SARS-CoV-2 Nsp16蛋白分子特征及其对男性生殖功能潜在影响-USB迷|专注于互联网分享

2024年3月27日发(作者：机绮怀)

中华疾病控制杂志2021年4月第25卷第4期 Chin J Dis Control Prev 2021 Apr; 25(4)

•

439

•

•论

SARS

CoV

-2

Nspl

6蛋白分子特征

及其对男性生殖功能潜在影响

张凌寒张婉玉徐小路郭艺红

450001郑州，郑州大学第一附属医院生殖医学中心，河南省生殖与遗传重点实验室

通信作者：郭艺红，

mail

136****3710@163

.com

01：10.16462/

cnki

zhjbkz

.2021.04.013

【摘要】

目的

C0VID-19

可能并发生殖功能损伤的问题已引起关注。本研究分析

SARS-C

〇

V-2 NsP16

蛋白遗传特征、分子结构与生物功能，探讨病毒侵人睾丸组织后

NSP16

对生殖

细胞的潜在影响，为该病发病机制和治疗策略研究奠定基础。方法应用生物信息技术和国际生

物数据库，分析基因变异性、

Nspl6

空间结构与功能及对生殖细胞的潜在影响，并利用

Drug-

Bank

数据库筛选可靶向结合

NsP16

的药物。结果基于

种

株冠状病毒的

叫

>16

序列构建了

进化树

;SARS-C

〇

V-2

毒株间哪

基因保守性为

99%; Nspl6

属于亲水蛋白，在体外细胞的半衰期

(half-life)

是

1.9 h;Nsp16

具有甲基转移酶活性，具有调节精子和睾丸间质细胞基因和功能蛋白甲

基化潜能

;NsP16

具有线性

细胞和

CTL

细胞抗原表位，可能通过激发免疫反应损伤睾丸组织；从

DrugBank

数据库筛选出

种可靶向结合

Nspl6

的抑制性药物。结论

SARS-C

〇

V-2 Nspl6

是基因

局度保守的功能蛋白；病毒经血管紧张素转换酶

2( angiotensin-converting enzyme 2

，

ACE2

)受体侵

人睾丸组织后，

NsP16

可能通过促进宿主细胞基因和蛋白甲基化机制，影响生殖细胞生长发育。该

研究首次报道耙向结合

NSpl6

的化疗药物，对

C0VID-19

及相关男性生殖系统疾病的防治研究具有

重要参考价值。

【关键词】核糖甲基转移酶；新型冠状病毒；

NsP16;

治疗策略；遗传特征

【中图分类号】

R373

【文献标识码】

基金项目：

【文章编号】

1674-3679(2021)04-0439-06

国家自然科学基金（

81571409

);河南省高校科技创新团队支持计划

(18IRTSTHN030)

Molecular characteristics of SARS-CoV-2 Nspl6 protein and analysis of its potential effect on male

reproductive function ZHANG Ling-han, ZHANG Wan-yuy XU Xiao-lu, GUO Yi-hong

Center for Reproductive Medicine，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Henan Province Key

Laboratory of Reproduction and Genetics, Zhengzhou 450001, China

Corresponding author•• GUO Yi-hong, E-mail: 136****************

【

Abstract

】

Objective The possibility of coronavirus disease 2019 ( COVID-19 ) involving inju-

ry to reproductive function has attracted attention. This study analyzed the genetic characteristics, molecu

lar structure and biological function of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)

Nspl6 protein, and explored potential effects of Nspl6 on germ cells following the virus, invading testicu

lar tissue, aiming to lay basis for studies of pathogenic mechanisms and therapeutic strategies.

Methods

Bioinformatic techniques and international biological databases were used to analyze nsp6 genetic varia

bility, Nspl6 spatial structure and function, and effects on genes and proteins of germ cells. DrugBank

databases were applied in screening for drugs targeted at Nspl6. Results An evolutionary tree was con

structed based on the nsp6 sequences of 30 isolates of 3 coronavirus species. The nsp6 conserved prop

erty was 99% amongst SARS-CoV-2 isolates. Nspl6 is a hydrophilic protein, with a 1.9 h half-life inside

cells in vitro. Nspl6 has methyltransferase activity, showing potential to regulate gene and functional pro

tein methylation of sperm and Leydig cells. Nspl6 has both linear B cell epitopes and CTL cell epitopes,

•

440

•

中华疾病控制杂志2021年4月第25卷第4期 Chin J Dis Control Prev 2021 Apr; 25(4)

with capacity to induce immune responses and damage to testicular tissue. Two inhibitory drugs targeted at

Nsp 16 were found by screening the DrugBank database. Conclusions SARS-CoV-2 Nsp 16 is a functional

protein encoded by a highly conserved gene, may affect germ cell growth and development by promoting

methylation of host cellular genes and proteins following the virusf invasion into testis tissue through angio

tensin-converting enzyme 2 receptors. This report presents Nspl6-targeted chemotherapeutic drugs for the

first time, showing high reference value for prevention and treatment of COVID-19 and related lesions of

the male reproductive system.

【Key words

】

characteristic

Fund programs: National Natural Science Foundation of China (81571409); Henan Innovation

Team Support Program for Colleges and Universities ( 18IRTSTHN030)

(Chin J DLs Control Prev 2021,25(4)

：

439-444)

Ribose methyltransferase

；

SARS-CoV-2

；

Nspl6

；

Therapeutic strategy

；

Genetic

目前，

SARS

〇

-2感染确诊病例已超过3 000

万,死亡病例超过100万。

SARS

CoV

-2感染可引起

严重呼吸系统病变

。同时，已有研究显示，该病

毒受体血管紧张素转换酶

(

angiotensin-converting

能及对男性生殖细胞的潜在影响，筛选可靶向结

合该蛋白的药物，为研究该病毒感染的致病机制

和治疗策略奠定重要基础。

enzyme

ACE

2)在人体睾丸组织呈高表达，提示感

染很可能累及男性生殖功能[M]。该病缺乏特异性

治疗措施，其暴发流行不仅未能完全控制，而且有

常态化发展趋势，已成为全球性重大公共卫生问

题14_5]。

SARS

CoV

-2

P16是病毒产生的一种非

结构性蛋白，在多种病毒中可见其同源蛋白n+6],

提示其对病毒生存具有重要功能。病毒感染睾丸

组织后，

P16对生殖细胞的影响目前尚不清楚。

本研究探讨

Nspl6

遗传变异特征、结构与生物功

材料与方法

从

GenBank

数据库下载

VID

-19、

SARSl

呼吸综合征

（Middle

East

respiratory

syndrome

MERS

)

病毒株基因组序列，进而获取

NsP

16编码基因序列及

对应氨基酸序列;应用生物软件

Omiga

10软件

、MEGA

5.10软件和在线生物信息分析平台，分析不同冠状病

毒毒株^16基因序列相似性，并构建进化树;依据

Nsp

16氨基酸序列，分析该蛋白理化特性、分子空间结

构、生物活性和潜在靶向结合药物。见表

。

表

研究应用的生物软件和分析平台

Table 1 Biological softwares and analysis platforms applied in this study

生物软件/在线分析平台

URL

分析

mP16基因序列保守性

mp 16基因进化树

NSP16分子质量、氨基酸构成、等电点、半衰期、稳定性等理化特性

Omiga 2.0

MEGA 5.10

Protparam

Protscale

SignalP 4.0

TMPRED

NetPhos 3.1

NetOGlyc 4.0

SUMOplot

CDD

模块

SOPMA

SWISS-MODEL

BLEP 2.0

SYFPEITHI

DrugBank

http

：/ /

/ prods/ omiga/

https

：//

https

：//

/ protparam/

https

：//

^/ protscale/

http

：

///services/SignalP-4.0/

http ：/

/ software/TMPRED/

http ：/

/ services/NetPhos/

http

：//

/ services/NetOGlyc-4.Q/

http ://www. /sumoplot

https

：

//www. ncbi. /cdd/

/cgi-bin/npsa_automat. pi? page

npsa_

https

：//

http

：/ /

^/bcell/

http

：//

/bin//

http

：//

Nspl6

亲疏水性

Nspl6

信号肽序列

NsP16

跨膜螺旋

NsP16

磷酸化位点

Nsp

丨

6 0-

糖基化位点

Nspl6 S_

修饰位点

Nspl6

保守功能结构域

Nspl6

二^结构

Nspl6

三级结构

B细胞相关抗原表位

CTL

细胞相关抗原雜

筛选可与NsP16靶向结合的潜在药物分子

2.1

nspl6

基因变异分析从

GenBank

下载30个

冠状病毒基因组序列，并从中获取丨

基因序列。

SARS

〇

-2 —16基因核苷酸序列长894

，毒株

间相似性为99%。

SARS

CoV

-2毒株叫>16基因与

SARS

毒株及

MERS

毒株相应基因的相似性分别为

4 % ~ 85 %和65 %。用

MEGA

5.10软件和

Maximum

中华疾病控制杂志2021年4月第25卷第4期 Chin J Dis Control Prev 2021 Apr; 25(4)

•

441

•

MT814698_SARS-CoV-2/human/EGY/CUNCI-HGC7l026/2020

MT835026_SARS-C

〇

V-2/h u m a n/BR A/R J-DCVN2/2020

MT810774_SARS-CoV-2/human/MEX/SEARCH-1700-TIJ/2020

MT773134_SARS-Co V-2/hu m a n/l N D/G BRC275b/2020

MT682732_SARS-CoV-2/human/ITA/Naples/2020

MT655135_SARS-CoV-2/human/ESP/HUD-98203801/2020

MT582484_SARS-CoV-2/human/DEU/NRW-16/2020

MT499220_SARS-CoV-2/human/TUN/COV1482/2020

MT451803_SARS-CoV-2/human/AUS/VIC1212/2020

MT451799_SARS-CoV-2/human/AUST/IC1208/2020

MT446312_SARS-Co V-2/h uman/Guangzh OU/IQTC05/2020

MT407659_SARS-CoV-2/human/CHN/Zhejiang/OS4/2020

MT339041_SARS-CoV-2/human/USA/AZ-ASU2936/2020

MT324062_SARS-CoV-2/human/ZAF/R03006/2020

MT318827_SARS-CoV-2/human/DEU/HH-1/2020

MT126808_SARS-CoV-2/human/BRA/SP02/2020

MT121215_SARS-CoV-2/human/CHN/Shanghai/SH01/2020

MT049951_SARS-CoV-2/human/CHN/Yunnan/01/2020

LC547533_SARS-CoV-2/human/JPN/P5-3/2020

NC045512_SARS-CoV-2/human/CHN/Wuhan/Hu-1

12020

AY278489_SARS-CoV/human/CHN/Guangdong/GD01/2003

AY278488_SARS-CoV/human/CHN/Beijing/BJ01/2003

AY338175_SARS-CoV/human/CHN/TaiwanrrC2/2005

DQ182595_SARS-CoV/human/CHN/2hejiang/ZJ0301/2003

JX163928_SARS-CoV/human/USA/Tor2/FP1-10895/2010

KU233364_MERS-CoV/human/JOR/Jordan_1/2015

KT326819_M ERS-Co V/h u m an/KO R/KNIH/001 /2015

KX034095_MERS-CoV/KOR/Seou l_066/2015

KU740200_MERS-CoV/camel/EGY/NRCE-NC163/2014

MG923481_MERS-CoV/camel/NGR/NV2020/2016

图

1 SARS-CoV-2

、

SARS

及

MERS

病毒株

—16

基因遗传进化树

Figure 1 Genetic evolutionary tree of

nsp6

genes of SARS-CoV-2, SARS and MERS isolates

丝氨酸

苏氨酸

酪氨酸

阈值

50 100 150 200250

序列位置（氨基酸）

图

2 Nspl6

憐酸化位点

Figure 2 Nspl6 phosphorylation sites

Likelihood

法构建冠状病毒—16基因进化树。见

但无0-糖基化位点。在

NsP

16氨基酸序列的

263

图

。

(Score

= 0. 73)、

24 (

Score

= 0. 50)位置具有

SUMO

2.2

Nspl

6理化性质应用在线工具

Protparam

分

修饰位点。见图

。

析

NsP

18蛋白的理化特征，结果显示

NsP

16的分子 2.5分子结构和保守结构域

PMA

分析结果显

式是

C1493HB3

N393

437S17

，分子质量为33 323.32

Dal

，

Nspl6

具有

helix

(

)、/3

tum

(

t)、extended

strand

长度为298

,等电点为7. 59,在体外哺乳动物网

(

)和

random

coil

(

)4种二级结构和二级结构。保

织红细胞中的半衰期为1.9

，属于稳定蛋白，不稳

守结构域

CDD

模块分析显示

SARS

CoV

-2

Nspl

6(298

定系数为26. 11，脂肪族指数为90. 64,平均亲水系

)具有

SARS

冠状病毒

pfam

06460蛋白（296

)的

数为_〇. 086,属于亲水性蛋白。

保守功能区。

pfam

06460属于

120156蛋白超家族

2.3信号肽和跨膜区在

SignalP

4.0软件中设定

(

superfami

]

)，具有

mRNA

甲基转移酶功能。见图3。

cutoff

为0. 450,分析结果显亦

Nspl

6无信号肽。

2.6蛋白抗原性分析

Nspl6

具有

细胞线性抗

TMPRED

分析（设定

Score

=500)显示

NsP

16具有2

原表位,位于距肽链

端4 ~ 10、15 ~ 37、75 ~

、99 ~

个彼此反向的跨膜螺旋结构。

110、133~ 146、17~ 181、243 〜254(

)位置

。SYF

2.4蛋白修饰位点

P16分子具有磷酸化位点，

PEITHI

分析（设定

Score

= 0 • 2 0 ,

Length

= 9

)显

•

442

•

中华疾病控制杂志2021年4月第25卷第4期 Chin J Dis Control Prev 2021 Apr; 25(4)

SSQAWQPGVAMPNLYKMQRMLLEKCDLQNYGDSATLPKGIMMNVAKYTQLCQYLNTLTLAVPYNMRVIHF

cthcccttcccchhhhhhhhhhhhtccccccccGGCCttcGeGhhhhhhhhhhhhhhcccccttcGeeeG

6AGSDKGVAPGTAVLRQWLPTGTLLVDSDLNDFVSDADSTLIGDCATVHTANKWDLIISDMYDPKTKNVT

ccccccccctthhhhhhhccttcGeeGtchhhhhccttcGGGGccceeccttccGGeeGhccccccccee

KENDSKEGFFTYICGFIQQKLALGGSVAIKITEHSWNADLYKLMGHFAWWTAFVTNVNASSSEAFLIGCN

hccccccceGehhhhhhhhhhcttcceGGGecccccchhhhhhhhhhhhheGGGGehccccchheeeGGh

YLGKPREQIDGWMHANYIFWRNTNPIQLSSYSLFDMSKFPLKLRGTAVMSLKEGQINDMILSLLSKGRL

hhcccccccccceGeeeGGGecccccccccccchhcccccccccccceeeeecttcchhhhhhhhtttce

IIRENNRWISSDVLVNN

GGGttCGGGGGGGGGGGt

寡聚态〇

单体

(匹配预测）

配体〇

GMQEO

QMEANO

0.99 -1.14

lxADN05. lxGTA' lxSAM0^

腺苷

ADN

.2:7 4

以内残基

模型

（》▼

PLIP

相互作用:

1-7•甲基鸟苷-

3-腺苷-5’，5*-

三磷酸

GTA

.3:22 4

以内残基

PUP

相互作用

XSX

腺苷甲硫氨酸：^

结构

佔

比较

全原子

溶合性

扭转分布

-1.71

•1.17

-0.46

残基败

蚩闩粒径（残綦数）

模板序列•-致范围

wks

.1^ 100.00%

描述

3•甲基转移酶

SARS

CoV

-2

nspl

0三元复合体结构

图

3 Nspl6空间结构分析

Figure 3 Analysis of spatial structure of Nspl6

示

Nspl6

具有

HLA-A

* 01限制性

CTL

表位，分别位

于

55 和

144。

2.7

Nspl6

靶向药物分析应用

UrugBank

数据

库，发现

种可耙向结合

P16

的抑制性药物:瑞德

西韦

（Remdesivir

-5734

)和

-44

丨

524

,分子式分

另

为

和

504〇

Remdesivir

是

体侵人细胞。使用

3. 6. 3

中的

ggstatsplot

包对细

胞基因表达的分析发现，

ACE

受体的表达量由高

至

低依次为睾丸

(5. 10)

、

心（2.06)

、

肾

（1.58)

、

脂肪

(

1.20)、

肺

（-0.50)、

肝

（-1. 10)、

神经

（-1.35)、

胃

(-1_90)

、

肌肉

（-2.49)

、

脑

（-3.89)

、

脾

（-6. 17)、

血（

-7. 51

) [9]。睾丸组织中精原细胞（

spermatogo

nia

)

、间质细胞（

leyig

cells

) 及支持细胞（

sertoli

cells

)的

-441524

的药物前体

（

prodrug

),二

者均具有抑制

RNA

聚合酶功效。

3讨论

已有研究[

]显示,

HPV

、单纯胞疹病毒

（herpes

受体呈高表达^1U，且在

SARS

〇

-2

感染者精液中检出该病毒

RNA

n2]

。研

ACE

究提示

SARS

〇

-2

可能侵人睾丸细胞，造成组织和

功能损伤。本研究应用生物信息学技术，探讨病毒

在宿主细胞中表达的

P16

蛋白对男性生殖细胞的

影响，为未来实验探索病毒对男性生殖系统的致病

机制提供了线索。

Nspl6

保守结构域分析显示，该蛋白具有

SARS

冠状病毒

pfam

06460保守功能区；

pfam

06460属于

simplex

virus

HSV

)、

HIV

、

HBV、HCV

和腮腺炎病毒

(mumps

vims

MuV

)等多种病毒感染均危及生殖健

康，被视为男性不育危险因素。其中，

HIV

、

MuV

和

SARS

〇

与睾丸炎有关，可导致男性不育[7]。

SARS

CoV

-2和

SARS

CoV

在人体内均通过

ACE

2受

中华疾病控制杂志202丨年4月第25卷第4期 Chin ■) Dis Control Prev 2021 Apr; 25( 4)

.443

•

20156超家族，具有甲基转移酶活性。因此，

SARS

〇

-2侵人生殖细胞后，在细胞中表达的

Nspl6

可能参与细胞表观遗传的甲基化修饰过程。

据报道，在精子发生过程中，组蛋白甲基化异常可导

致生精细胞异常，引发不育[

]。另有研究显示，精

子印记基因//19、

Peg

3和甲基化水平与胚胎

的停育风险有关，

NsP

16蛋白的甲基转移酶活性可

能影响胚胎发育

]。此外，由于生殖细胞基因甲基

化水平与肿瘤发生存在关联[15]，因此，

NsP

16可能

通过影响细胞核酸和蛋白的甲基化调控，进而影响

男性生殖细胞的生长、发育、变异和凋亡。在

SARS

CoV

-2感染远期效应中，

Nsp

16与男性生殖功

能关系值得未来研究关注。

据报道，

SARS

CoV

感染对男性生殖功能的损

伤与睾丸炎症反应有关[8]。本研究发现

SARS

〇

-2

NsP

16蛋白存在

细胞抗原表位和

CTL

细胞抗原表位，具有典型抗原分子特征,提示该

蛋白可被

细胞和

CTL

细胞识别，激发免疫反应。

因而，表达病毒

NSpl6

蛋白的生殖细胞可能因炎症

反应或受特异性免疫攻击而损伤。本研究结果显示

ARS-Co

-2感染可能通过炎症反应机制累及男性

生殖功能。

已有研究显示蛋白磷酸化、糖基化和

SUMO

翻

译后修饰是蛋白功能调控常见机制[16]。

NsP

16蛋

白存在磷酸化位点和

SUMO

修饰位点，提示磷酸化

和

SUMO

翻译后修饰可能是

NsP

16蛋白功能调控的

主要机制之一。精子微管蛋白糖基化异常可阻碍精

子游动和受精过程[17]，本研究发现

NsP

16蛋白缺乏

〇-糖基化位点，提示

NsP

16蛋白并非通过与精子微

管蛋白竞争性发生

-糖基化反应而干扰受精。

本研究利用

DrugBank

数据库，筛选出

种可与

NsP

16靶点结合的抑制性药物分子。已有研究显

示,

-441524属于核苷类似物，

Remdesivir

是

441524的药物前体（

prodrug

),二者均可以抑制病毒

的复制，作用靶标均为

RNA

聚合酶[

]。目前,

Rem

desivir

已获批临床应用。本研究首次提出这

种药

可能通过与

NsP

16结合产生抗病毒效果，探明这些

药物及其衍生物与

Nsp

〗

分子间的作用及机制，有

望发现可应用于临床的更有效的抗

VID

-19化疗

药物。

此外，本研究显示

SARS

CoV

-2不同毒株

Nspl6

基因序列一致性高达99%，提示以

NsP

16为疫苗抗

原具有很高的免疫保护覆盖率，而以

NsP

16为药物

作用靶标则可能获得针对多种

SARS

〇

-2毒株的

抗病毒效果，因此，该蛋白在疫苗制备及临床治疗中

具有应用潜力。

SARS

〇

-2毒株的似/>16基因与

SARS

CoV

及

MERS

毒株的相应基因序列的一致性

分别为84%〜85%和65%。虽然信息学分析显示3

种病毒的

NsP

16均具有甲基转移酶活性结构域，但

这些在基因序列上存在差异的同源蛋白对生殖细胞

作用及其机制上的异同性目前尚无法推断，需要更

深人的实验研究探明。

总之，本研究提出病毒侵人睾丸组织后，

P16

可能通过其甲基转移酶活性干扰生殖细胞甲基化调

控，进而造成生殖功能异常；同时，在生殖细胞中表

达的

Nsp

16可能通过激发免疫反应和炎症反应，损

伤睾丸组织和生殖功能。此外，研究首次报道可与

Nspl6

靶向结合的

种抑制性化疗药物。在

VID

-19在全球暴发流行而亟需特效药物的状况

下，该研究发现具有重要科学意义和应用价值。

利益冲突无

参考文献

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2020.00499.

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潘海峰（英文）

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(收稿日期：2020-08-30)

(修回日期：2020-ll-08)

本文

编辑：戚良玮

（中文）

方心宇（英文）