2024年4月4日发(作者：兆永福)

。

固态发酵漆酶活性测定：

酶液制取：5g发酵样品以1:20（W/V）比例用蒸馏水悬浮，200 r/min摇3h，

之后5000 r/min离心20min。（上清用0.45µm滤纸过滤，于-20℃保存滤液，取

能整除的滤液体积用于漆酶活性测定。）

酶活反应体系3.0mL（2.3mL 0.2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液；pH=4.5

0.5mL粗酶液稀释液；0.2mL 1mmol/L的ABTS）

420nm处测定吸光值的变化。

此实验固态发酵漆酶活性计算公式：

NV

总

OD

420

10

3

100mL

U(/g)

V

酶

36000TL0.5mL5g

N：酶液稀释倍数

V

总

: 漆酶酶活测定反应体体系的终体积（mL）

V

酶

: 反应添加的酶液体积（mL）

△OD

420

: t时间内反应液在420nm处吸光度的增加值

36000: 420nm处ABTS氧化态的摩尔吸光系数(L/mol·cm)

T：反应时间（min）

L为比色皿的直径（cm）。

100mL/(0.5mL×5g)：固态变成液态的稀释倍数

-可编辑修改-

。

液态发酵漆酶活性测定：

酶活反应体系3.0mL（2.3mL 0.2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液；pH=4.5

0.5mL粗酶液稀释液；0.2mL 1mmol/L的ABTS）

U(/g)

N：酶液稀释倍数

N



V

总



OD

420

10

3

V

酶

36000TL

V

总

: 漆酶酶活测定反应体体系的终体积（mL）

V

酶

: 反应添加的酶液体积（mL）

△OD

420

: t时间内反应液在420nm处吸光度的增加值

36000: 420nm处ABTS氧化态的摩尔吸光系数(L/mol·cm)

T：反应时间（min）

L为比色皿的直径（cm）。

-可编辑修改-

。

固态发酵锰过氧化物酶（MnP）活性测定：

酶液制取：粗酶液制备发酵过程中每隔 2 d 取 5 g 发酵物于 250 mL 三

角瓶中，加入 100 mL H

2

O，在 200 r / min 的摇床中振荡提取 3 h，之后5000

r/min离心20min。（用滤纸过滤后，取滤液用于测定MnP 酶活性。）

在 4 mL 反应体系中含 50 mmol/L( pH 4 ～5) 的乳酸钠缓冲液 3. 4 mL，

1. 6 mmol/L 的硫酸锰溶液0. 1 mL，酶液 0. 4 mL，预热至 37 ℃ 时，加 1. 6

mmol / L的 H

2

O

2

溶液 0. 1 mL 启动反应。在 238 nm 紫外光处，测定反应 4

min 内OD

238

差值。在对照组中，以煮沸灭活 15 min 酶液代替原酶液，以蒸

馏水代替H

2

O

2

溶液，其他反应物不变。每分钟使1 μmol/L的 Mn

2 +

转化为 Mn

3

+

所需的酶量为 1 个酶活力单位( U) 。(ε238 = 6.5mM

-1

.cm

-1

)

此实验固态发酵MnP活性计算公式：

NV

总

OD

238

10

3

100mL

U(/mL)

V

酶

6500TL0.4mL5g

N：酶液稀释倍数

V

总

: 漆酶酶活测定反应体体系的终体积（mL）

V

酶

: 反应添加的酶液体积（mL）

△OD

420

: t时间内反应液在420nm处吸光度的增加值

6500: 238nm处Mn

2 +

转化为 Mn

3 +

摩尔吸光系数(L/mol·cm)

T：反应时间（min）

L：比色皿的直径（cm）

100mL/(0.4mL×5g)：固态变成液态的稀释倍数

-可编辑修改-

。

-可编辑修改-

。

液态发酵锰过氧化物酶（MnP）活性测定：

锰过氧化物酶（MnP）活性测定

在 4 mL 反应体系中含 50 mmol/L( pH 4 ～5) 的乳酸钠缓冲液 3. 4 mL，

1. 6 mmol/L 的硫酸锰溶液0. 1 mL，酶液 0. 4 mL，预热至 37 ℃ 时，加 1. 6

mmol / L的 H

2

O

2

溶液 0. 1 mL 启动反应。在 238 nm 紫外光处，测定反应 4

min 内OD

238

差值。在对照组中，以煮沸灭活 15 min 酶液代替原酶液，以蒸

馏水代替H

2

O

2

溶液，其他反应物不变。每分钟使1 μmol/L的 Mn

2 +

转化为 Mn

3

+

所需的酶量为 1 个酶活力单位( U) 。(ε238 = 6.5mM

-1

.cm

-1

)

此实验固态发酵MnP活性计算公式：

U(/

mL

)

N：酶液稀释倍数

N



V

总



OD

238

10

3

V

酶

6500TL

V

总

: 漆酶酶活测定反应体体系的终体积（mL）

V

酶

: 反应添加的酶液体积（mL）

△OD

420

: t时间内反应液在420nm处吸光度的增加值

6500: 238nm处Mn

2 +

转化为 Mn

3 +

摩尔吸光系数(L/mol·cm)

T：反应时间（min）

L：比色皿的直径（cm）

-可编辑修改-

。

固态发酵木质素过氧化物酶（LiP）活性测定：

酶液制取：5g发酵样品以1:20（W/V）比例用蒸馏水悬浮，200 r/min摇

3h，之后5000 r/min离心20min。（上清用0.45µm滤纸过滤，于-20℃保存滤

液，取能整除的滤液体积用于木质素过氧化物酶活性测定。）

测酶活：3mL反应混合液包括3.4mL酒石酸钠（250mM， pH 3.0），0.1mL

10mM藜芦醇，0.4mL酶样品。在30±1℃下温浴5min后，于反应加入0.1mL

10mM H

2

O

2

启动酶促反应，以煮沸灭活 15 min 酶液代替原酶液，以蒸馏水代

替H

2

O

2

溶液作对照，测OD310(ε310= 9.3×10

3

M

−

1

cm

−

1

)处反应5min前后反应

液吸光度的变化。一个酶活力单位（U）的定义：每min氧化藜芦醇生成1μM

藜芦醛消耗的酶量。

此实验固态发酵LiP活性计算公式：

N



V

总



OD

310

10

3

100mL

U(/

mL

)

V

酶

9300TL0.4mL5g

N：酶液稀释倍数

V

总

: 漆酶酶活测定反应体体系的终体积（mL）

V

酶

: 反应添加的酶液体积（mL）

△OD

420

: t时间内反应液在420nm处吸光度的增加值

9300: 310nm处摩尔吸光系数(L/mol·cm)

T：反应时间（min）

L：比色皿的直径（cm）

100mL/(0.4mL×5g)：固态变成液态的稀释倍数

-可编辑修改-

2024年4月4日发(作者：兆永福)

。

固态发酵漆酶活性测定：

酶液制取：5g发酵样品以1:20（W/V）比例用蒸馏水悬浮，200 r/min摇3h，

之后5000 r/min离心20min。（上清用0.45µm滤纸过滤，于-20℃保存滤液，取

能整除的滤液体积用于漆酶活性测定。）

酶活反应体系3.0mL（2.3mL 0.2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液；pH=4.5

0.5mL粗酶液稀释液；0.2mL 1mmol/L的ABTS）

420nm处测定吸光值的变化。

此实验固态发酵漆酶活性计算公式：

NV

总

OD

420

10

3

100mL

U(/g)

V

酶

36000TL0.5mL5g

N：酶液稀释倍数

V

总

: 漆酶酶活测定反应体体系的终体积（mL）

V

酶

: 反应添加的酶液体积（mL）

△OD

420

: t时间内反应液在420nm处吸光度的增加值

36000: 420nm处ABTS氧化态的摩尔吸光系数(L/mol·cm)

T：反应时间（min）

L为比色皿的直径（cm）。

100mL/(0.5mL×5g)：固态变成液态的稀释倍数

-可编辑修改-

。

液态发酵漆酶活性测定：

酶活反应体系3.0mL（2.3mL 0.2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液；pH=4.5

0.5mL粗酶液稀释液；0.2mL 1mmol/L的ABTS）

U(/g)

N：酶液稀释倍数

N



V

总



OD

420

10

3

V

酶

36000TL

V

总

: 漆酶酶活测定反应体体系的终体积（mL）

V

酶

: 反应添加的酶液体积（mL）

△OD

420

: t时间内反应液在420nm处吸光度的增加值

36000: 420nm处ABTS氧化态的摩尔吸光系数(L/mol·cm)

T：反应时间（min）

L为比色皿的直径（cm）。

-可编辑修改-

。

固态发酵锰过氧化物酶（MnP）活性测定：

酶液制取：粗酶液制备发酵过程中每隔 2 d 取 5 g 发酵物于 250 mL 三

角瓶中，加入 100 mL H

2

O，在 200 r / min 的摇床中振荡提取 3 h，之后5000

r/min离心20min。（用滤纸过滤后，取滤液用于测定MnP 酶活性。）

在 4 mL 反应体系中含 50 mmol/L( pH 4 ～5) 的乳酸钠缓冲液 3. 4 mL，

1. 6 mmol/L 的硫酸锰溶液0. 1 mL，酶液 0. 4 mL，预热至 37 ℃ 时，加 1. 6

mmol / L的 H

2

O

2

溶液 0. 1 mL 启动反应。在 238 nm 紫外光处，测定反应 4

min 内OD

238

差值。在对照组中，以煮沸灭活 15 min 酶液代替原酶液，以蒸

馏水代替H

2

O

2

溶液，其他反应物不变。每分钟使1 μmol/L的 Mn

2 +

转化为 Mn

3

+

所需的酶量为 1 个酶活力单位( U) 。(ε238 = 6.5mM

-1

.cm

-1

)

此实验固态发酵MnP活性计算公式：

NV

总

OD

238

10

3

100mL

U(/mL)

V

酶

6500TL0.4mL5g

N：酶液稀释倍数

V

总

: 漆酶酶活测定反应体体系的终体积（mL）

V

酶

: 反应添加的酶液体积（mL）

△OD

420

: t时间内反应液在420nm处吸光度的增加值

6500: 238nm处Mn

2 +

转化为 Mn

3 +

摩尔吸光系数(L/mol·cm)

T：反应时间（min）

L：比色皿的直径（cm）

100mL/(0.4mL×5g)：固态变成液态的稀释倍数

-可编辑修改-

。

-可编辑修改-

。

液态发酵锰过氧化物酶（MnP）活性测定：

锰过氧化物酶（MnP）活性测定

在 4 mL 反应体系中含 50 mmol/L( pH 4 ～5) 的乳酸钠缓冲液 3. 4 mL，

1. 6 mmol/L 的硫酸锰溶液0. 1 mL，酶液 0. 4 mL，预热至 37 ℃ 时，加 1. 6

mmol / L的 H

2

O

2

溶液 0. 1 mL 启动反应。在 238 nm 紫外光处，测定反应 4

min 内OD

238

差值。在对照组中，以煮沸灭活 15 min 酶液代替原酶液，以蒸

馏水代替H

2

O

2

溶液，其他反应物不变。每分钟使1 μmol/L的 Mn

2 +

转化为 Mn

3

+

所需的酶量为 1 个酶活力单位( U) 。(ε238 = 6.5mM

-1

.cm

-1

)

此实验固态发酵MnP活性计算公式：

U(/

mL

)

N：酶液稀释倍数

N



V

总



OD

238

10

3

V

酶

6500TL

V

总

: 漆酶酶活测定反应体体系的终体积（mL）

V

酶

: 反应添加的酶液体积（mL）

△OD

420

: t时间内反应液在420nm处吸光度的增加值

6500: 238nm处Mn

2 +

转化为 Mn

3 +

摩尔吸光系数(L/mol·cm)

T：反应时间（min）

L：比色皿的直径（cm）

-可编辑修改-

。

固态发酵木质素过氧化物酶（LiP）活性测定：

酶液制取：5g发酵样品以1:20（W/V）比例用蒸馏水悬浮，200 r/min摇

3h，之后5000 r/min离心20min。（上清用0.45µm滤纸过滤，于-20℃保存滤

液，取能整除的滤液体积用于木质素过氧化物酶活性测定。）

测酶活：3mL反应混合液包括3.4mL酒石酸钠（250mM， pH 3.0），0.1mL

10mM藜芦醇，0.4mL酶样品。在30±1℃下温浴5min后，于反应加入0.1mL

10mM H

2

O

2

启动酶促反应，以煮沸灭活 15 min 酶液代替原酶液，以蒸馏水代

替H

2

O

2

溶液作对照，测OD310(ε310= 9.3×10

3

M

−

1

cm

−

1

)处反应5min前后反应

液吸光度的变化。一个酶活力单位（U）的定义：每min氧化藜芦醇生成1μM

藜芦醛消耗的酶量。

此实验固态发酵LiP活性计算公式：

N



V

总



OD

310

10

3

100mL

U(/

mL

)

V

酶

9300TL0.4mL5g

N：酶液稀释倍数

V

总

: 漆酶酶活测定反应体体系的终体积（mL）

V

酶

: 反应添加的酶液体积（mL）

△OD

420

: t时间内反应液在420nm处吸光度的增加值

9300: 310nm处摩尔吸光系数(L/mol·cm)

T：反应时间（min）

L：比色皿的直径（cm）

100mL/(0.4mL×5g)：固态变成液态的稀释倍数

-可编辑修改-