:0513-353X(2008)02-0227-06
TissueSpecificityAnalysisofVirus-inducedGeneSilencinginTomato
YANGYing-wu,LIZheng-guo,andMondherBouzayen
11*2
(
1
KeyLaboratoryofFunctionalGeneandRegulationTechnologiesofChongqing,GeneticEngineeringResearchCenter,Bio-Engi-
neeringCollege,ChongqingUniversity,Chongqing400044,China;
2
UMR990INRA/INP-ENSAToulouseGenomiqueetBiotech-
nologiedesFruits,AvdelpAgrobiopole,BP32607,31326Castanet-TolosanCedex,France)
Abstract:Virus-inducedgenesilencing(VIGS)isarecentlydevelopedtechniqueforgenefunction
study,thegusAtransgenictomatoplantwhichconstitutivelyexpressedgusAgenewas
sAgenewassilencedbyVIGSforthepreliminarytissuespecificityanalysisofVIGS
ultsshowedthatgusAcouldbesilencedinleaves,flowers,fruits,branches,stemsandthe
,asapowerfultoolforthe
studyofgenefunction,couldinducetargetgenesystematicsilencingintomato.
Keywords:tomato;virus-inducedgenesilencing;genefunction;tissuespecificity;Tobaccorattlevirus
病毒诱导的基因沉默(virus-inducedgenesilencing,VIGS)是近年来发现的一种转录后基因沉默
(pos-ttranscriptionalgenesilencing,PTGS)现象,可引起内源mRNA序列特异性降解(Ratcliffeta.l,
1997)。在实际工作中,如果在病毒载体中插入目标基因片段,侵染寄主植物后,植物会出现目标基
因功能丧失或表达水平下降的表型,从而确定基因功能。与其它导致基因功能缺失的研究方法(如
反义抑制、基因突变等)相比,病毒诱导的基因沉默具有研究周期短,不需要遗传转化,可在不同
遗传背景下生效以及能在不同的物种间进行基因功能快速比较等优点,是一种简单、快速、有效、高
通量的功能基因分析方法(Burch-Smitheta.l,2004;杨迎伍等,2007)。
经过短短几年的发展,VIGS技术在植物基因功能研究领域已有多例成功的应用。目前有报道揭
示VIGS能在植物的多个组织中诱导目标基因的沉默,如基于烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,
TRV)的VIGS载体能在番茄叶片(Ekengreneta.l,2003)、花(Fueta.l,2006)和果实(Fueta.l,
2005)中获得沉默效果。但关于VIGS技术在植物组织中的特异性还缺乏系统性的研究,而VIGS技
收稿日期:2007-07-10;修回日期:2007-11-01
2006BB1139)
zhengguol@icqu1edu1cn)
基金项目:国家自然科学基金项目(30600422,30471214);重庆市自然科学基金项目(CSTC,
*通讯作者Authorforcorrespondence(E-mai:l
228园 艺 学 报35卷
术在植物中的组织特异性对利用该技术研究植物基因功能具有重要的影响。
作者以组成型表达gusA基因的转基因番茄为材料,研究了VIGS在番茄组织中的特异性,以期
为VIGS技术的应用提供重要的理论依据。
1 材料与方法
111 植物材料和生长条件
组成型表达gusA基因的转基因LTom番茄(pDR3-GUS)由法国图卢兹国立理工大学UMR990实
验室MondherBouzayen教授提供。该转基因LTom番茄是以番茄DR3(developmentregulation)基因的
启动子(pDR3)来调控gusA基因的转录起始。
种子播入光照培养箱土壤中萌发,1周后转入培养室。生长条件为:温度22e,相对湿度50%,
每天光照12h。
112 质粒与菌种
病毒载体pTRV1和pTRV2质粒(Liueta.l,2002)由美国耶鲁大学-Kumar博士惠
赠。pTRV1和pTRV2分别含有TRV病毒两条链的RNA1和RNA2,其中RNA2在植物体内的复制和
转移需要RNA1的参与。
农杆菌GV3101由本实验室保存。
113 病毒载体构建
采用PCR技术从植物表达载体pBI121(GenBank登录号:AF485783)中分离出402bp的gusA
基因片段(Fprimer:5c-CTGTCGGCTTTAACCTCTCT-3c;Rprimer:5c-CTTTTTCCAGTACCTTCT
CT-3c),克隆入pGEMTEasy载体(Promega,USA),命名为pGGUS,并测序验证。用EcoRÑ
(Takara,Japan)从载体pGGUS上切下gusA基因片段,克隆入病毒载体pTRV2中,构建成目的载体
pTRV2-GUS。
质粒pTRV1、pTRV2和pTRV2-GUS采用冻融法转化入农杆菌GV3101中(王关林和方宏筠,
2002)。
114 农杆菌介导的病毒感染
参照Ekengren等(2003)的方法,含病毒载体(pTRV1、pTRV2和pTRV2-GUS)的农杆菌
GV3101通过真空渗透技术侵染苗龄为2~3周的番茄幼苗,然后移入植物培养室中,先避光培养2d,
之后在22e,相对湿度50%,每天12h光照的条件下生长。
以侵染pTRV2的幼苗为阴性对照。
115 RNA提取和RT-PCR分析
取受试番茄植株的上端嫩叶(约50mg),采用Trizol试剂盒(Invitrogen,USA)提取出总RNA,
并经不含RNase的DNase(Promega,USA)处理。
为了验证病毒是否侵染入植物体内,取1Lg总RNA,用随机引物和AMV逆转录酶(Promega,
USA)合成第一链cDNA,终体积为20LL。
设计TRV病毒的RNA1(GenBank登录号:AF406990)和RNA2(GenBank登录号:AF406991)
的特异性引物(RNA1Fprimer:5c-TTACAGGTTATTTGGGCTAG-3c,RNA1Rprimer:5c-CCGGGT
TCAATTCCTTATC-3c;RNA2Fprimer:5c-TACGACGAACCAAGGG-3c,RNA2Rprimer:5c-TGC
GAAACTCAAATGCT-3c)。
建立25LLPCR反应体系:2LLcDNA、10@PCRbuffer(含115mmol#LMgCl
2
)、200Lmol#
L
-1
-1
dNTPs和200nmol#L
-1
PCR引物;反应条件:94e30s,55e45s,72e1min,共36个循
环,最后72e延伸10min。
2024年3月9日发(作者：焉曼珍)
园 艺 学 报 2008,35(2):227-232
ActaHorticulturaeSinica
病毒诱导的基因沉默在番茄组织中的特异性分析
杨迎伍,李正国,MondherBouzayen
11*2
2
(
1
重庆大学生物工程学院基因工程研究中心,重庆市功能基因及调控技术重点实验室,重庆400044;
INRA/INP-ENSA果实基因组及生物技术实验室,法国图卢兹31326)
UMR990
摘 要:病毒诱导的基因沉默(VIGS)是植物基因功能研究的新技术。以组成型表达gusA基因的转
基因番茄为材料,通过VIGS技术沉默gusA基因,对VIGS在番茄中的组织特异性进行了初步分析。结果
表明,VIGS技术能有效地诱导gusA基因在番茄植株的叶片、花、果实、侧枝、主茎及茎分枝点等部位和
组织中沉默,证明VIGS在番茄中具有较强的系统性沉默特征。
关键词:番茄;病毒诱导的基因沉默;基因功能;组织特异性;烟草脆裂病毒
中图分类号:S64112 文献标识码:A 文章编号:0513-353X(2008)02-0227-06
TissueSpecificityAnalysisofVirus-inducedGeneSilencinginTomato
YANGYing-wu,LIZheng-guo,andMondherBouzayen
11*2
(
1
KeyLaboratoryofFunctionalGeneandRegulationTechnologiesofChongqing,GeneticEngineeringResearchCenter,Bio-Engi-
neeringCollege,ChongqingUniversity,Chongqing400044,China;
2
UMR990INRA/INP-ENSAToulouseGenomiqueetBiotech-
nologiedesFruits,AvdelpAgrobiopole,BP32607,31326Castanet-TolosanCedex,France)
Abstract:Virus-inducedgenesilencing(VIGS)isarecentlydevelopedtechniqueforgenefunction
study,thegusAtransgenictomatoplantwhichconstitutivelyexpressedgusAgenewas
sAgenewassilencedbyVIGSforthepreliminarytissuespecificityanalysisofVIGS
ultsshowedthatgusAcouldbesilencedinleaves,flowers,fruits,branches,stemsandthe
,asapowerfultoolforthe
studyofgenefunction,couldinducetargetgenesystematicsilencingintomato.
Keywords:tomato;virus-inducedgenesilencing;genefunction;tissuespecificity;Tobaccorattlevirus
病毒诱导的基因沉默(virus-inducedgenesilencing,VIGS)是近年来发现的一种转录后基因沉默
(pos-ttranscriptionalgenesilencing,PTGS)现象,可引起内源mRNA序列特异性降解(Ratcliffeta.l,
1997)。在实际工作中,如果在病毒载体中插入目标基因片段,侵染寄主植物后,植物会出现目标基
因功能丧失或表达水平下降的表型,从而确定基因功能。与其它导致基因功能缺失的研究方法(如
反义抑制、基因突变等)相比,病毒诱导的基因沉默具有研究周期短,不需要遗传转化,可在不同
遗传背景下生效以及能在不同的物种间进行基因功能快速比较等优点,是一种简单、快速、有效、高
通量的功能基因分析方法(Burch-Smitheta.l,2004;杨迎伍等,2007)。
经过短短几年的发展,VIGS技术在植物基因功能研究领域已有多例成功的应用。目前有报道揭
示VIGS能在植物的多个组织中诱导目标基因的沉默,如基于烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,
TRV)的VIGS载体能在番茄叶片(Ekengreneta.l,2003)、花(Fueta.l,2006)和果实(Fueta.l,
2005)中获得沉默效果。但关于VIGS技术在植物组织中的特异性还缺乏系统性的研究,而VIGS技
收稿日期:2007-07-10;修回日期:2007-11-01
2006BB1139)
zhengguol@icqu1edu1cn)
基金项目:国家自然科学基金项目(30600422,30471214);重庆市自然科学基金项目(CSTC,
*通讯作者Authorforcorrespondence(E-mai:l
228园 艺 学 报35卷
术在植物中的组织特异性对利用该技术研究植物基因功能具有重要的影响。
作者以组成型表达gusA基因的转基因番茄为材料,研究了VIGS在番茄组织中的特异性,以期
为VIGS技术的应用提供重要的理论依据。
1 材料与方法
111 植物材料和生长条件
组成型表达gusA基因的转基因LTom番茄(pDR3-GUS)由法国图卢兹国立理工大学UMR990实
验室MondherBouzayen教授提供。该转基因LTom番茄是以番茄DR3(developmentregulation)基因的
启动子(pDR3)来调控gusA基因的转录起始。
种子播入光照培养箱土壤中萌发,1周后转入培养室。生长条件为:温度22e,相对湿度50%,
每天光照12h。
112 质粒与菌种
病毒载体pTRV1和pTRV2质粒(Liueta.l,2002)由美国耶鲁大学-Kumar博士惠
赠。pTRV1和pTRV2分别含有TRV病毒两条链的RNA1和RNA2,其中RNA2在植物体内的复制和
转移需要RNA1的参与。
农杆菌GV3101由本实验室保存。
113 病毒载体构建
采用PCR技术从植物表达载体pBI121(GenBank登录号:AF485783)中分离出402bp的gusA
基因片段(Fprimer:5c-CTGTCGGCTTTAACCTCTCT-3c;Rprimer:5c-CTTTTTCCAGTACCTTCT
CT-3c),克隆入pGEMTEasy载体(Promega,USA),命名为pGGUS,并测序验证。用EcoRÑ
(Takara,Japan)从载体pGGUS上切下gusA基因片段,克隆入病毒载体pTRV2中,构建成目的载体
pTRV2-GUS。
质粒pTRV1、pTRV2和pTRV2-GUS采用冻融法转化入农杆菌GV3101中(王关林和方宏筠,
2002)。
114 农杆菌介导的病毒感染
参照Ekengren等(2003)的方法,含病毒载体(pTRV1、pTRV2和pTRV2-GUS)的农杆菌
GV3101通过真空渗透技术侵染苗龄为2~3周的番茄幼苗,然后移入植物培养室中,先避光培养2d,
之后在22e,相对湿度50%,每天12h光照的条件下生长。
以侵染pTRV2的幼苗为阴性对照。
115 RNA提取和RT-PCR分析
取受试番茄植株的上端嫩叶(约50mg),采用Trizol试剂盒(Invitrogen,USA)提取出总RNA,
并经不含RNase的DNase(Promega,USA)处理。
为了验证病毒是否侵染入植物体内,取1Lg总RNA,用随机引物和AMV逆转录酶(Promega,
USA)合成第一链cDNA,终体积为20LL。
设计TRV病毒的RNA1(GenBank登录号:AF406990)和RNA2(GenBank登录号:AF406991)
的特异性引物(RNA1Fprimer:5c-TTACAGGTTATTTGGGCTAG-3c,RNA1Rprimer:5c-CCGGGT
TCAATTCCTTATC-3c;RNA2Fprimer:5c-TACGACGAACCAAGGG-3c,RNA2Rprimer:5c-TGC
GAAACTCAAATGCT-3c)。
建立25LLPCR反应体系:2LLcDNA、10@PCRbuffer(含115mmol#LMgCl
2
)、200Lmol#
L
-1
-1
dNTPs和200nmol#L
-1
PCR引物;反应条件:94e30s,55e45s,72e1min,共36个循
环,最后72e延伸10min。