2024年3月27日发(作者：朱同甫)
凝胶滞缓实验(Gel retardation assay)，又称DNA迁移率变化试验(DNA mobility shift
assay--EMSA
接上贴
如《现代分子生物学实验技术》该书中就有详细介绍说明，高等教育出版社出版，卢圣栋主编。
若找不到该书，一般有关分子生物的实验技术书上都会有介绍。
总的说来，EMSA不是太好做，目前有两种方法，一种是有放射性同位素标记的，还有一种是不
用同位素的，采用的化学发光的方法。因为它的影响因素很多，有抗体的浓度，一些离子的强度
和实验的条件等等，如果要做出好的EMSA的结果需要摸条件。我们采用的是化学的方法，总的
来说没有同位素的方法经典。感觉一般的书介绍的都比较粗略，最好查阅相关要作的分子已发表
papae的实验条件，在此基础上再不断的摸索。分子克隆第三版上也有相关的知识。如果要买公
司的试剂盒的话，可在网上查阅相关的信息。以上仅为我之拙见。
推荐一个很好的EMSA试剂相关网站，可以参考。
另外，现在有新的方法定量检测活性转录因子含量，类似于ELISA的方法，只是板子上包被的
是寡核苷酸，操作很简单，效果也比较好，可以参考。
promega 公司有专门做NF-kB活性的试剂盒，名字叫E3300，效果不错。我参考了一些分子生
物学技术参考书总结了该实验的protocol（包括核蛋白的提取过程），供您参考如下：实验材料
及方法
一、 细胞核蛋白质的提取
试剂和溶液
缓冲液A 缓冲液B
10mmol/L HEPES-KOH Ph7.9 20mmol/L HEPES-KOH Ph7.9
1.5mmol/L MgCL2 1.5mmol/L MgCL2
10mmol/L KCL 420mmol/L NaCL
0.5mmol/L DTT 0.2mmol/L EDTA
0.2mmol/L PMSF 25% Glycerol
0.5mmol/L DTT
0.2mmol/L PMSF
操作步骤
1． 去细胞培养液，用PBS（含0.05mmol/LPMSF）洗两次，用刮板将细胞刮下，计数细胞，
收集于适当体积离心管，用少量PBS冲洗平皿一并吸入离心管。
2． 40C离心5分钟，使细胞沉淀。
3． 弃上清，将沉淀的细胞用含PMSF的PBS悬起再离心，重复两次。洗去全部细胞培养液及
血清成分。
4． 取5×105-7细胞，40C离心，弃上清。
5． 加入400μl冷缓冲液A，手指弹管壁使沉淀悬起，冰浴10分钟，震荡10秒钟，混匀。
6． 离心10秒钟，弃上清，加20~100μl冷缓冲液B使沉淀悬起，冰浴20分钟。
7． 40C离心2分钟，弃沉淀。
8． 上清为核提取物，分装后-700C保存。（次法每1×106细胞可得到50~75μg核蛋白质）。
二、 蛋白含量的测定
Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination （Sigma BCA-1）
三、 凝胶迁移法（EMSA）测定NF-κB的DNA结合活性 (Promega E3300)
(一) Sephadex G-25 离心层析柱的制备
1．将Sephadex G-25缓慢加入盛有无菌蒸馏水的100ml 烧杯中，用无菌蒸馏水反复洗涤凝胶，
以除去可溶性的葡聚糖。
2． 胀3小时后，用TE 缓冲液平衡凝胶，15磅高压蒸汽灭菌15分钟后于室温保存。
3． 一支1ml一次性注射器用少量无菌玻璃棉堵塞其底部。
4． 用Sephadex G-25装柱，以TE缓冲液平衡，不断加入凝胶至注射器完全加满。
5． 将注射器放入15ml 离心管中，于室温下1600g离心4分钟。
6． 继续补加凝胶并离心直至堆紧的层析柱床体积达到0.9ml 左右且不再因离心而发生体积变
化时为止。
7． 将TE 缓冲液加入柱上，重复步骤5。
8． 重复步骤7两次。
9． 在注射器内加满TE缓冲液，用Parafilm膜封口，垂直放于40C待用。
(二) NF-κB寡核苷酸的同位素标记与纯化
1．探针的标记
a. 在消毒的一次性Eppendorf管中依次加入：
寡核苷酸探针 6μl
[γ-32P]ATP 5μl
10×酶缓冲液 2μl
ddH2O 6μl
T4多核苷酸激酶 1μl（6-10U）
b. 充分混匀上述液体，离心10秒钟，使液体流入管底。
c. 于370C静置反应1小时。
d. 向管中加入30μl双蒸水，离心10秒钟，使其流入管底。
2．探针的纯化
a. 将制好的Sephadex G-25 离心层析柱除去Parafilm膜，以1200g离心3分钟。
b. 弃去柱内流出的TE缓冲液并更换新的收集管。
c. 将标记好的探针混合液加入Sephadex G-25 离心层析柱中，垂直静置2 ~ 3分钟后，以1200g
离心90秒钟。
d. 取出收集管，向其中加入50μl TE 缓冲液，置于铅罐内，-200C贮存。
(三) 凝胶迁移实验
1． 制备5%的聚丙烯酰胺凝胶
30%丙烯酰胺 1.5ml
5×TBE缓冲液 0.9ml
ddH2O 6.6ml
30%过硫酸胺 15μl
TEMED 4μl
以上液体倒入胶槽，凝固后去掉梳子，用去离子水冲洗加样孔，将凝胶固定在电泳槽中，加满电
泳缓冲液（0.5×TBE缓冲液）
2． 预电泳：100-120V电压电泳90分钟。
3． NF-κB与探针的结合反应
a. 在消毒的一次性0.5ml Eppendorf管中依次加入：
核提取物 6μg
5×结合缓冲液 4μl
10%BSA 2μl
poly（dI-dC） 1μg
加入双蒸水至18μl
b． 混匀后，于室温中放置15分钟。
C．加入[γ-32P]ATP标记的NF-κB寡核苷酸探针2μl，混匀后，于室温中反应20分钟。
4． 电泳：加入适量上样缓冲液后，加样至加样孔中，于100-120V电泳2小时。
5． 干胶：取下凝胶放于保鲜膜上，在抽干机中抽干。
6． 放射自显影：在暗室中将凝胶放入暗盒，压X光片，将暗盒密封，-800C曝光过夜，或室
温24小时曝光。
7． 于暗室内洗片，流动清水过夜。
8． 光密度扫描，分析结果。
检测种细胞里的PPARr与PPRE的结合活性，除了EMSA方法，其它技术有没有进展？EMSA方
法，身边的人没几个愿意作？放射自显影是不是有些危险？请做过的战友指点,谢谢啦
**********************************************************
另外有一种现在比较常用的方法是ELISA的方法，检测非常检测，灵敏度要比EMSA高，时间
一般只需要3.5小时，可以检测来自于人、小鼠和大鼠的PPARr.我有详细的说明书，你要的话，
我可以传你给你，或者到下面这个网站参考，哪里有许多中转录因子ELISA检测的试剂盒。忘
了贴网址了，不好意思：（
.国内代理是晶美公司。
2024年3月27日发(作者：朱同甫)
凝胶滞缓实验(Gel retardation assay)，又称DNA迁移率变化试验(DNA mobility shift
assay--EMSA
接上贴
如《现代分子生物学实验技术》该书中就有详细介绍说明，高等教育出版社出版，卢圣栋主编。
若找不到该书，一般有关分子生物的实验技术书上都会有介绍。
总的说来，EMSA不是太好做，目前有两种方法，一种是有放射性同位素标记的，还有一种是不
用同位素的，采用的化学发光的方法。因为它的影响因素很多，有抗体的浓度，一些离子的强度
和实验的条件等等，如果要做出好的EMSA的结果需要摸条件。我们采用的是化学的方法，总的
来说没有同位素的方法经典。感觉一般的书介绍的都比较粗略，最好查阅相关要作的分子已发表
papae的实验条件，在此基础上再不断的摸索。分子克隆第三版上也有相关的知识。如果要买公
司的试剂盒的话，可在网上查阅相关的信息。以上仅为我之拙见。
推荐一个很好的EMSA试剂相关网站，可以参考。
另外，现在有新的方法定量检测活性转录因子含量，类似于ELISA的方法，只是板子上包被的
是寡核苷酸，操作很简单，效果也比较好，可以参考。
promega 公司有专门做NF-kB活性的试剂盒，名字叫E3300，效果不错。我参考了一些分子生
物学技术参考书总结了该实验的protocol（包括核蛋白的提取过程），供您参考如下：实验材料
及方法
一、 细胞核蛋白质的提取
试剂和溶液
缓冲液A 缓冲液B
10mmol/L HEPES-KOH Ph7.9 20mmol/L HEPES-KOH Ph7.9
1.5mmol/L MgCL2 1.5mmol/L MgCL2
10mmol/L KCL 420mmol/L NaCL
0.5mmol/L DTT 0.2mmol/L EDTA
0.2mmol/L PMSF 25% Glycerol
0.5mmol/L DTT
0.2mmol/L PMSF
操作步骤
1． 去细胞培养液，用PBS（含0.05mmol/LPMSF）洗两次，用刮板将细胞刮下，计数细胞，
收集于适当体积离心管，用少量PBS冲洗平皿一并吸入离心管。
2． 40C离心5分钟，使细胞沉淀。
3． 弃上清，将沉淀的细胞用含PMSF的PBS悬起再离心，重复两次。洗去全部细胞培养液及
血清成分。
4． 取5×105-7细胞，40C离心，弃上清。
5． 加入400μl冷缓冲液A，手指弹管壁使沉淀悬起，冰浴10分钟，震荡10秒钟，混匀。
6． 离心10秒钟，弃上清，加20~100μl冷缓冲液B使沉淀悬起，冰浴20分钟。
7． 40C离心2分钟，弃沉淀。
8． 上清为核提取物，分装后-700C保存。（次法每1×106细胞可得到50~75μg核蛋白质）。
二、 蛋白含量的测定
Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination （Sigma BCA-1）
三、 凝胶迁移法（EMSA）测定NF-κB的DNA结合活性 (Promega E3300)
(一) Sephadex G-25 离心层析柱的制备
1．将Sephadex G-25缓慢加入盛有无菌蒸馏水的100ml 烧杯中，用无菌蒸馏水反复洗涤凝胶，
以除去可溶性的葡聚糖。
2． 胀3小时后，用TE 缓冲液平衡凝胶，15磅高压蒸汽灭菌15分钟后于室温保存。
3． 一支1ml一次性注射器用少量无菌玻璃棉堵塞其底部。
4． 用Sephadex G-25装柱，以TE缓冲液平衡，不断加入凝胶至注射器完全加满。
5． 将注射器放入15ml 离心管中，于室温下1600g离心4分钟。
6． 继续补加凝胶并离心直至堆紧的层析柱床体积达到0.9ml 左右且不再因离心而发生体积变
化时为止。
7． 将TE 缓冲液加入柱上，重复步骤5。
8． 重复步骤7两次。
9． 在注射器内加满TE缓冲液，用Parafilm膜封口，垂直放于40C待用。
(二) NF-κB寡核苷酸的同位素标记与纯化
1．探针的标记
a. 在消毒的一次性Eppendorf管中依次加入：
寡核苷酸探针 6μl
[γ-32P]ATP 5μl
10×酶缓冲液 2μl
ddH2O 6μl
T4多核苷酸激酶 1μl（6-10U）
b. 充分混匀上述液体，离心10秒钟，使液体流入管底。
c. 于370C静置反应1小时。
d. 向管中加入30μl双蒸水，离心10秒钟，使其流入管底。
2．探针的纯化
a. 将制好的Sephadex G-25 离心层析柱除去Parafilm膜，以1200g离心3分钟。
b. 弃去柱内流出的TE缓冲液并更换新的收集管。
c. 将标记好的探针混合液加入Sephadex G-25 离心层析柱中，垂直静置2 ~ 3分钟后，以1200g
离心90秒钟。
d. 取出收集管，向其中加入50μl TE 缓冲液，置于铅罐内，-200C贮存。
(三) 凝胶迁移实验
1． 制备5%的聚丙烯酰胺凝胶
30%丙烯酰胺 1.5ml
5×TBE缓冲液 0.9ml
ddH2O 6.6ml
30%过硫酸胺 15μl
TEMED 4μl
以上液体倒入胶槽，凝固后去掉梳子，用去离子水冲洗加样孔，将凝胶固定在电泳槽中，加满电
泳缓冲液（0.5×TBE缓冲液）
2． 预电泳：100-120V电压电泳90分钟。
3． NF-κB与探针的结合反应
a. 在消毒的一次性0.5ml Eppendorf管中依次加入：
核提取物 6μg
5×结合缓冲液 4μl
10%BSA 2μl
poly（dI-dC） 1μg
加入双蒸水至18μl
b． 混匀后，于室温中放置15分钟。
C．加入[γ-32P]ATP标记的NF-κB寡核苷酸探针2μl，混匀后，于室温中反应20分钟。
4． 电泳：加入适量上样缓冲液后，加样至加样孔中，于100-120V电泳2小时。
5． 干胶：取下凝胶放于保鲜膜上，在抽干机中抽干。
6． 放射自显影：在暗室中将凝胶放入暗盒，压X光片，将暗盒密封，-800C曝光过夜，或室
温24小时曝光。
7． 于暗室内洗片，流动清水过夜。
8． 光密度扫描，分析结果。
检测种细胞里的PPARr与PPRE的结合活性，除了EMSA方法，其它技术有没有进展？EMSA方
法，身边的人没几个愿意作？放射自显影是不是有些危险？请做过的战友指点,谢谢啦
**********************************************************
另外有一种现在比较常用的方法是ELISA的方法，检测非常检测，灵敏度要比EMSA高，时间
一般只需要3.5小时，可以检测来自于人、小鼠和大鼠的PPARr.我有详细的说明书，你要的话，
我可以传你给你，或者到下面这个网站参考，哪里有许多中转录因子ELISA检测的试剂盒。忘
了贴网址了，不好意思：（
.国内代理是晶美公司。