2024年3月29日发(作者：朴元忠)
Ｖ０１．３９
２０１８年７月
高等学校化学学报
ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨＩＮＥＳＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＩＥＳ
Ｎｏ．７
１４２７—１４３３
ｄｏｉ：１０．７５０３／ｃｊｃｕ２０１ ８０００２
基于双酶切级联信号放大的核酸检测方法
廉翔 ，吴望华 ，范宏亮 ，张 勇。，张 涛
（１．山西大学化学化工学院，太原０３０００６；
２．浙江大学工业控制技术国家重点实验室，智能系统与控制研究所，分析仪器研究中心，杭州３１００２７；
３．浙江省医学科学院卫生学研究所，杭州３１００１３）
摘要利用茎环结构定位探针构建了一个基于双酶切反应的级联信号放大体系，并将其用于核酸的检测．在
该体系中，茎环结构定位探针首先是内切酶Ｔｔｈ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ １Ｖ的作用底物，被剪切后又作为定位探针介导
切口酶Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ对分子信标实施剪切，将这２步剪切反应结合起来可有效克服切口酶对于目标核酸中特定
识别序列的依赖，同时进一步提高了检测灵敏度．实验结果表明，荧光信号与目标ＤＮＡ浓度的对数值呈线
性相关，响应范围为１ ｐｍｏｌ／Ｌ￣１ ｎｍｏｌ／Ｌ，并且具有良好的识别单碱基变异的能力．此外，本方法序列设计简
单，通用性强，仅改变定位探针的部分序列即可实现对不同目标ＤＮＡ的检测．对掺杂于血清中的目标ＤＮＡ
的检测结果验证了本方法在实际样品检测中的应用潜力．
关键词级联信号放大；分子信标；切口酶；定位探针；核酸检测
０６５５．９ 文献标志码Ａ 中图分类号
核酸的高灵敏、高特异性检测在分子生物学研究、司法鉴定及临床诊断等领域具有重要意义＿ｌ，引．
聚合酶链式反应（ＰＣＲ） 是最早提出的微量核酸扩增技术，也是目前最灵敏、应用最广泛的核酸检
测技术之一，但其热循环过程对仪器设备的要求较高，限制了其在即时检测（Ｐｏｉｎｔ．ｏｆ－ｃａｒｅ ｔｅｓｔｉｎｇ）方面
的应用．近年来，涌现出一系列等温指数扩增方法 ｊ，可以在较温和的恒定温度下进行，而且具有反
应速度快、检测灵敏度高等优点¨ “ ．但这些方法普遍采用较为复杂的引物／探针设计，且无法避免聚
合酶的非特异性扩增产生的背景信号Ｈ ’”Ｊ．因此，进一步发展简单、快速、高灵敏且高特异性的核酸
检测方法仍然十分必要．
分子信标（ＭＢ）是一种非常简单的信号探针，其通过与目标核酸分子杂交即可释放荧光信号¨ ，
具有特异性强、反应迅速等优点，在核酸、蛋白质及各种离子检测等方面得到了广泛应用 ” ．但以
传统ＭＢ作为探针的检测方法也具有明显的局限性，即１个目标分子只能与１个ＭＢ作用，限制了该
方法的检测灵敏度．通常，ＭＢ对核酸的定量检测只能达到约１ ｎｍｏＬ／Ｌ １８，１９］．为了进一步提高灵敏度，
需要与其它信号放大方法联用，其中最常用的是切口酶信号放大（ＮＥＳＡ） ’ ．这些方法设计简单，可
以将检出限降低近３个数量级，在核酸和蛋白质检测中都有应用 ．采用三通结构（Ｔｈｒｅｅ—ｗａｙ
ｉｕｎｃｔｉｏｎ）设计可以解决ＮＥＳＡ对目标核酸分子中特定识别序列的依赖 ，但由于体系中的ＭＢ和辅助
探针分别含有互补的单链识别序列，它们可以在切口酶的帮助下（甚至自发地）形成完整的双链识别序
列，因而容易造成信号泄漏，且单一线性信号放大的检测灵敏度也较低．
前文 曾提出了一种茎环结构的定位探针（ＤＮＡ Ａｌｉｇｎｅｒ，ＤＡ），其茎部包含完整的切口酶识别序
列，两侧臂与目标核酸分子互补．因此，切口酶可以结合在ＤＡ的茎部，并通过ＤＡ两侧臂与目标核酸
分子的杂交而定位于指定位置，进而实施剪切，我们称之为定位探针介导剪切（Ａｌｉｇｎｅｒ—ｍｅｄｉａｔｅｄ
收稿日期：２０１８．０ｌ—ｏ２．网络出版日期：２０１８—０６—２１．
基金项目：国家自然科学基金（批准号：２１２７５１２９）、工业控制技术国家重点实验室自主课题（批准号：ＩＣＴ１８０５）、国家重大科学仪
器设备开发专项（批准号：２０１３ＹＱ４７０７８１）和浙江省医药卫生科技计划项目（批准号：２０１５ＫＹＡ０６１，２０１６ＫＹＢ０７０）资助．
联系人简介：张
张
涛，男，博士，副教授，主要从事生化传感与分析仪器方面的研究．Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈｔａｏ＠ｚｊｕ．ｅｄｕ．Ｃｎ
勇，男，博士，教授，主要从事光谱分析方面的研究．Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｙｏｎｇ＠ＳＸＵ．ｅｄｕ．ｅｌｌ
ｌ４２８ 高等学校化学学报 Ｖｏ１．３９
ｃｌｅａｖａｇｅ，ＡＭＣ）．该方法不需要目标核酸中存在任何特定序列，且只需要一种切口酶即可在任意位置
进行剪切，从而有效克服了切口酶对于目标核酸中识别序列的依赖．在此基础上，本文进一步改进ＤＡ
的结构，设计了一种含脱碱基位点（Ａｂａｓｉｃ Ｓｉｔｅ）的改进定位探针（Ｍｏｄｉｉｆｅｄ ＤＮＡ Ａｌｉｇｎｅｒ，ＭＤＡ），构建
了一个利用内切酶Ｔｔｈ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＶ和切１：１酶Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ进行双酶切反应的级联信号放大体系．在此
体系中，ＭＤＡ既是Ｔｔｈ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＶ的作用底物，被剪切后又可作为介导Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ剪切的定位探
针，将这２步反应结合起来即可实现对目标ＤＮＡ的灵敏检测．
１实验部分
１．１试剂与仪器
实验所用寡核苷酸由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表１；切口酶Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ，内
切酶Ｔｔｈ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＶ，ＮＥＢｕｆｆｅｒ ３．１和ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ购自Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ公司；
ＤＮＡ级水购自Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｉｆｃ公司；其它常用试剂均购自Ｓｉｇｍａ—Ａｌｄｒｉｃｈ公司；健康人血清样本由浙江
大学校医院提供。
Ｔａｂｌｅ １ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
Ｎａｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５＇－３ ）
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ一１（ＭＢ一１）
ＦＡＭ．ＧＣＡＧＴＧＡＣＴＩＴＧＴＡＣＴＧＧＡＣＧＴＧＧＡＧＡＴＡＣＣＧＡＴＩＴＧＴＣＡＣＴＧＣ．Ｄａｂｃｙｌ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ一２（ＭＢ一２）
ＦＡＭ ＣＴＧＣＡＧＴＧＡＣ，ＩｒｒｒＣＴＡＣＴＧＧＡＣＧＴＧＧＡＧＡＴＡＣＣＧＡＴＩＴＧＴＣＡＣＴＧＣＡＧ—Ｄａｂｃｙｌ
ＤＮＡ Ａｌｉｇｎｅｒ（ＤＡ）
ＴＣＧＧＴＡＴＣＴＣＣＴＧＡＣＴＣＡＣＧＴｒＩ ＩＴＣＧＴＧＡＧＴＣＡＡＣＧＴＣＣＡＧＴＡＣ
ＧＣＡＧＴＧＡＡＣＴＣＡＧＧＴＡＧＡＧＴＣＡＡＣ Ｇ Ｔ Ｃ ＣＡＧＴＡＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＴＧＣＴＣＡＣＡＴ—
Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ Ａｌｉｇｎｅｒ（ＭＤＡ）
ＧＡＧＴｒＣＧＧ Ｉ＇ＡＴＣＴＣＣＴＧＡＣＴＣＴＡＣＣＴＧＡＧ ＩＴＣＡＣＴＧＣ
Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ Ａｌｉｇｎｅｒ—ＦＡＭ ＦＡＭ—ＧＣＡＣＴＧＡＡＣＴＣＡＧＧＴＡＧＡＧＴＣＡＡＣ Ｇ Ｔ Ｃ ＣＡＧＴＡＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＴＧＣＴＣＡ．
（ＭＤＡ—ＦＡＭ）
ＣＡＴＧＡＧ Ｉ’Ｉ’ＣＧＧＴＡＴＣＴＣＣＴＧＡＣＴＣＴＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＡＣＴＧＣ
ＧＣＡＧＴＧＡＡＣＴＣＡＧＧＴＡＧＡＧＴＣＡＡＣ Ｇ Ｔ Ｃ ＣＡＧＴＡＣＡＣＣＡＣＴＣＡＡＣＣ ＩｒｒＣＴＡＧＡＣＴ．
Ｍｏｄｉｉｆｅｄ ＤＮＡ Ａｌｉｇｎｅｒ－１（ＭＤＡ一１）
ＧＡＣＴＣＴＣＧＧＴＡＴＣＴＣＣＴＧＡＣＴＣＴＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＡＣＴＧＣ
ＧＣＡＧＴＧＡＡＣＴＣＡＧＣＴＡＧＡＧＴＣＡＡＣ Ｇ Ｔ Ｃ ＣＡＧＴＡＣＴＧＣＴＣＡＣＡＴＣＴＧＡＴＴＣＧＡＣＡＣＴＧＴ—
Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ Ａｌｉｇｎｅｒ一２（ＭＤＡ一２）
ＣＡＣＴＣＧＧＴＡＴＣＴＣＣＴＧＡＣＴＣＴＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＡＣＴＧＣ
Ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ
ＡＣＴＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＴＧ
Ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ一１（Ｔ－１）
ＧＡＧＴＣＡＧＴＣ ｎ ＧＡＡＧＧ ＩＴＧＡＧＴＧＧＴ
Ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ－２（Ｔ一２）
ＧＴＧＡＣＡＧＴＧＴＣＧＡＡＴＣＡＧＡＴＧＴＧＡＧＣＡ
Ｍｕｔａｎｔ ｔｒａｇｅｔ ＤＮＡ一１（ＭＴ－１）
ＡＣＴＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＧｃＴＧＡＣＡＣ ＩＴＧ
Ｍｕｔａｎｔ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ一２（ＭＴ一２）
ＡＣＴＣＡｃＧＴＧＡＧＣＡＡ（ ＴＧＡＣＡＣ １］ Ｇ
Ｍｕｔａｎｔ ｔｒａｇｅｔ ＤＮＡ一３（ＭＴ一３）
ＡＣＴｇＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＧｃＴＧＡＣＡＣａＴＧ
￥Ｔｈｅ ａｓｔｅｒｉｓｋｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈｅ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈ０ｒｏｔｈｉｏａｔｉｏｎ·Ｔｈｅ ｂａｓｅｓ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈｅ ａｂａｓｉｃ ｓｉｔｅｓ．Ｔｈｅ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ ｂａｓｅｓ ｉｎ ｔａｒｇｅｔ ｓｈｏｗ
ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．
荧光光谱在岛津公司ＲＦ ５３０１ＰＣ型荧光光度计上测定；变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）实验在
美国伯乐公司Ｂｉｏ—Ｒａｄ ＰｏｗｅｒＰａｃ 电泳仪上完成；凝胶图像通过上海培清科技公司ｊｓ一２０１２型凝胶成像
分析仪采集．
１．２定位探针介导剪切实验
反应体系的总体积为２５ Ｌ，包含１００ ｎｍｏｌ／Ｌ ＭＢ．１，１０ Ｕ Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ，１ｘ ＮＥ Ｂｕｆｆｅｒ ３．１（ｐＨ＝７．９，
１００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣＩ＋５０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ—ＨＣＩ＋１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣ１２＋１００ ｐ．ｇ／ｍＬ ＢＳＡ）和不同浓度的ＤＡ．将混合溶
液于５５℃水浴中孵育１ ｈ，再于８０℃水浴中加热２０ ｍｉｎ使Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ失活；最后将产物转移到１５％的
变性聚丙烯酰胺凝胶中，室温下施加１８０ Ｖ恒压，约４０ ｍｉｎ后停止，用凝胶成像仪采集图像．
１．３ 目标ＤＮＡ的检测
将１００ ｎｍｏｌ／Ｌ ＭＤＡ，１０ Ｕ Ｔｔｈ ＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅⅣ，不同浓度的目标ＤＮＡ及１×缓冲溶液（３５ ｍｍｏＬ／Ｌ
Ｔｒｉｓ—ＨＣＩ＋５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣＩ＋５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ＋５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣ１２＋１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ４＋５ ｍｍｏｌ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４＋
１００ ｇ／ｍＬ ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ一１００）于５５ ｅＩ二水浴中混合、孵育后，加入１５０ ｎｍｏｌ／Ｌ ＭＢ．２和１０ Ｕ Ｎｔ．
ＢｓｔＮＢＩ．反应溶液在５５℃下继续孵育１５ ｍｉｎ，将得到的反应产物稀释至１００ ，使用荧光光度计测定
廉翔等：基于双酶切级联信号放大的核酸检测方法
荧比发射光 ，激发波长为４８５ ｎ１１１．为Ｊ 验 办法刈‘于二复杂牛物样品的愉测能力，将ｆ Ｉ怀ＤＮＡ ＪＪｌＩ入
钏术 处 的健 人ｍ１＿清中，按ｆ 述操作过 进行榆测，并将检测结果 标准溶液 验洲试所ｆ 结
进 比较．
２结果与讨论
２．１ 双酶切级联信号放大检测目标ＤＮＡ的原理
定ｆ 探针介 （ＡＭＣ）的原删ｆｕ１ １（Ａ）所，Ｊｊ，琏于双酶切反嘘的级联 放人ｆ小系的
ｆ ｌ（Ｂ）昕／Ｊ ．反Ｊ、 ｆ 系包含１个改进的茎环结构定ｆ 探针（ＭＤＡ）、分子信ｆ，Ｊ 探＂（Ｍｌ｛）、『人Ｊ切怖ＴＩｈ
Ｅｒｉ ｃ｛ｏｎｕｃｌｅａｓ ｌＶ干【Ｊ Ｉ １酶Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ．ＭＤＡ¨Ｊ １个较ｋ的 部｝＿ｊ环，＂ｆｌ￣ｅ－ｌ［成， ｒｆ Ｉ拳邴 近』１：的化 仃
Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ的｝Ｊ 圳 列，环Ｊ 包含与ＭＢ的环， Ｖ，Ｊ／ 列（序列１，４币ｌ】５）以及Ｉ 『Ｉ Ｉ）Ｎ Ａ ＸＬ）ｌ，的序列
（Ｊ １ ２ ｆＩＩ ３），Ｊｉ ｆ Ｊ ０ ２干【 Ｊ３之ｆ １Ｊｆｊｌ入１个脱协扼ＪＩ ｆ ．Ｔｔｌ１ －ＩｄｏｌＩＨＣＩ（＇ＬＩＳ（ ＩＶ址·币Ｉｔ＝Ｉ＝ＩＬｆ 定骸酸Ｉ Ｊ、Ｊ ｌＪＪ
胁，川‘水 舣链１）ＮＡ中的脱碱堆位点．１Ｉ】 ｊ ＭＩ｛ 补的序列分别佗Ｊ Ｍ１）Ａ环ｎ，ＪｌｌＩ』ｆＪＪ！『Ｊ，ｌｌ＿受 环结构
ｆＩ，Ｊ 护， … ｛ １，ｆ 口 ＤＮＡ时，ＭＩ）Ａ ＭＩ｛分圳保持自 稳定的拳环 构．… ｛ 『ｌ １）ＮＡ
时，它 ｊ ＭＩ）Ａ的环形成双链结十句，此时ＭＩ）Ａ的脱诚摹位点处会被 … Ｉ＇ｌｎｄ．，ｎ ｉｌＳＩ、ｌ 水晰断裂，
他 Ｉｉ ｆ，Ｊ：Ｉ）ＮＡ 埸’ｊ ＭＩ）Ａ分离， 进一少’ｊ新的川）Ａ作用，实现第一步 Ｉ ‘放人； ｊ一力 ，断裂
的ＭＩ）Ａ…ｔ Ｊ‘ｌＩ仃较Ｋ的茎部仍町保持ＮＩ． ｌＮＢＩ的 链识别序列．１ｌｆ ‘侧忖ｆ－ ｊ Ｍｌ｛Ｉｆ【０环 交．从
作为定化探＂ｔ介 Ｎｔ．ＢｓｔＮＢｌ埘ＭＢ进行衙ｊ１ ，实现第ｌｌ＿－步信 ‘放人．
Ｆｉｇ．１ Ｓｃｈｅｍａｔｉｃｓ ｏｆ ＡＭＣ（Ａ）ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｃａｓｃａｄｅ ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ（Ｂ）
２．２可行－ｌ生研究
为便＿ｒ比较， 先考察了定位探针介导Ｎｔ．ＢｓｔＮ…剪切ＭＢ实验． ２（Ａ）爪…Ｊ １ ㈨浓Ｊ芝的
仃 时，ＮＩ． ＮＢＩ对ＭＢ一１（１００ ｎｍｏＬ／Ｉ ）进行剪 的变性聚丙烯酰胺凝胶 ，ｊ 泳逊ｌ～７分圳
对成于浓度为０，０．１，０．２，１，２，ｌ０及１００ ｎｍｏｌ／１ 的１）Ａ．可见，当１）Ａ的浓瞍人Ｊ １…川，ｌ／ｌ 叫‘．Ｍｌ｛一ｌ
Ｆｉｇ．２ Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ＰＡＧＥ ｉｍａｇｅ（Ａ）ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒａ（Ｂ）ｏｆ ｔｈｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ＭＢ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｖａｒｉｅｄ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＤＡ ａｎｄ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ＰＡＧＥ ｉｍａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ＭＤＡ ａｎｄ／ｏｒ ＭＢ ｗｉｔｈ ｕｒ
ｗｉｔｈｏｕｔ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ（Ｃ）
１４３０ 高等学校化学学报 Ｖｏｌ＿３９
（４４ ｎｔ）全部被剪切为２５ ｎｔ的产物．这一方面证明了定位探针介导Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ剪切分子信标的可行性，
另一方面也显示了切口酶的信号放大作用，例如，即使ＤＡ的浓度只有ＭＢ一１的１％，也可实现对全部
ＭＢ一１的剪切，相较于传统的分子信标与目标分子的一对一作用，灵敏度明显提高．但是，当ＤＡ的浓
度低至０．２ ｎｍｏＵＬ时，即便反应较长时间（１ ｈ）也仅有约１／２的ＭＢ一１被剪切，说明该信号放大作用不
超过５００倍．荧光光谱［图２（Ｂ）］也表明，当仅使用Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ时无法区分１０ ｐｍｏ￣Ｌ的ＤＡ与背景信
号．这可以解释为什么早期的ＮＥＳＡ方法检出限高于ｐｍｏｌ／Ｌ …．
为证明双酶切级联信号放大反应可行性，研究了体系中包含不同组分时２种酶Ｔｔｈ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ
Ⅳ和Ｎｔ．ＢｓｔＮＢ１分别对荧光标记的定位探针（ＭＤＡ—ＦＡＭ）和分子信标ＭＢ一２的剪切行为．如图２（Ｃ）所
示，当体系中不存在目标ＤＮＡ时，ＭＤＡ—ＦＡＭ和ＭＢ．２均未被剪切（泳道１）；而当体系中存在Ｔｔｈ
Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ １Ｖ和目标ＤＮＡ时，ＭＤＡ．ＦＡＭ的条带消失，同时出现了１条约４５ ｎｔ的新条带（泳道３）．
对比泳道２可知，仅在目标ＤＮＡ存在时，才能触发Ｔｔｈ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＶ对ＭＤＡ－ＦＡＭ的剪切．继续同时
引入ＭＢ一２和Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ，可以观察到另１条约２７ ｎｔ的新条带，为ＭＢ一２被Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ剪切的产物
（泳道６）．以上结果表明，目标ＤＮＡ首先诱导了ＭＤＡ—ＦＡＭ被Ｔｔｈ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ １Ｖ剪切，产生了“活化”
的定位探针，进而继续介导Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ对ＭＢ．２实施剪切．这与图１（Ｂ）所示的反应机理完全吻合，证明
了双酶切级联信号放大反应的可行性．
２．３反应条件的优化
为了提高检测的灵敏度，使用１ ｎｍｏ￣Ｌ的目标ＤＮＡ对实验条件进行了优化．首先考察了分子信标
浓度对检测结果的影响，即在不同ＭＢ一２浓度下（２５，５０，１００，１５０和２００ ｎｍｏｌ／Ｌ）观察目标ＤＮＡ存在
与不存在时的荧光信号．本文采用荧光比率（ 一１）作为评价指标，其中Ｆ和 分别表示有、无目标
ＤＮＡ时５２０ ｎｍ处的荧光强度．该值越大，越容易区分阳性信号与背景信号，也越有利于获得更高的灵
敏度．如图３（Ａ）所示，尽管随着ＭＢ．２浓度的增加，由目标ＤＮＡ引起的阳性荧光信号显著增强，但同
时也伴随着背景信号的逐渐升高．图３（Ｂ）示出了不同浓度ＭＢ一２所对应的荧光比率，该值在［ＭＢ一２］＝
１５０ ｎｍｏ￣Ｌ时达到最大，故选择１５０ ｎｍｏｌ／Ｌ的ＭＢ－２进行后续实验．
在确定了ＭＢ．２的优化浓度后，进一步考察了反应时间对检测结果的影响．图３（Ｃ）和（Ｄ）示出了
反应时间分别为１０，１５，３０，６０，９０和１２０ ｍｉｎ所获得的荧光曲线与荧光比率值．从荧光发射光谱图中
ｌ Ｏ
暑
墨
—
Ｏ ８
０．６
０ ４
§
§
Ｏ ２
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２５ ５Ｏ ｌ００ ｌ５０ ２００
ｃ（ＭＢ－２）／（ｎｍｏｌ Ｌ ）
２２５
１８Ｏ
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Ｗｉｔｈｏｕｔｔａｒｇｅｔ
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Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ：
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Ｆｉｇ．３ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ（Ａ，Ｂ）ａｎｄ ｒｅａｃｉｔｏｎ ｉｔｍｅ（Ｃ，Ｄ）
Ｎｏ．７ 廉翔等：基于双酶切级联信号放大的核酸检测方法
可以看出，随着反应时间的延长背景信号上升较快，但阳性信号在３０ ｒａｉｎ后增长已经变得很缓慢，因
此宜选用较短的反应时问．图３（Ｄ）所示的荧光比率也证实了这一点，其最大值出现在约１５ ｍｉｎ．因此，
选择１５ ｒａｉｎ的剪切时间来进行后续实验．
２．４检测方法的灵敏度
在优化的反应条件下，考察了该方法对目标ＤＮＡ检测的灵敏度．由图４（Ａ）所示的荧光发射光谱
可见，随着目标ＤＮＡ的浓度从１ ｐｍｏＬ／Ｌ增加到１００ ｎｍｏ￣Ｌ，荧光强度也逐渐升高．图４（Ｂ）插图示出
了目标ＤＮＡ的浓度在１ ｐｍｏ￣Ｌ－１ ｎｍｏ￣Ｌ范围内时，荧光强度与目标ＤＮＡ浓度对数值（１ ）的线性关
系，线性回归方程为ｙ：３２．９７１ｇｃ＋１７８．０６，相关系数Ｒ ０．９９６５（ｙ代表５２０ ｎｍ发射峰的荧光强度，
ｃ代表目标ＤＮＡ的浓度）．此结果与仅用ＭＢ作为信号探针¨ ， 及早期的ＮＥＳＡ检测方法 相比，
检出限分别降低了３～４和１～２个数量级．
’
．
曼
∞
芒
２
０
三
Ｉｌ时、 ｌ１∞ｌ＿ｌｇ ｕＩ ｏＱｌ１００∞ｐＨ０声一
Ｆｉｇ．４ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒａ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｖａｒｉｅｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ（Ａ１ ａｎｄ
ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ａｒｇｅｔｔ ＤＮＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（Ｂ）
Ｉｎｓｅｔ ｏｆ（Ｂ）ｉｓ ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｐｌｏｔ．
２．５检测方法的特异性
为了探究本方法对目标ＤＮＡ中碱基错配的识别能力，分别测定了目标ＤＮＡ、单碱基变异序列
（ＭＴ．１）、双碱基变异序列（ＭＴ一２）和三碱基变异序
列（ＭＴ一３）所引起的荧光信号．由图５可见，即使只
有１个碱基错配（ＭＴ一１），其荧光比率值（ 一１）
也只有目标ＤＮＡ的２５％，随着碱基错配数量增加
到３个（ＭＴ一３），其荧光信号已与背景信号非常接
近，这说明本方法具有较高的特异性，可以很好地
区分目标序列中的单个碱基变异．
２．６检测方法的通用性
除高灵敏度、高特异性外，本方法还具有通用 Ｆｉｇ·５
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｏｎｅ－，
ｔｗｏ－，ｔｈｒｅｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｕｔａｎｔ ａｎｄ ｗｉｌｄ
性强、序列设计简单等优点，只需改变ＭＤＡ上与
目标ＤＮＡ互补的序列，即可实现对不同目标ＤＮＡ
ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ
的检测：图６示出了对另外２条目标序列（Ｔ一１和Ｔ一２）的检测结果，其线性范围为１ ｐｍｏ￣Ｌ～１ ｎｍｏ￣Ｌ，
对应的线性关系分别为ｌ，＝１５．２４１ｇｃ＋８７．７８（Ｒ ０．９８６１）和ｙ＝３０．８０１ｇｃ＋１６１．４０（Ｒ ０．９８０７），检出限
分别为３和２ ｐｍｏ￣Ｌ．
此外，还考察了该方法对于复杂生物样品中目标ＤＮＡ的检测能力．将不同浓度的目标ＤＮＡ掺杂
于健康人血清中，然后进行检测．如图７所示，获得的荧光发射光谱及线性关系均与标准样品溶液测
试所得结果相似（线性范围为１ ｐｍｏ￣Ｌ－１ ｎｍｏ￣Ｌ），表明本方法在实际样品检测中具有较好的抗干扰
能力．在响应范围１ ｐｍｏ￣Ｌ～１ ｎｍｏ￣Ｌ内，选取了３个不同浓度目标序列的３组平行数据进行了回收率
考察．结果（表２）表明，本方法对掺杂于健康人血清中的目标序列进行检测的回收率为８３．１％一
１１７．７％．
１４３２ 高等学校化学学报 ＶｏＩ．３９
２２５
３５０
３００
１８０
２５０
ｌ１．矗、 ｌｌ∞ＩＩ ｌＩ ０ｌｌ８呐 Ｈ
１３５
０鼻＿『
２００
９０
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ｃ（Ｔ—１）／（ｎｍｏｌ Ｌ。。１
ｃ（Ｔ－２）／（ｎｍｏｌ Ｌ一 、
Ｆｉｇ．６ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ Ｔ·１（Ａ）ａｎｄ Ｔ－２（Ｂ）
Ｉｎｓｅｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｐｌｏｔｓ．
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Ｆｉｇ．７ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒａ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｖａ￣ｅｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｔｒｇｅｔ ＤＮＡ ｓｐｉｋｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ（Ａ）ａｎｄ
ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（Ｂ）
Ｉｎｓｅｔ ｏｆ（Ｂ）ｉｓ ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｐｌｏｔ．
Ｔａｂｌｅ ２ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ａｄｄｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｓａｍｐｌｅｓ
３ 结 论
利用改进的茎环结构探针，结合内切酶Ｔｔｈ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＶ和切口酶Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ构建了一个双酶切
级联信号放大体系，实现了对目标ＤＮＡ的灵敏检测，线性范围在ｌ ｐｍｏ［／Ｌ １ ｎｔｎｏＬ／Ｌ之间。相较于传
统的使用ＭＢ作为信号探针的检测方法，检出限降低了３～４个数量级，并且可以很好地区分目标ＤＮＡ
上的单个碱基变异．另外，本方法还具有序列设计简单、通用性强等优点，对血清等复杂样本具有很好
的适应性，在核酸分子检测中具有重要价值．
参考文献
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廉翔等：基于双酶切级联信号放大的核酸检测方法
加
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１７
［２４］Ｗｕ Ｗ．Ｈ．，Ｚｈａｎｇ Ｔ．，Ｈａｎ Ｄ．，Ｆａｎ Ｈ．Ｌ．，Ｚｈｕ Ｇ．Ｚ．，Ｄｉｎｇ Ｘ．，Ｗｕ Ｃ．Ｃ．，Ｙｏｕ Ｍ．Ｘ．，Ｑｉｕ Ｌ．Ｐ．，Ｌｉ Ｊ．，Ｚｈａｎｇ Ｌ．Ｑ．，Ｌｉａｎ Ｘ．，Ｈｕ
Ｒ．，Ｍｕ Ｙ．，Ｚｈｏｕ Ｊ．Ｇ．，Ｔａｎ Ｗ．Ｈ＿，Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２０１８，９（１１），３０５０－－３０５５
Ｄｕａｌ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ－ｂａｓｅｄ Ｃａｓｃａｄｅ Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ＊
ＬＩＡＮ Ｘｉａｎｇ ，ＷＵ Ｗａｎｇｈｕａ ，ＦＡＮ Ｈｏｎｇｌｉａｎｇ ，ＺＨＡＮＧ Ｙｏｎｇｈ
，
ＺＨＡＮＧ Ｔａｏ
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｈａｎｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｙｕａｎ ０３０００６，Ｃｈｉｎａ；
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Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆ ｏＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｔｔａｎｇｚｈｏｕ ３ １００２７，Ｃｈｉｎａ；
３．Ｄｅｐａｒｔｅｎｔｍ ｆＥｎｖｉｏｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｅ，ｎＩｓｔｎｉｔｕｔｅ ｏｆＨｙｇｉｅｎｅ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｆＭｅｄｉｏｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００１３，Ｃｈｉａ）ｎ
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｄｕａｌ ｅｎｚｙｍｅ ｃｌｅａｖａｇｅ－ｂａｓｅｄ ｃａｓｃａｄｅ ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．
Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｙｓｔｅｍ，ａ ｍｏｄｉｉｆｅｄ ＤＮＡ ａｌｉｇｎｅｒ（ＭＤＡ）ｔｈａｔ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａｎ ａｂａｓｉｃ ｓｉｔｅ ｗａｓ ｆｉｒｓｔ ｃｌｅａｖｅｄ ｂｙ Ｔｔｈ Ｅｎｄｏｎｕ—
ｃｌｅａｓｅ ＩＶ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｓｅｒｖｅｄ ａｓ ａｎ ａｌｉｇｎｅｒ ｔｏ ｍｅｄｉａｔｅ ｔｈｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｂｅａｃｏｎ ｂｙ ｎｉｃｋｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ．Ｔｈｅｓｅ ｃａｓｃａｄｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｏｖｅｒｃａｍｅ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ，ｂｕｔ ａｌｓｏ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒ ＣＯＩＴｅ—
ｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｏｇａｒｉｔｈｍ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（１ｇｃ）ｒａｎｇｉｎｇ ｆｒｏｍ １
ｐｍｏｌｆＬ ｔｏ １ ｎｍｏｌ／Ｌ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｔｈｅ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ａｌｓｏ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｇｏｏｄ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ ｂａｓｅ
ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ．Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ａｌｓｏ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｓｉｍｐｌｅ ｐｒｏｂｅ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ ｕｎｉｖｅｒｓａｌｉｔｙ．
Ｂｙ ｍｏｄｉ￣ｉｎｇ ａ ｓｍａｌｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｎ ＭＤＡ’ｓ ｌｏｏｐ，ｉｔ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｅｎｓｅ ｖａｒｉｏｕｓ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡｓ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ
ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ｓｐｉｋｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａｐｐｌｙｉｎｇ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｒｅａｌ ｓａｍｐｌｅｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ Ｃａｓｃａｄｅ ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ；Ｎｉｃｋｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ；ＤＮＡ ａｌｉｇｎｅｒ；Ｎｕｃｌｅｉｃ
ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
（Ｅｄ．：Ｎ，Ｋ）
十Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ（Ｎｏ．２１２７５１２９），ｔｈｅ Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎａ（Ｎｏ．ＩＣＴ１８０５），ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｋｅｙ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｔｉｉｆｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｈｉｎａ
（Ｎｏ．２０１３ＹＱ４７０７８１）ａｎｄ ｔｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｏｆ Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ（Ｎｏｓ．２０１５ＫＹＡ０６１，２０１６ＫＹＢ０７０）．
2024年3月29日发(作者：朴元忠)
Ｖ０１．３９
２０１８年７月
高等学校化学学报
ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨＩＮＥＳＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＩＥＳ
Ｎｏ．７
１４２７—１４３３
ｄｏｉ：１０．７５０３／ｃｊｃｕ２０１ ８０００２
基于双酶切级联信号放大的核酸检测方法
廉翔 ，吴望华 ，范宏亮 ，张 勇。，张 涛
（１．山西大学化学化工学院，太原０３０００６；
２．浙江大学工业控制技术国家重点实验室，智能系统与控制研究所，分析仪器研究中心，杭州３１００２７；
３．浙江省医学科学院卫生学研究所，杭州３１００１３）
摘要利用茎环结构定位探针构建了一个基于双酶切反应的级联信号放大体系，并将其用于核酸的检测．在
该体系中，茎环结构定位探针首先是内切酶Ｔｔｈ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ １Ｖ的作用底物，被剪切后又作为定位探针介导
切口酶Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ对分子信标实施剪切，将这２步剪切反应结合起来可有效克服切口酶对于目标核酸中特定
识别序列的依赖，同时进一步提高了检测灵敏度．实验结果表明，荧光信号与目标ＤＮＡ浓度的对数值呈线
性相关，响应范围为１ ｐｍｏｌ／Ｌ￣１ ｎｍｏｌ／Ｌ，并且具有良好的识别单碱基变异的能力．此外，本方法序列设计简
单，通用性强，仅改变定位探针的部分序列即可实现对不同目标ＤＮＡ的检测．对掺杂于血清中的目标ＤＮＡ
的检测结果验证了本方法在实际样品检测中的应用潜力．
关键词级联信号放大；分子信标；切口酶；定位探针；核酸检测
０６５５．９ 文献标志码Ａ 中图分类号
核酸的高灵敏、高特异性检测在分子生物学研究、司法鉴定及临床诊断等领域具有重要意义＿ｌ，引．
聚合酶链式反应（ＰＣＲ） 是最早提出的微量核酸扩增技术，也是目前最灵敏、应用最广泛的核酸检
测技术之一，但其热循环过程对仪器设备的要求较高，限制了其在即时检测（Ｐｏｉｎｔ．ｏｆ－ｃａｒｅ ｔｅｓｔｉｎｇ）方面
的应用．近年来，涌现出一系列等温指数扩增方法 ｊ，可以在较温和的恒定温度下进行，而且具有反
应速度快、检测灵敏度高等优点¨ “ ．但这些方法普遍采用较为复杂的引物／探针设计，且无法避免聚
合酶的非特异性扩增产生的背景信号Ｈ ’”Ｊ．因此，进一步发展简单、快速、高灵敏且高特异性的核酸
检测方法仍然十分必要．
分子信标（ＭＢ）是一种非常简单的信号探针，其通过与目标核酸分子杂交即可释放荧光信号¨ ，
具有特异性强、反应迅速等优点，在核酸、蛋白质及各种离子检测等方面得到了广泛应用 ” ．但以
传统ＭＢ作为探针的检测方法也具有明显的局限性，即１个目标分子只能与１个ＭＢ作用，限制了该
方法的检测灵敏度．通常，ＭＢ对核酸的定量检测只能达到约１ ｎｍｏＬ／Ｌ １８，１９］．为了进一步提高灵敏度，
需要与其它信号放大方法联用，其中最常用的是切口酶信号放大（ＮＥＳＡ） ’ ．这些方法设计简单，可
以将检出限降低近３个数量级，在核酸和蛋白质检测中都有应用 ．采用三通结构（Ｔｈｒｅｅ—ｗａｙ
ｉｕｎｃｔｉｏｎ）设计可以解决ＮＥＳＡ对目标核酸分子中特定识别序列的依赖 ，但由于体系中的ＭＢ和辅助
探针分别含有互补的单链识别序列，它们可以在切口酶的帮助下（甚至自发地）形成完整的双链识别序
列，因而容易造成信号泄漏，且单一线性信号放大的检测灵敏度也较低．
前文 曾提出了一种茎环结构的定位探针（ＤＮＡ Ａｌｉｇｎｅｒ，ＤＡ），其茎部包含完整的切口酶识别序
列，两侧臂与目标核酸分子互补．因此，切口酶可以结合在ＤＡ的茎部，并通过ＤＡ两侧臂与目标核酸
分子的杂交而定位于指定位置，进而实施剪切，我们称之为定位探针介导剪切（Ａｌｉｇｎｅｒ—ｍｅｄｉａｔｅｄ
收稿日期：２０１８．０ｌ—ｏ２．网络出版日期：２０１８—０６—２１．
基金项目：国家自然科学基金（批准号：２１２７５１２９）、工业控制技术国家重点实验室自主课题（批准号：ＩＣＴ１８０５）、国家重大科学仪
器设备开发专项（批准号：２０１３ＹＱ４７０７８１）和浙江省医药卫生科技计划项目（批准号：２０１５ＫＹＡ０６１，２０１６ＫＹＢ０７０）资助．
联系人简介：张
张
涛，男，博士，副教授，主要从事生化传感与分析仪器方面的研究．Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈｔａｏ＠ｚｊｕ．ｅｄｕ．Ｃｎ
勇，男，博士，教授，主要从事光谱分析方面的研究．Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｙｏｎｇ＠ＳＸＵ．ｅｄｕ．ｅｌｌ
ｌ４２８ 高等学校化学学报 Ｖｏ１．３９
ｃｌｅａｖａｇｅ，ＡＭＣ）．该方法不需要目标核酸中存在任何特定序列，且只需要一种切口酶即可在任意位置
进行剪切，从而有效克服了切口酶对于目标核酸中识别序列的依赖．在此基础上，本文进一步改进ＤＡ
的结构，设计了一种含脱碱基位点（Ａｂａｓｉｃ Ｓｉｔｅ）的改进定位探针（Ｍｏｄｉｉｆｅｄ ＤＮＡ Ａｌｉｇｎｅｒ，ＭＤＡ），构建
了一个利用内切酶Ｔｔｈ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＶ和切１：１酶Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ进行双酶切反应的级联信号放大体系．在此
体系中，ＭＤＡ既是Ｔｔｈ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＶ的作用底物，被剪切后又可作为介导Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ剪切的定位探
针，将这２步反应结合起来即可实现对目标ＤＮＡ的灵敏检测．
１实验部分
１．１试剂与仪器
实验所用寡核苷酸由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表１；切口酶Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ，内
切酶Ｔｔｈ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＶ，ＮＥＢｕｆｆｅｒ ３．１和ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ购自Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ公司；
ＤＮＡ级水购自Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｉｆｃ公司；其它常用试剂均购自Ｓｉｇｍａ—Ａｌｄｒｉｃｈ公司；健康人血清样本由浙江
大学校医院提供。
Ｔａｂｌｅ １ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
Ｎａｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５＇－３ ）
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ一１（ＭＢ一１）
ＦＡＭ．ＧＣＡＧＴＧＡＣＴＩＴＧＴＡＣＴＧＧＡＣＧＴＧＧＡＧＡＴＡＣＣＧＡＴＩＴＧＴＣＡＣＴＧＣ．Ｄａｂｃｙｌ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ一２（ＭＢ一２）
ＦＡＭ ＣＴＧＣＡＧＴＧＡＣ，ＩｒｒｒＣＴＡＣＴＧＧＡＣＧＴＧＧＡＧＡＴＡＣＣＧＡＴＩＴＧＴＣＡＣＴＧＣＡＧ—Ｄａｂｃｙｌ
ＤＮＡ Ａｌｉｇｎｅｒ（ＤＡ）
ＴＣＧＧＴＡＴＣＴＣＣＴＧＡＣＴＣＡＣＧＴｒＩ ＩＴＣＧＴＧＡＧＴＣＡＡＣＧＴＣＣＡＧＴＡＣ
ＧＣＡＧＴＧＡＡＣＴＣＡＧＧＴＡＧＡＧＴＣＡＡＣ Ｇ Ｔ Ｃ ＣＡＧＴＡＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＴＧＣＴＣＡＣＡＴ—
Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ Ａｌｉｇｎｅｒ（ＭＤＡ）
ＧＡＧＴｒＣＧＧ Ｉ＇ＡＴＣＴＣＣＴＧＡＣＴＣＴＡＣＣＴＧＡＧ ＩＴＣＡＣＴＧＣ
Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ Ａｌｉｇｎｅｒ—ＦＡＭ ＦＡＭ—ＧＣＡＣＴＧＡＡＣＴＣＡＧＧＴＡＧＡＧＴＣＡＡＣ Ｇ Ｔ Ｃ ＣＡＧＴＡＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＴＧＣＴＣＡ．
（ＭＤＡ—ＦＡＭ）
ＣＡＴＧＡＧ Ｉ’Ｉ’ＣＧＧＴＡＴＣＴＣＣＴＧＡＣＴＣＴＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＡＣＴＧＣ
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Ｍｏｄｉｉｆｅｄ ＤＮＡ Ａｌｉｇｎｅｒ－１（ＭＤＡ一１）
ＧＡＣＴＣＴＣＧＧＴＡＴＣＴＣＣＴＧＡＣＴＣＴＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＡＣＴＧＣ
ＧＣＡＧＴＧＡＡＣＴＣＡＧＣＴＡＧＡＧＴＣＡＡＣ Ｇ Ｔ Ｃ ＣＡＧＴＡＣＴＧＣＴＣＡＣＡＴＣＴＧＡＴＴＣＧＡＣＡＣＴＧＴ—
Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ Ａｌｉｇｎｅｒ一２（ＭＤＡ一２）
ＣＡＣＴＣＧＧＴＡＴＣＴＣＣＴＧＡＣＴＣＴＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＡＣＴＧＣ
Ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ
ＡＣＴＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＴＧ
Ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ一１（Ｔ－１）
ＧＡＧＴＣＡＧＴＣ ｎ ＧＡＡＧＧ ＩＴＧＡＧＴＧＧＴ
Ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ－２（Ｔ一２）
ＧＴＧＡＣＡＧＴＧＴＣＧＡＡＴＣＡＧＡＴＧＴＧＡＧＣＡ
Ｍｕｔａｎｔ ｔｒａｇｅｔ ＤＮＡ一１（ＭＴ－１）
ＡＣＴＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＧｃＴＧＡＣＡＣ ＩＴＧ
Ｍｕｔａｎｔ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ一２（ＭＴ一２）
ＡＣＴＣＡｃＧＴＧＡＧＣＡＡ（ ＴＧＡＣＡＣ １］ Ｇ
Ｍｕｔａｎｔ ｔｒａｇｅｔ ＤＮＡ一３（ＭＴ一３）
ＡＣＴｇＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＧｃＴＧＡＣＡＣａＴＧ
￥Ｔｈｅ ａｓｔｅｒｉｓｋｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈｅ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈ０ｒｏｔｈｉｏａｔｉｏｎ·Ｔｈｅ ｂａｓｅｓ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈｅ ａｂａｓｉｃ ｓｉｔｅｓ．Ｔｈｅ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ ｂａｓｅｓ ｉｎ ｔａｒｇｅｔ ｓｈｏｗ
ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．
荧光光谱在岛津公司ＲＦ ５３０１ＰＣ型荧光光度计上测定；变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）实验在
美国伯乐公司Ｂｉｏ—Ｒａｄ ＰｏｗｅｒＰａｃ 电泳仪上完成；凝胶图像通过上海培清科技公司ｊｓ一２０１２型凝胶成像
分析仪采集．
１．２定位探针介导剪切实验
反应体系的总体积为２５ Ｌ，包含１００ ｎｍｏｌ／Ｌ ＭＢ．１，１０ Ｕ Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ，１ｘ ＮＥ Ｂｕｆｆｅｒ ３．１（ｐＨ＝７．９，
１００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣＩ＋５０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ—ＨＣＩ＋１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣ１２＋１００ ｐ．ｇ／ｍＬ ＢＳＡ）和不同浓度的ＤＡ．将混合溶
液于５５℃水浴中孵育１ ｈ，再于８０℃水浴中加热２０ ｍｉｎ使Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ失活；最后将产物转移到１５％的
变性聚丙烯酰胺凝胶中，室温下施加１８０ Ｖ恒压，约４０ ｍｉｎ后停止，用凝胶成像仪采集图像．
１．３ 目标ＤＮＡ的检测
将１００ ｎｍｏｌ／Ｌ ＭＤＡ，１０ Ｕ Ｔｔｈ ＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅⅣ，不同浓度的目标ＤＮＡ及１×缓冲溶液（３５ ｍｍｏＬ／Ｌ
Ｔｒｉｓ—ＨＣＩ＋５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣＩ＋５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ＋５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣ１２＋１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ４＋５ ｍｍｏｌ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４＋
１００ ｇ／ｍＬ ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ一１００）于５５ ｅＩ二水浴中混合、孵育后，加入１５０ ｎｍｏｌ／Ｌ ＭＢ．２和１０ Ｕ Ｎｔ．
ＢｓｔＮＢＩ．反应溶液在５５℃下继续孵育１５ ｍｉｎ，将得到的反应产物稀释至１００ ，使用荧光光度计测定
廉翔等：基于双酶切级联信号放大的核酸检测方法
荧比发射光 ，激发波长为４８５ ｎ１１１．为Ｊ 验 办法刈‘于二复杂牛物样品的愉测能力，将ｆ Ｉ怀ＤＮＡ ＪＪｌＩ入
钏术 处 的健 人ｍ１＿清中，按ｆ 述操作过 进行榆测，并将检测结果 标准溶液 验洲试所ｆ 结
进 比较．
２结果与讨论
２．１ 双酶切级联信号放大检测目标ＤＮＡ的原理
定ｆ 探针介 （ＡＭＣ）的原删ｆｕ１ １（Ａ）所，Ｊｊ，琏于双酶切反嘘的级联 放人ｆ小系的
ｆ ｌ（Ｂ）昕／Ｊ ．反Ｊ、 ｆ 系包含１个改进的茎环结构定ｆ 探针（ＭＤＡ）、分子信ｆ，Ｊ 探＂（Ｍｌ｛）、『人Ｊ切怖ＴＩｈ
Ｅｒｉ ｃ｛ｏｎｕｃｌｅａｓ ｌＶ干【Ｊ Ｉ １酶Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ．ＭＤＡ¨Ｊ １个较ｋ的 部｝＿ｊ环，＂ｆｌ￣ｅ－ｌ［成， ｒｆ Ｉ拳邴 近』１：的化 仃
Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ的｝Ｊ 圳 列，环Ｊ 包含与ＭＢ的环， Ｖ，Ｊ／ 列（序列１，４币ｌ】５）以及Ｉ 『Ｉ Ｉ）Ｎ Ａ ＸＬ）ｌ，的序列
（Ｊ １ ２ ｆＩＩ ３），Ｊｉ ｆ Ｊ ０ ２干【 Ｊ３之ｆ １Ｊｆｊｌ入１个脱协扼ＪＩ ｆ ．Ｔｔｌ１ －ＩｄｏｌＩＨＣＩ（＇ＬＩＳ（ ＩＶ址·币Ｉｔ＝Ｉ＝ＩＬｆ 定骸酸Ｉ Ｊ、Ｊ ｌＪＪ
胁，川‘水 舣链１）ＮＡ中的脱碱堆位点．１Ｉ】 ｊ ＭＩ｛ 补的序列分别佗Ｊ Ｍ１）Ａ环ｎ，ＪｌｌＩ』ｆＪＪ！『Ｊ，ｌｌ＿受 环结构
ｆＩ，Ｊ 护， … ｛ １，ｆ 口 ＤＮＡ时，ＭＩ）Ａ ＭＩ｛分圳保持自 稳定的拳环 构．… ｛ 『ｌ １）ＮＡ
时，它 ｊ ＭＩ）Ａ的环形成双链结十句，此时ＭＩ）Ａ的脱诚摹位点处会被 … Ｉ＇ｌｎｄ．，ｎ ｉｌＳＩ、ｌ 水晰断裂，
他 Ｉｉ ｆ，Ｊ：Ｉ）ＮＡ 埸’ｊ ＭＩ）Ａ分离， 进一少’ｊ新的川）Ａ作用，实现第一步 Ｉ ‘放人； ｊ一力 ，断裂
的ＭＩ）Ａ…ｔ Ｊ‘ｌＩ仃较Ｋ的茎部仍町保持ＮＩ． ｌＮＢＩ的 链识别序列．１ｌｆ ‘侧忖ｆ－ ｊ Ｍｌ｛Ｉｆ【０环 交．从
作为定化探＂ｔ介 Ｎｔ．ＢｓｔＮＢｌ埘ＭＢ进行衙ｊ１ ，实现第ｌｌ＿－步信 ‘放人．
Ｆｉｇ．１ Ｓｃｈｅｍａｔｉｃｓ ｏｆ ＡＭＣ（Ａ）ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｃａｓｃａｄｅ ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ（Ｂ）
２．２可行－ｌ生研究
为便＿ｒ比较， 先考察了定位探针介导Ｎｔ．ＢｓｔＮ…剪切ＭＢ实验． ２（Ａ）爪…Ｊ １ ㈨浓Ｊ芝的
仃 时，ＮＩ． ＮＢＩ对ＭＢ一１（１００ ｎｍｏＬ／Ｉ ）进行剪 的变性聚丙烯酰胺凝胶 ，ｊ 泳逊ｌ～７分圳
对成于浓度为０，０．１，０．２，１，２，ｌ０及１００ ｎｍｏｌ／１ 的１）Ａ．可见，当１）Ａ的浓瞍人Ｊ １…川，ｌ／ｌ 叫‘．Ｍｌ｛一ｌ
Ｆｉｇ．２ Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ＰＡＧＥ ｉｍａｇｅ（Ａ）ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒａ（Ｂ）ｏｆ ｔｈｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ＭＢ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｖａｒｉｅｄ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＤＡ ａｎｄ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ＰＡＧＥ ｉｍａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ＭＤＡ ａｎｄ／ｏｒ ＭＢ ｗｉｔｈ ｕｒ
ｗｉｔｈｏｕｔ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ（Ｃ）
１４３０ 高等学校化学学报 Ｖｏｌ＿３９
（４４ ｎｔ）全部被剪切为２５ ｎｔ的产物．这一方面证明了定位探针介导Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ剪切分子信标的可行性，
另一方面也显示了切口酶的信号放大作用，例如，即使ＤＡ的浓度只有ＭＢ一１的１％，也可实现对全部
ＭＢ一１的剪切，相较于传统的分子信标与目标分子的一对一作用，灵敏度明显提高．但是，当ＤＡ的浓
度低至０．２ ｎｍｏＵＬ时，即便反应较长时间（１ ｈ）也仅有约１／２的ＭＢ一１被剪切，说明该信号放大作用不
超过５００倍．荧光光谱［图２（Ｂ）］也表明，当仅使用Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ时无法区分１０ ｐｍｏ￣Ｌ的ＤＡ与背景信
号．这可以解释为什么早期的ＮＥＳＡ方法检出限高于ｐｍｏｌ／Ｌ …．
为证明双酶切级联信号放大反应可行性，研究了体系中包含不同组分时２种酶Ｔｔｈ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ
Ⅳ和Ｎｔ．ＢｓｔＮＢ１分别对荧光标记的定位探针（ＭＤＡ—ＦＡＭ）和分子信标ＭＢ一２的剪切行为．如图２（Ｃ）所
示，当体系中不存在目标ＤＮＡ时，ＭＤＡ—ＦＡＭ和ＭＢ．２均未被剪切（泳道１）；而当体系中存在Ｔｔｈ
Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ １Ｖ和目标ＤＮＡ时，ＭＤＡ．ＦＡＭ的条带消失，同时出现了１条约４５ ｎｔ的新条带（泳道３）．
对比泳道２可知，仅在目标ＤＮＡ存在时，才能触发Ｔｔｈ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＶ对ＭＤＡ－ＦＡＭ的剪切．继续同时
引入ＭＢ一２和Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ，可以观察到另１条约２７ ｎｔ的新条带，为ＭＢ一２被Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ剪切的产物
（泳道６）．以上结果表明，目标ＤＮＡ首先诱导了ＭＤＡ—ＦＡＭ被Ｔｔｈ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ １Ｖ剪切，产生了“活化”
的定位探针，进而继续介导Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ对ＭＢ．２实施剪切．这与图１（Ｂ）所示的反应机理完全吻合，证明
了双酶切级联信号放大反应的可行性．
２．３反应条件的优化
为了提高检测的灵敏度，使用１ ｎｍｏ￣Ｌ的目标ＤＮＡ对实验条件进行了优化．首先考察了分子信标
浓度对检测结果的影响，即在不同ＭＢ一２浓度下（２５，５０，１００，１５０和２００ ｎｍｏｌ／Ｌ）观察目标ＤＮＡ存在
与不存在时的荧光信号．本文采用荧光比率（ 一１）作为评价指标，其中Ｆ和 分别表示有、无目标
ＤＮＡ时５２０ ｎｍ处的荧光强度．该值越大，越容易区分阳性信号与背景信号，也越有利于获得更高的灵
敏度．如图３（Ａ）所示，尽管随着ＭＢ．２浓度的增加，由目标ＤＮＡ引起的阳性荧光信号显著增强，但同
时也伴随着背景信号的逐渐升高．图３（Ｂ）示出了不同浓度ＭＢ一２所对应的荧光比率，该值在［ＭＢ一２］＝
１５０ ｎｍｏ￣Ｌ时达到最大，故选择１５０ ｎｍｏｌ／Ｌ的ＭＢ－２进行后续实验．
在确定了ＭＢ．２的优化浓度后，进一步考察了反应时间对检测结果的影响．图３（Ｃ）和（Ｄ）示出了
反应时间分别为１０，１５，３０，６０，９０和１２０ ｍｉｎ所获得的荧光曲线与荧光比率值．从荧光发射光谱图中
ｌ Ｏ
暑
墨
—
Ｏ ８
０．６
０ ４
§
§
Ｏ ２
Ｏ
２５ ５Ｏ ｌ００ ｌ５０ ２００
ｃ（ＭＢ－２）／（ｎｍｏｌ Ｌ ）
２２５
１８Ｏ
ｆＣ１
气
…一
—
Ｗｉｔｈｏｕｔｔａｒｇｅｔ
Ｗｉｔｈ ｔａｒｇｅｔ
Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ：
２ ８
２ １
矗
．昌
－＿
８
ａ
８
２
０
三
霉一
ｏｎ ｔｈｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ
１ ４
０ ７
０
１０ ｌ５ ３Ｏ ６０
ｔ／ｍｉｎ
９Ｏ ｌ２０
Ｆｉｇ．３ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ（Ａ，Ｂ）ａｎｄ ｒｅａｃｉｔｏｎ ｉｔｍｅ（Ｃ，Ｄ）
Ｎｏ．７ 廉翔等：基于双酶切级联信号放大的核酸检测方法
可以看出，随着反应时间的延长背景信号上升较快，但阳性信号在３０ ｒａｉｎ后增长已经变得很缓慢，因
此宜选用较短的反应时问．图３（Ｄ）所示的荧光比率也证实了这一点，其最大值出现在约１５ ｍｉｎ．因此，
选择１５ ｒａｉｎ的剪切时间来进行后续实验．
２．４检测方法的灵敏度
在优化的反应条件下，考察了该方法对目标ＤＮＡ检测的灵敏度．由图４（Ａ）所示的荧光发射光谱
可见，随着目标ＤＮＡ的浓度从１ ｐｍｏＬ／Ｌ增加到１００ ｎｍｏ￣Ｌ，荧光强度也逐渐升高．图４（Ｂ）插图示出
了目标ＤＮＡ的浓度在１ ｐｍｏ￣Ｌ－１ ｎｍｏ￣Ｌ范围内时，荧光强度与目标ＤＮＡ浓度对数值（１ ）的线性关
系，线性回归方程为ｙ：３２．９７１ｇｃ＋１７８．０６，相关系数Ｒ ０．９９６５（ｙ代表５２０ ｎｍ发射峰的荧光强度，
ｃ代表目标ＤＮＡ的浓度）．此结果与仅用ＭＢ作为信号探针¨ ， 及早期的ＮＥＳＡ检测方法 相比，
检出限分别降低了３～４和１～２个数量级．
’
．
曼
∞
芒
２
０
三
Ｉｌ时、 ｌ１∞ｌ＿ｌｇ ｕＩ ｏＱｌ１００∞ｐＨ０声一
Ｆｉｇ．４ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒａ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｖａｒｉｅｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ（Ａ１ ａｎｄ
ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ａｒｇｅｔｔ ＤＮＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（Ｂ）
Ｉｎｓｅｔ ｏｆ（Ｂ）ｉｓ ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｐｌｏｔ．
２．５检测方法的特异性
为了探究本方法对目标ＤＮＡ中碱基错配的识别能力，分别测定了目标ＤＮＡ、单碱基变异序列
（ＭＴ．１）、双碱基变异序列（ＭＴ一２）和三碱基变异序
列（ＭＴ一３）所引起的荧光信号．由图５可见，即使只
有１个碱基错配（ＭＴ一１），其荧光比率值（ 一１）
也只有目标ＤＮＡ的２５％，随着碱基错配数量增加
到３个（ＭＴ一３），其荧光信号已与背景信号非常接
近，这说明本方法具有较高的特异性，可以很好地
区分目标序列中的单个碱基变异．
２．６检测方法的通用性
除高灵敏度、高特异性外，本方法还具有通用 Ｆｉｇ·５
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｏｎｅ－，
ｔｗｏ－，ｔｈｒｅｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｕｔａｎｔ ａｎｄ ｗｉｌｄ
性强、序列设计简单等优点，只需改变ＭＤＡ上与
目标ＤＮＡ互补的序列，即可实现对不同目标ＤＮＡ
ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ
的检测：图６示出了对另外２条目标序列（Ｔ一１和Ｔ一２）的检测结果，其线性范围为１ ｐｍｏ￣Ｌ～１ ｎｍｏ￣Ｌ，
对应的线性关系分别为ｌ，＝１５．２４１ｇｃ＋８７．７８（Ｒ ０．９８６１）和ｙ＝３０．８０１ｇｃ＋１６１．４０（Ｒ ０．９８０７），检出限
分别为３和２ ｐｍｏ￣Ｌ．
此外，还考察了该方法对于复杂生物样品中目标ＤＮＡ的检测能力．将不同浓度的目标ＤＮＡ掺杂
于健康人血清中，然后进行检测．如图７所示，获得的荧光发射光谱及线性关系均与标准样品溶液测
试所得结果相似（线性范围为１ ｐｍｏ￣Ｌ－１ ｎｍｏ￣Ｌ），表明本方法在实际样品检测中具有较好的抗干扰
能力．在响应范围１ ｐｍｏ￣Ｌ～１ ｎｍｏ￣Ｌ内，选取了３个不同浓度目标序列的３组平行数据进行了回收率
考察．结果（表２）表明，本方法对掺杂于健康人血清中的目标序列进行检测的回收率为８３．１％一
１１７．７％．
１４３２ 高等学校化学学报 ＶｏＩ．３９
２２５
３５０
３００
１８０
２５０
ｌ１．矗、 ｌｌ∞ＩＩ ｌＩ ０ｌｌ８呐 Ｈ
１３５
０鼻＿『
２００
９０
ｌ５０
１０Ｏ
４５
５０
ｃ（Ｔ—１）／（ｎｍｏｌ Ｌ。。１
ｃ（Ｔ－２）／（ｎｍｏｌ Ｌ一 、
Ｆｉｇ．６ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ Ｔ·１（Ａ）ａｎｄ Ｔ－２（Ｂ）
Ｉｎｓｅｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｐｌｏｔｓ．
３７５
３００
尝２２５
ｇ １５０
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ｔ１．嚣～ １【∞ｌＩｏ＿ｌＩ ０ｌ１ ０啪０＿Ｉｏｊ
０
．ＩＩ Ｂ／ ｌｌ∞ｌ１０苔一０。Ｉ１ 。 ａＪ０ｎｌ
５００ ５２０ ５４０ ５６０ ５８０
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０ ２０ ４０ ６０ ８０ ｌ００
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ｃ（Ｔａｒｇｅｔ）／（ｎｍｏｌ’Ｌ ）
Ｆｉｇ．７ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒａ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｖａ￣ｅｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｔｒｇｅｔ ＤＮＡ ｓｐｉｋｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ（Ａ）ａｎｄ
ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（Ｂ）
Ｉｎｓｅｔ ｏｆ（Ｂ）ｉｓ ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｐｌｏｔ．
Ｔａｂｌｅ ２ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ａｄｄｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｓａｍｐｌｅｓ
３ 结 论
利用改进的茎环结构探针，结合内切酶Ｔｔｈ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＶ和切口酶Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ构建了一个双酶切
级联信号放大体系，实现了对目标ＤＮＡ的灵敏检测，线性范围在ｌ ｐｍｏ［／Ｌ １ ｎｔｎｏＬ／Ｌ之间。相较于传
统的使用ＭＢ作为信号探针的检测方法，检出限降低了３～４个数量级，并且可以很好地区分目标ＤＮＡ
上的单个碱基变异．另外，本方法还具有序列设计简单、通用性强等优点，对血清等复杂样本具有很好
的适应性，在核酸分子检测中具有重要价值．
参考文献
Ｔａｎ Ｗ．Ｈ．，Ｄｏｎｏｖａｎ Ｍ．Ｊ．，Ｊｉａｎｇ Ｊ．Ｈ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，２０１３，１１３（４），２８４２－－２８６２
Ｚｈａｏ Ｙ．Ｘ．，Ｃｈｅｎ Ｆ．，Ｌｉ Ｑ．，Ｗａｎｇ Ｌ．Ｈ．，Ｆａｎ Ｃ．Ｈ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，２０１５，１１５（２２），１２４９１－－１２５４５
Ｓｏｎｋａｒ Ｓ．Ｃ．，Ｓａｃｈｄｅｖ Ｄ．，Ｍｉｓｈｒａ Ｐ．Ｋ．，Ｋｕｍａｒ Ａ．，Ｍｉｔｔａｌ Ｐ．，Ｓａｌｕｊａ Ｄ．，Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｅｔｒｏｎ．，２０１６，８６，４１～４７
Ｓａｎｄｅｒｓ Ｒ．，Ｍａｓｏｎ Ｄ．Ｊ．，Ｆｏｙ Ｃ．Ａ．，Ｈｕｇｇｅｒ Ｊ．Ｆ．，Ａｎａ１．Ｂｉｏａｎａ１．Ｃｈｅｍ．，２０１４，４０６（２６），６４７ｌ一６＿４８３
Ｃｈｅｎ Ｇ．Ｈ＿，Ｔａｎｇ ｘ．Ｙ．，Ｓｕｎ Ｙ．，Ｚｈｏｕ Ｌ．，Ｌｉ Ｄ．，Ｂａｉ Ｙ．，Ｍａｉ Ｋ．Ｊ．，Ｌｉ Ｙ．Ｙ．，Ｗｕ Ｑ．Ｗ．，Ｍａ Ｊ．Ｙ．， Ｖｉｒｏ１．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１８，２５１，
ｌ２９—１３２
Ｃｈｅｎ Ｐ．Ｐ．，Ｐｅｎｇ Ｗ．，Ｚｈａｎｇ Ｙ．Ｘ．，Ｃｈｅｎ Ｊ．Ｂ．，Ｊｉａｎｇ Ｘ．Ｍ．，Ｚｈｅｎｇ Ｃ．Ｂ．，Ｈｏｕ Ｘ．Ｄ．，Ａｎａ１．Ｃｈｅｍ．，２０１６，８８（２４），１２３８６－－１２３９２
Ｘｕ Ｗ．Ｔ．，Ｗａｎｇ Ｃ．Ｇ．，Ｚｈｕ Ｐ．Ｙ．，Ｇｕｏ Ｔ．Ｘ．，Ｘｕ Ｙ．Ｃ．，Ｈｕａｎｇ Ｋ．Ｌ．，Ｌｕｏ Ｙ．Ｂ．，Ａｎａｌｙｓｔ，２０１６，１４１（８），２５４２－－２５５２
Ｘｕ Ｙ．Ｚ．，Ｎｉｕ Ｃ．，Ｘｉａｏ，Ｘ．Ｆ．，Ｚｈｕ Ｗ．Ｙ．，Ｄａｉ Ｚ．，Ｚｏｕ Ｘ．Ｙ．，Ａｎａ１．Ｃｈｅｍ．，２０１５，８７（５）２９４５－－２９５１
Ｋｏｎｇ ｘ．Ｊ．，Ｗｕ Ｓ．，Ｃｅｎ Ｙ．，Ｃｈｅｎ Ｔ．Ｔ．，Ｙｕ Ｒ．Ｑ．，Ｃｈｕ Ｘ．，Ａｎａｌｙｓｔ，２０１６，１４１（１４），４３７３—４３８０
Ｎｏ．７
ｍ¨ Ｍ ＂
廉翔等：基于双酶切级联信号放大的核酸检测方法
加
，１９６—２１１
１４３３
Ｌｉ Ｊ．，Ｍａｃｄｏｎａｉｄ Ｊ．，Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，２０１５，
Ｄｅｎｇ Ｈ．Ｍ．，Ｇａｏ Ｚ．Ｑ．，Ａｎａ１．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２０１５，８５３（１），３０—４５
Ｔａｎ Ｅ．，Ｅｒｗｉｎ Ｂ．，Ｄａｍｅｓ Ｓ．，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ Ｔ．，Ｂｕｅｃｈｅｌ Ｍ．，Ｉ￣ｉｎｅ Ｂ．，Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ Ｋ．，Ｎｉｅｍｚ Ａ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００８，４７（３８），９９８７－－９９９９
Ｓｈｉｎｄｅ Ｄ．Ｎ．，Ｒａｍｔｒｅｚｂｏｒｒｅｒｏ Ａ．Ｊ．，Ｈｉｎｔｚｅ Ａ．，Ａｄａｍｉ Ｃ．，Ｎｉｅｍｚ Ａ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１２，４０（１１），ｅ８７
Ｔｙａｓ４ Ｓ．，Ｋｒａｍｅｒ Ｆ．Ｒ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１．，１９９６，１４（３），３０３—３Ｏ８
Ｄｏｎｇ Ｈ．Ｆ．，Ｍｅｎｇ Ｘ．Ｄ．，Ｄａｉ Ｗ．Ｈ．，Ｃａｏ Ｙ．，Ｌｕ Ｈ．Ｔ．，Ｚｈｏｕ Ｓ．Ｆ．，Ｚｈａｎｇ Ｘ．Ｊ．，Ａｎａ１．Ｃｈｅｍ．，２０１５，８７（８），４３３４—４３４Ｏ
Ｚｈａｎｇ Ｗ．Ｃ．，Ｈｕ Ｆ．，Ｚｈａｎｇ Ｑ．，Ｚｈａｎｇ Ｊ．Ｑ．，Ｍａｏ Ｙ．Ｂ．，Ｗａｎｇ Ｐ．，Ｇｕ Ｙ．Ｑ．，Ｔａｌａｎｔａ，２０１８，１７９，６８５—６９２
Ｚｈａｎｇ Ｌ．Ｌ．，Ｗｏｎｇ Ｊ．Ｘ．Ｈ．，Ｌｉ ｘ．Ｃ．，Ｌｉ Ｙ．Ｃ．，Ｙｕ Ｈ＿Ｚ．，Ａｎａ１．Ｃｈｅｍ．，２０１５，８７（１０），５Ｏ６２—５０６７
Ｚｈａｎｇ Ｐ．，Ｂｅｃｋ Ｔ．，Ｔａｎ Ｗ．Ｈ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ． ￡．删．，２００１， Ｏ（２），４０２－－４０５
Ｘｕ Ｈ．，Ｚｈａｎｇ Ｒ．Ｂ．，Ｌｉ Ｆ．，Ｚｈｏｕ Ｙ．Ｙ．，Ｐｅｎｇ Ｔ．，Ｗａｎｇ Ｘ．Ｄ．，Ｓｈｅｎ Ｚ．Ｆ．，Ａｎａ１．Ｂｉｏａｎａ１．Ｃｈｅｍ．，２０１６，４０８（２２），６１８１—６１８８
Ｌｉ Ｊ．ｗ．Ｊ．，Ｃｈｕ Ｙ．Ｚ．，Ｌｅｅ Ｂ．Ｙ．Ｈ．，Ｘｉｅ Ｘ．Ｌ．Ｓ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｓ Ｒｅｓ．，２００８，３６（６），ｅ３６ ｄ
Ｚｈａｏ Ｙ．Ｘ．，Ｃｈｅｎ Ｆ．，Ｗｕ Ｙ．Ｙ．，Ｄｏｎｇ Ｙ．Ｈ．，Ｆａｎ Ｃ．Ｈ．，Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，２０１３，４２（１），５６—６１
Ｘｕ Ｗ．，Ｘｕｅ Ｘ．Ｊ．，Ｌｉ Ｔ．Ｈ．，Ｚｅｎｇ Ｈ．Ｑ．，Ｌｉｕ Ｘ．Ｇ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，２００９，４８（３７），６８４９－－６８５２
Ｋｏｎｇ Ｒ．Ｍ．，Ｚｈａｎｇ Ｘ．Ｂ．，Ｚｈａｎｇ Ｌ．Ｌ．，Ｈｕａｎｇ Ｙ．，Ｌｕ Ｄ．Ｑ．，Ｔａｎ Ｗ．Ｈ．，Ｓｈｅｎ Ｇ．Ｌ．，Ｒｕ Ｒ．Ｑ．，Ａｎａ１．Ｃｈｅｍ．，２０１１，盯（１），１４—
１７
［２４］Ｗｕ Ｗ．Ｈ．，Ｚｈａｎｇ Ｔ．，Ｈａｎ Ｄ．，Ｆａｎ Ｈ．Ｌ．，Ｚｈｕ Ｇ．Ｚ．，Ｄｉｎｇ Ｘ．，Ｗｕ Ｃ．Ｃ．，Ｙｏｕ Ｍ．Ｘ．，Ｑｉｕ Ｌ．Ｐ．，Ｌｉ Ｊ．，Ｚｈａｎｇ Ｌ．Ｑ．，Ｌｉａｎ Ｘ．，Ｈｕ
Ｒ．，Ｍｕ Ｙ．，Ｚｈｏｕ Ｊ．Ｇ．，Ｔａｎ Ｗ．Ｈ＿，Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２０１８，９（１１），３０５０－－３０５５
Ｄｕａｌ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ－ｂａｓｅｄ Ｃａｓｃａｄｅ Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ＊
ＬＩＡＮ Ｘｉａｎｇ ，ＷＵ Ｗａｎｇｈｕａ ，ＦＡＮ Ｈｏｎｇｌｉａｎｇ ，ＺＨＡＮＧ Ｙｏｎｇｈ
，
ＺＨＡＮＧ Ｔａｏ
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｈａｎｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｙｕａｎ ０３０００６，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｙｂｅｒ—ｓｙｓｔｅＴ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏ１．
Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆ ｏＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｔｔａｎｇｚｈｏｕ ３ １００２７，Ｃｈｉｎａ；
３．Ｄｅｐａｒｔｅｎｔｍ ｆＥｎｖｉｏｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｅ，ｎＩｓｔｎｉｔｕｔｅ ｏｆＨｙｇｉｅｎｅ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｆＭｅｄｉｏｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００１３，Ｃｈｉａ）ｎ
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｄｕａｌ ｅｎｚｙｍｅ ｃｌｅａｖａｇｅ－ｂａｓｅｄ ｃａｓｃａｄｅ ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．
Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｙｓｔｅｍ，ａ ｍｏｄｉｉｆｅｄ ＤＮＡ ａｌｉｇｎｅｒ（ＭＤＡ）ｔｈａｔ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａｎ ａｂａｓｉｃ ｓｉｔｅ ｗａｓ ｆｉｒｓｔ ｃｌｅａｖｅｄ ｂｙ Ｔｔｈ Ｅｎｄｏｎｕ—
ｃｌｅａｓｅ ＩＶ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｓｅｒｖｅｄ ａｓ ａｎ ａｌｉｇｎｅｒ ｔｏ ｍｅｄｉａｔｅ ｔｈｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｂｅａｃｏｎ ｂｙ ｎｉｃｋｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ．Ｔｈｅｓｅ ｃａｓｃａｄｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｏｖｅｒｃａｍｅ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ，ｂｕｔ ａｌｓｏ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒ ＣＯＩＴｅ—
ｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｏｇａｒｉｔｈｍ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（１ｇｃ）ｒａｎｇｉｎｇ ｆｒｏｍ １
ｐｍｏｌｆＬ ｔｏ １ ｎｍｏｌ／Ｌ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｔｈｅ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ａｌｓｏ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｇｏｏｄ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ ｂａｓｅ
ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ．Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ａｌｓｏ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｓｉｍｐｌｅ ｐｒｏｂｅ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ ｕｎｉｖｅｒｓａｌｉｔｙ．
Ｂｙ ｍｏｄｉ￣ｉｎｇ ａ ｓｍａｌｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｎ ＭＤＡ’ｓ ｌｏｏｐ，ｉｔ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｅｎｓｅ ｖａｒｉｏｕｓ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡｓ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ
ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ｓｐｉｋｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａｐｐｌｙｉｎｇ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｒｅａｌ ｓａｍｐｌｅｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ Ｃａｓｃａｄｅ ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ；Ｎｉｃｋｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ；ＤＮＡ ａｌｉｇｎｅｒ；Ｎｕｃｌｅｉｃ
ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
（Ｅｄ．：Ｎ，Ｋ）
十Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ（Ｎｏ．２１２７５１２９），ｔｈｅ Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎａ（Ｎｏ．ＩＣＴ１８０５），ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｋｅｙ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｔｉｉｆｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｈｉｎａ
（Ｎｏ．２０１３ＹＱ４７０７８１）ａｎｄ ｔｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｏｆ Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ（Ｎｏｓ．２０１５ＫＹＡ０６１，２０１６ＫＹＢ０７０）．