2024年3月13日发(作者：植炎)
刺激隐核虫PCR检测方法的建立
张新艳;樊海平;林煜;吴斌
【摘 要】Specific primers were designed based on the DNA sequence of
internal transcribed spacer 1 (ITS-1). The genomic DNA of Cryptocaryon
irritans,isolated from culturing Pseudosciaena crocea in Luoyuan of
Fujian,used as a template DNA to amplify part of the gene fragment of
ITS-1,which had a 387 bp band when electrophoresed on an agarose gel.
Then the PCR amplification products were cloned,sequenced and analyzed.
Homology comparison indicated that they shared 100% identity with the
gene sequence of CL1209 strain (KC550300 ), FD1210 (KC550302 ),
PYH4.12 strain (DQ270010 ), Wakayama strain (AB608054 ),and Chiayi
strain (AF490381 ). PCR amplification for the detection of Cryptocaryon
irritans was established,which was limited to 2 polypides,then being
applied to detect the samples of the C. irritans monitoring during the last
three years (2011-2013 ). The results were 100% conformed to clinical test
re-sults. It revealed that this PCR amplification method was
quick,sensitive,reproducible and applicable for the detection of
Cryptocaryon irritans.%根据已知刺激隐核虫ITS序列设计引物，扩增刺激隐核
虫ITS部分序列，并进行克隆、测序及序列分析建立刺激隐核虫PCR快速检测方
法，检测DNA片段长度为387 bp，与福建长乐 CL1209（KC550300）、福建
福鼎 FD1210（KC550302）、广东番禺 PYH4.12株（DQ270010）、日本
Wakayama分离株（AB608054）、台湾嘉义Chiayi株（AF490381）等序列同
源性为100％，检测灵敏度为2个虫体。应用建立方法对2011－2013年收集到
的50份患刺激隐核虫病的大黄鱼样品进行检测，结果与根据临床检测结果的符合
率为100％。该检测方法的建立，为刺激隐核虫病的监测和诊断奠定了快速、简
便、高通量的检测方法基础。
【期刊名称】《福建水产》
【年(卷),期】2015(000)001
【总页数】4页(P50-53)
【关键词】刺激隐核虫;PCR检测;ITS
【作 者】张新艳;樊海平;林煜;吴斌
【作者单位】福建省淡水水产研究所，福建福州350002;福建省淡水水产研究所，
福建福州350002;福建省淡水水产研究所，福建福州350002;福建省淡水水产研
究所，福建福州350002
【正文语种】中 文
【中图分类】S852
刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)俗称海水小瓜虫，具有广泛的致病性，几乎可
以感染所有海水养殖鱼类，不仅严重危害大黄鱼的育苗和养殖，也会感染并导致石
斑鱼(Epinephelussp)、黄鳍鲷(Acanthopagrus latus)、大菱鲆(Psetta maxima)、
鮸鱼(Miichthys miiuy)、黑鲷(Sparus macrocephlus)、卵形鲳鲹(Trachinotus
ovatus)、驼背鲈(Chromileptes altivelis)和牙鲆(Paralichthys olivaceus)等多种
海水养殖鱼类的大量死亡[1-5]，养殖生产受到极大的威胁。近年流行病学调查和
疫病监测结果发现：该病主要发生季节为5月下旬～7月中旬和9月中旬～11月
下旬两季；水温在10℃～30℃范围内均可发生，发病高峰水温22℃～28℃和
25℃～19℃；鱼体感染一定数量虫体后活动迟缓，对外界刺激反应迟钝，呼吸困
难，食欲衰退；病情严重时，病鱼离群于水面缓慢游动，食欲废绝；一般病鱼体表、
鳍、鳃黏液增生形成白色混浊状薄膜，体表、眼角膜、口腔周围和鳃与外界接触处
可观察到白点，病情严重时体表出现点状出血。考虑到刺激隐核虫病流行广泛、危
害严重、且现阶段无良好控制方法等因素，该病被列为我国二类动物疫病，并于
2008年开始在福建、广东等省开展该病的监测工作。本文根据已知刺激隐核虫
ITS序列设计引物，建立了刺激隐核虫的PCR快速检测方法。该方法具有快速、
简便、高通量等特点，将对刺激隐核虫病的监测和预警具有重要意义。
1.1 试验材料
1.1.1 刺激隐核虫
试验虫株采自福建宁德罗源湾养殖区患“白点病”的大黄鱼，对照虫株为福建师范
大学生命科学学院惠赠，采自福建宁德。
1.1.2 引物
参照GenBank已知刺激隐核虫ITS序列设计引物[6]，CI-F：5’-GTC GCT CCT
ACC GAT TTC GAG TGA-3’，CI-R：5’-TGC GTT CAA AGA TCT GAT GAC
TCG-5’，由InvitrogenTM公司合成。
1.1.3 试剂
海洋动物基因组DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒、
DH5α感受态细胞为天根生化有限公司(TIANGEN)产品；pGEM T-easy载体为
Promega公司，Taq酶、DNA Marker DL2000为Takara公司产品；蛋白酶 K、
琼脂糖等试剂购自厦门泰京生物技术有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 刺激隐核虫的采集
参照DB35/T 1353-2013方法[7]采集样品：取患病严重的大黄鱼，刮取病鱼体表
黏液不小于2 cm2，或剪取尾鳍0.5 cm2以上，或剪取左右鳃的第2鳃瓣的鳃丝，
70%乙醇固定后备用。
1.2.2 刺激隐核虫基因组DNA抽提
在解剖镜下将固定样品中虫体用移液器移至无菌的微量离心管中，无菌双蒸水洗涤
3次后用蛋白酶 K(Merck)进行消解，其间用手持电动微量研磨器或超声波进行破
碎，并用海洋动物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN DP324)，按照说明书方法
进行基因组DNA抽提。
1.2.3 刺激隐核虫ITS部分序列扩增
以虫体基因组DNA为模板进行刺激隐核虫ITS序列部分片段PCR扩增。扩增反
应体积为50 μL，分别加入基因组DNA 5 μL，Taq酶2 U，10×PCR缓冲液5 μL，
引物各10 pmol·L-1及dNTP 100 μmol·L-1，无菌双蒸水补足反应体积至50 μL。
反应条件为95℃预变性5 min，94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2
min，共进行30个循环，最后72℃延伸10 min结束反应。取5 μL反应液在10
g·L-1的琼脂糖凝胶上进行电泳检测[8]。
1.2.4 刺激隐核虫ITS序列部分基因克隆
在紫外光下观察凝胶切下目的条带，按照TIANGEN胶回收试剂盒说明进行DNA
回收纯化。按照pGEM T-easy载体(Promega公司)说明进行T-A克隆，转化
DH5α感受态细胞(TIANGEN公司)，挑取阳性克隆碱裂解法提取质粒
(TIANGEN公司)DNA，利用载体自带引物SP6(5’-ATT TAG GTG ACA CTA
TAG-3’， T7(5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’)进行PCR验证后送交
测序公司(上海生工测序公司)进行DNA测序。
1.2.5 序列分析
将测序结果在NCBI网站进行blast分析。
1.2.6 PCR检测灵敏度分析
分别挑取1、2、3、4、5个包囊于干净的Eppendorf管中，按1.2.2进行基因组
DNA抽提，并按1.2.3进行PCR扩增及电泳分析。
1.2.7 PCR检测方法验证
应用建立的检测方法对2011-2013年本试验室至罗源、宁德采集的50份患病大
黄鱼组织样品进行刺激隐核虫病的检测验证。
2.1 ITS部分序列扩增
ITS部分序列PCR扩增结果如图1，扩增得到387 bp的DNA片段，与目的
DNA片段大小一致。
2.2 序列分析
序列测定结果显示，扩增得到的刺激隐核虫ITS-1部分序列DNA与福建长乐
CL1209(KC550300)、福建福鼎FD1210(KC550302)、广东番禺PYH4.12株
(DQ270010)、日本Wakayama分离株(AB608054)和台湾嘉义Chiayi株
(AF490381)等序列同源性为100%，序列如下：
2.3 灵敏度分析
灵敏度测试结果见图2，由图可知，本试验方法可检测到2个虫体。
2.4 PCR检测方法验证
应用本试验方法对50份样品进行检测，符合率100%，说明建立的试验方法可靠。
福建省是全国最大的海水鱼类养殖基地，网箱养殖的数量和产量均居全国之首，但
由于养殖密度增大，养殖环境恶化，导致“白点病”频繁爆发，每年均造成重大经
济损失。同样，广东、浙江、山东等省也常遭受刺激隐核虫病引起的重大损失。养
殖生产中诊断刺激隐核虫病往往通过体表是否有白点出现判断有无感染，早期少量
感染幼虫时显微镜检测也较难发现虫体。rDNA ITS序列标记有良好的物种特异性
和检测灵敏度，不但能检测出早期的感染少量虫体，还能对刺激隐核虫虫株进行准
确鉴定 [6，9-12]。作者对从罗源湾养殖区大黄鱼鱼体上的采集到的刺激隐核虫虫
株进行rDNA ITS部分序列扩增并鉴定，发现与福建长乐CL1209(KC550300)、
福建福鼎FD1210(KC550302)、广东番禺PYH4.12株(DQ270010)、日本
Wakayama分离株(AB608054)及台湾嘉义Chiayi株(AF490381)等虫株一致，说
明本方法用于刺激隐核虫的检测，具有可靠、灵敏和高通量的特性，为病害诊断提
供了重要的试验方法基础。
刺激隐核虫DNA提取首先要破除虫体的质膜，DNA才能得于释放，因此，破碎
质膜这一步非常重要，它直接影响到之后DNA的提取及其质量，从而影响试验的
准确度。刺激隐核虫病的样品采集自养殖海区，保存一般采用70%乙醇固定，固
定后的样品给DNA抽提带来一定的困难。本试验采用挑取固定虫体后，双蒸水洗
涤并经蛋白酶 K消解处理的方法进行前处理，并采用电动研磨器研磨或超声波破
碎的方式促进虫体DNA释放，对检测准确度和灵敏度的提高起到了良好作用。
【相关文献】
[1]Colorni A，Burgess P．Cryptocaryon irritans Brown 1951，the cause of white spot
disease in marinefish：an update [J]．Aquarium Sciences and Conservation，1997，1 (4)：
217-238．
[2]Sikama inary report on the white spot disease in marine fishes [J].Suisan-
Gakukai-Ho，1937，7：149-160．
[3]Burgess P，Matthews R．Fish host range of seven isolates of Cryptocaryon irritans
(Ciliophora) [J]．Journal of Fish Biology，1995，46 (4)：727-729．
[4]Luo X C，Xie M Q，Zhu X Q，et al．Some characteristics of host-parasite relationship
for Cryptocaryon irritans isolated from South China [J]．Parasitol Res，2008，102：1269-
1275．
[5]苏跃中．福建省主要养殖区海水网箱养殖鱼类刺激隐核虫病的调查及防控对策[J]．水产科技情
报，2009，36(1)：4-7．
[6]Sun H Y,Zhu X Q,Xie M Q，et terization of Cryptocaryon irritans isolates from
marine fishes in Mainland China by ITS ribosomal DNA sequences[J].Parasitol Res，2006，
99：160 -166.
[7]樊海平，卓玉琛，林 煜，等.DB35/T 1353-2013海水养殖鱼类刺激隐核虫病诊断规程[S]．福
建：福建省质量技术监督局，2013.
[8]J.萨姆布鲁克，拉塞尔.分子克隆试验指南(黄培堂主译,第三版)[M].北京：科学出版社，2008：
385-397.
[9]Diggles B，Adlard R．Intraspecific variation in Cryptocaryon irritans [J]．Journal of
Eukaryotic Microbiology，1997，44 (1)：25-32.
[10]Yambot A，Song Y，Sung H．Characterization of Cryptocaryon irritans，a parasite
isolated from marine fishes in Taiwan [J].Diseases of Aquatic Organisms，2003，54(2)：
147-156．
[11]Li A X，Wu X Y，Ding X J，et al. PCR-SSCP as a molecular tool for the identification of
Benedeniinae (Monogenea：Capsalidae) from marine fish [J].Mol Cell Probes，2005，19：
35-39.
[12]Hatanaka A，Umeda N ，Hirazawa N． Molecular cloning of a putative agglutination/
immobilization antigen located on the surface of a novel agglutination/immobilization
serotype of Cryptocaryon irritans [J]．Parasitology，2008，135 (9)：1043-1052．
2024年3月13日发(作者：植炎)
刺激隐核虫PCR检测方法的建立
张新艳;樊海平;林煜;吴斌
【摘 要】Specific primers were designed based on the DNA sequence of
internal transcribed spacer 1 (ITS-1). The genomic DNA of Cryptocaryon
irritans,isolated from culturing Pseudosciaena crocea in Luoyuan of
Fujian,used as a template DNA to amplify part of the gene fragment of
ITS-1,which had a 387 bp band when electrophoresed on an agarose gel.
Then the PCR amplification products were cloned,sequenced and analyzed.
Homology comparison indicated that they shared 100% identity with the
gene sequence of CL1209 strain (KC550300 ), FD1210 (KC550302 ),
PYH4.12 strain (DQ270010 ), Wakayama strain (AB608054 ),and Chiayi
strain (AF490381 ). PCR amplification for the detection of Cryptocaryon
irritans was established,which was limited to 2 polypides,then being
applied to detect the samples of the C. irritans monitoring during the last
three years (2011-2013 ). The results were 100% conformed to clinical test
re-sults. It revealed that this PCR amplification method was
quick,sensitive,reproducible and applicable for the detection of
Cryptocaryon irritans.%根据已知刺激隐核虫ITS序列设计引物，扩增刺激隐核
虫ITS部分序列，并进行克隆、测序及序列分析建立刺激隐核虫PCR快速检测方
法，检测DNA片段长度为387 bp，与福建长乐 CL1209（KC550300）、福建
福鼎 FD1210（KC550302）、广东番禺 PYH4.12株（DQ270010）、日本
Wakayama分离株（AB608054）、台湾嘉义Chiayi株（AF490381）等序列同
源性为100％，检测灵敏度为2个虫体。应用建立方法对2011－2013年收集到
的50份患刺激隐核虫病的大黄鱼样品进行检测，结果与根据临床检测结果的符合
率为100％。该检测方法的建立，为刺激隐核虫病的监测和诊断奠定了快速、简
便、高通量的检测方法基础。
【期刊名称】《福建水产》
【年(卷),期】2015(000)001
【总页数】4页(P50-53)
【关键词】刺激隐核虫;PCR检测;ITS
【作 者】张新艳;樊海平;林煜;吴斌
【作者单位】福建省淡水水产研究所，福建福州350002;福建省淡水水产研究所，
福建福州350002;福建省淡水水产研究所，福建福州350002;福建省淡水水产研
究所，福建福州350002
【正文语种】中 文
【中图分类】S852
刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)俗称海水小瓜虫，具有广泛的致病性，几乎可
以感染所有海水养殖鱼类，不仅严重危害大黄鱼的育苗和养殖，也会感染并导致石
斑鱼(Epinephelussp)、黄鳍鲷(Acanthopagrus latus)、大菱鲆(Psetta maxima)、
鮸鱼(Miichthys miiuy)、黑鲷(Sparus macrocephlus)、卵形鲳鲹(Trachinotus
ovatus)、驼背鲈(Chromileptes altivelis)和牙鲆(Paralichthys olivaceus)等多种
海水养殖鱼类的大量死亡[1-5]，养殖生产受到极大的威胁。近年流行病学调查和
疫病监测结果发现：该病主要发生季节为5月下旬～7月中旬和9月中旬～11月
下旬两季；水温在10℃～30℃范围内均可发生，发病高峰水温22℃～28℃和
25℃～19℃；鱼体感染一定数量虫体后活动迟缓，对外界刺激反应迟钝，呼吸困
难，食欲衰退；病情严重时，病鱼离群于水面缓慢游动，食欲废绝；一般病鱼体表、
鳍、鳃黏液增生形成白色混浊状薄膜，体表、眼角膜、口腔周围和鳃与外界接触处
可观察到白点，病情严重时体表出现点状出血。考虑到刺激隐核虫病流行广泛、危
害严重、且现阶段无良好控制方法等因素，该病被列为我国二类动物疫病，并于
2008年开始在福建、广东等省开展该病的监测工作。本文根据已知刺激隐核虫
ITS序列设计引物，建立了刺激隐核虫的PCR快速检测方法。该方法具有快速、
简便、高通量等特点，将对刺激隐核虫病的监测和预警具有重要意义。
1.1 试验材料
1.1.1 刺激隐核虫
试验虫株采自福建宁德罗源湾养殖区患“白点病”的大黄鱼，对照虫株为福建师范
大学生命科学学院惠赠，采自福建宁德。
1.1.2 引物
参照GenBank已知刺激隐核虫ITS序列设计引物[6]，CI-F：5’-GTC GCT CCT
ACC GAT TTC GAG TGA-3’，CI-R：5’-TGC GTT CAA AGA TCT GAT GAC
TCG-5’，由InvitrogenTM公司合成。
1.1.3 试剂
海洋动物基因组DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒、
DH5α感受态细胞为天根生化有限公司(TIANGEN)产品；pGEM T-easy载体为
Promega公司，Taq酶、DNA Marker DL2000为Takara公司产品；蛋白酶 K、
琼脂糖等试剂购自厦门泰京生物技术有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 刺激隐核虫的采集
参照DB35/T 1353-2013方法[7]采集样品：取患病严重的大黄鱼，刮取病鱼体表
黏液不小于2 cm2，或剪取尾鳍0.5 cm2以上，或剪取左右鳃的第2鳃瓣的鳃丝，
70%乙醇固定后备用。
1.2.2 刺激隐核虫基因组DNA抽提
在解剖镜下将固定样品中虫体用移液器移至无菌的微量离心管中，无菌双蒸水洗涤
3次后用蛋白酶 K(Merck)进行消解，其间用手持电动微量研磨器或超声波进行破
碎，并用海洋动物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN DP324)，按照说明书方法
进行基因组DNA抽提。
1.2.3 刺激隐核虫ITS部分序列扩增
以虫体基因组DNA为模板进行刺激隐核虫ITS序列部分片段PCR扩增。扩增反
应体积为50 μL，分别加入基因组DNA 5 μL，Taq酶2 U，10×PCR缓冲液5 μL，
引物各10 pmol·L-1及dNTP 100 μmol·L-1，无菌双蒸水补足反应体积至50 μL。
反应条件为95℃预变性5 min，94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2
min，共进行30个循环，最后72℃延伸10 min结束反应。取5 μL反应液在10
g·L-1的琼脂糖凝胶上进行电泳检测[8]。
1.2.4 刺激隐核虫ITS序列部分基因克隆
在紫外光下观察凝胶切下目的条带，按照TIANGEN胶回收试剂盒说明进行DNA
回收纯化。按照pGEM T-easy载体(Promega公司)说明进行T-A克隆，转化
DH5α感受态细胞(TIANGEN公司)，挑取阳性克隆碱裂解法提取质粒
(TIANGEN公司)DNA，利用载体自带引物SP6(5’-ATT TAG GTG ACA CTA
TAG-3’， T7(5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’)进行PCR验证后送交
测序公司(上海生工测序公司)进行DNA测序。
1.2.5 序列分析
将测序结果在NCBI网站进行blast分析。
1.2.6 PCR检测灵敏度分析
分别挑取1、2、3、4、5个包囊于干净的Eppendorf管中，按1.2.2进行基因组
DNA抽提，并按1.2.3进行PCR扩增及电泳分析。
1.2.7 PCR检测方法验证
应用建立的检测方法对2011-2013年本试验室至罗源、宁德采集的50份患病大
黄鱼组织样品进行刺激隐核虫病的检测验证。
2.1 ITS部分序列扩增
ITS部分序列PCR扩增结果如图1，扩增得到387 bp的DNA片段，与目的
DNA片段大小一致。
2.2 序列分析
序列测定结果显示，扩增得到的刺激隐核虫ITS-1部分序列DNA与福建长乐
CL1209(KC550300)、福建福鼎FD1210(KC550302)、广东番禺PYH4.12株
(DQ270010)、日本Wakayama分离株(AB608054)和台湾嘉义Chiayi株
(AF490381)等序列同源性为100%，序列如下：
2.3 灵敏度分析
灵敏度测试结果见图2，由图可知，本试验方法可检测到2个虫体。
2.4 PCR检测方法验证
应用本试验方法对50份样品进行检测，符合率100%，说明建立的试验方法可靠。
福建省是全国最大的海水鱼类养殖基地，网箱养殖的数量和产量均居全国之首，但
由于养殖密度增大，养殖环境恶化，导致“白点病”频繁爆发，每年均造成重大经
济损失。同样，广东、浙江、山东等省也常遭受刺激隐核虫病引起的重大损失。养
殖生产中诊断刺激隐核虫病往往通过体表是否有白点出现判断有无感染，早期少量
感染幼虫时显微镜检测也较难发现虫体。rDNA ITS序列标记有良好的物种特异性
和检测灵敏度，不但能检测出早期的感染少量虫体，还能对刺激隐核虫虫株进行准
确鉴定 [6，9-12]。作者对从罗源湾养殖区大黄鱼鱼体上的采集到的刺激隐核虫虫
株进行rDNA ITS部分序列扩增并鉴定，发现与福建长乐CL1209(KC550300)、
福建福鼎FD1210(KC550302)、广东番禺PYH4.12株(DQ270010)、日本
Wakayama分离株(AB608054)及台湾嘉义Chiayi株(AF490381)等虫株一致，说
明本方法用于刺激隐核虫的检测，具有可靠、灵敏和高通量的特性，为病害诊断提
供了重要的试验方法基础。
刺激隐核虫DNA提取首先要破除虫体的质膜，DNA才能得于释放，因此，破碎
质膜这一步非常重要，它直接影响到之后DNA的提取及其质量，从而影响试验的
准确度。刺激隐核虫病的样品采集自养殖海区，保存一般采用70%乙醇固定，固
定后的样品给DNA抽提带来一定的困难。本试验采用挑取固定虫体后，双蒸水洗
涤并经蛋白酶 K消解处理的方法进行前处理，并采用电动研磨器研磨或超声波破
碎的方式促进虫体DNA释放，对检测准确度和灵敏度的提高起到了良好作用。
【相关文献】
[1]Colorni A，Burgess P．Cryptocaryon irritans Brown 1951，the cause of white spot
disease in marinefish：an update [J]．Aquarium Sciences and Conservation，1997，1 (4)：
217-238．
[2]Sikama inary report on the white spot disease in marine fishes [J].Suisan-
Gakukai-Ho，1937，7：149-160．
[3]Burgess P，Matthews R．Fish host range of seven isolates of Cryptocaryon irritans
(Ciliophora) [J]．Journal of Fish Biology，1995，46 (4)：727-729．
[4]Luo X C，Xie M Q，Zhu X Q，et al．Some characteristics of host-parasite relationship
for Cryptocaryon irritans isolated from South China [J]．Parasitol Res，2008，102：1269-
1275．
[5]苏跃中．福建省主要养殖区海水网箱养殖鱼类刺激隐核虫病的调查及防控对策[J]．水产科技情
报，2009，36(1)：4-7．
[6]Sun H Y,Zhu X Q,Xie M Q，et terization of Cryptocaryon irritans isolates from
marine fishes in Mainland China by ITS ribosomal DNA sequences[J].Parasitol Res，2006，
99：160 -166.
[7]樊海平，卓玉琛，林 煜，等.DB35/T 1353-2013海水养殖鱼类刺激隐核虫病诊断规程[S]．福
建：福建省质量技术监督局，2013.
[8]J.萨姆布鲁克，拉塞尔.分子克隆试验指南(黄培堂主译,第三版)[M].北京：科学出版社，2008：
385-397.
[9]Diggles B，Adlard R．Intraspecific variation in Cryptocaryon irritans [J]．Journal of
Eukaryotic Microbiology，1997，44 (1)：25-32.
[10]Yambot A，Song Y，Sung H．Characterization of Cryptocaryon irritans，a parasite
isolated from marine fishes in Taiwan [J].Diseases of Aquatic Organisms，2003，54(2)：
147-156．
[11]Li A X，Wu X Y，Ding X J，et al. PCR-SSCP as a molecular tool for the identification of
Benedeniinae (Monogenea：Capsalidae) from marine fish [J].Mol Cell Probes，2005，19：
35-39.
[12]Hatanaka A，Umeda N ，Hirazawa N． Molecular cloning of a putative agglutination/
immobilization antigen located on the surface of a novel agglutination/immobilization
serotype of Cryptocaryon irritans [J]．Parasitology，2008，135 (9)：1043-1052．