2024年4月2日发(作者：梁易蓉)
WB的原理、操作及注意事项
原理：
通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，
对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫
测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的
靶蛋白。 一、抗原的选择和制备 A：样品的制备 1 组织：
组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP
buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-
ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，
用时取出，直接溶解上样。 2 细胞：
细胞的处理方法： 离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收
集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-
ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，
用时取出，直接溶解上样。 3 分泌蛋白的提取（特例）：
直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。 B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原
因 1.双缩脲法：
双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。在需要快速，但不很准确的测定
中，常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双缩脲法的
原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在
540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。干
扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，
即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m
NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。
法：
此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱
性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得
到深蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L～400mg/L含量的蛋白质
溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在
会使结果严重偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环
境中才稳定，上述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的
Cu2+-蛋白质溶液中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效
地被Cu2+-蛋白质络合物所还原。 3.紫外吸收法：
大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色
氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果
没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白质溶
液。部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时，所测
得的蛋白质浓度必须作适当校正，一般按下述公式粗略计算：
2024年4月2日发(作者：梁易蓉)
WB的原理、操作及注意事项
原理：
通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，
对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫
测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的
靶蛋白。 一、抗原的选择和制备 A：样品的制备 1 组织：
组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP
buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-
ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，
用时取出，直接溶解上样。 2 细胞：
细胞的处理方法： 离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收
集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-
ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，
用时取出，直接溶解上样。 3 分泌蛋白的提取（特例）：
直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。 B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原
因 1.双缩脲法：
双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。在需要快速，但不很准确的测定
中，常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双缩脲法的
原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在
540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。干
扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，
即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m
NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。
法：
此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱
性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得
到深蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L～400mg/L含量的蛋白质
溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在
会使结果严重偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环
境中才稳定，上述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的
Cu2+-蛋白质溶液中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效
地被Cu2+-蛋白质络合物所还原。 3.紫外吸收法：
大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色
氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果
没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白质溶
液。部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时，所测
得的蛋白质浓度必须作适当校正，一般按下述公式粗略计算：