基于T7_转录系统的谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效表达系统的创建-USB迷|专注于互联网分享

2024年4月5日发(作者：钦今歌)

第46

卷第4期

2023年7月

河北农业大学学报

JOURNAL OF HEBEI AGRICULTURAL UNIVERSITY

Vol.46 No.4

Jul.2023

文章编号：1000-1573(2023)04-0091-07

DOI

：10.13320/.2023.0063

基于T7转录系统的谷氨酸棒杆菌重组蛋白

高效表达系统的创建

任晓昕

，韩琳琳

，武子淇

，谷敏

，徐大庆

（1.河北农业大学生命科学学院，河北保定071000；2.河北省蠡县农业农村局，河北保定 071400）

摘要：本研究以前期构建的大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pAU2为基础，通过添加T7 RNA聚合酶编码基因

及人工合成的克隆表达区，构建了1个新的谷氨酸棒杆菌分泌型基因高效表达载体pAU29KS。pAU29KS载体克

隆/表达盒使用T7启动子作为目的基因的启动子，通过载体序列中

T7 gene 1

基因编码的T7 RNA聚合酶与T7启

动子互作来进行目的基因的高效转录；启动子区下游使用谷氨酸棒杆菌核糖体结合位点RBS保守序列（gaaagga）

来高效起始目的蛋白合成；克隆/表达盒RBS与多克隆位点MCS之间使用谷氨酸棒杆菌强信号肽

cgl

_2070编

码序列来进行目的蛋白的胞外高效分泌。以嗜热脂肪土芽孢杆菌的α-淀粉酶AmyF作为报告蛋白，进行谷氨

酸棒杆菌

C. glutamicum

/pAU29KS表达系统的蛋白分泌生产能力检测。透明圈法检测结果显示，工程菌株

glutamicum

/pAU29KS-

amyF

能够在淀粉平板上产生清晰可见的透明圈；培养物上清液的SDS-PAGE考马斯亮蓝染

色和Western Blotting检测结果都显示出清晰的特异性条带，与AmyF预测分子量相一致；淀粉酶活性检测结果显示，

培养物上清液呈现高淀粉酶活力，而细胞裂解上清液未检测到淀粉酶活力，说明高效表达的α-淀粉酶在强信号

肽

cgl

_2070的介导下完全分泌到胞外培养基中。本研究构建的基于T7转录系统的

glutamicum

/pAU29KS能够

对目标蛋白进行高效分泌生产，是一套新的谷氨酸棒杆菌分泌型重组蛋白表达系统。

关键词：谷氨酸棒状杆菌；T7转录系统；重组蛋白表达和分泌

中图分类号：Q71

文献标志码：A

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Creation of the efficient recombinant protein expression system based

on the T7 transcription system in Corynebacterium glutamicum

REN Xiaoxin

, HAN Linlin

, WU Ziqi

, GU Min

, XU Daqing

( e of Life Sciences, Hebei Agricultural University, Baoding 071000, China; 2. Li County Agricultural and

Rural Bureau of Hebei Province, Baoding 071400, China)

Abstract: In this study, a new efficient secretion-type gene expression vector pAU29KS was constructed by

sequentially adding the T7 RNA polymerase-encoding gene and synthetic cloning/expression cassette to the E. coli-C.

glutamicum shuttle vector pAU2 constructed in our previous work in C. glutamicum. The pAU29KS vector employs

the T7 promoter that the target gene can be efficiently transcribed by interaction between the T7 RNA polymerase and

the T7 promoter. The conserved RBS sequence (gaaagga) of C. glutamicum was located downstream of the promoter

region to efficiently initiate target protein synthesis. The strong signal peptide cgl_2070-encoding sequence of C.

收稿日期：2023-04-14

基金项目：河北省自然科学基金（C2020204085）；河北省重点研发计划项目（22326610D）.

第一作者：任晓昕（1990—），男，河北张家口人，硕士研究生，从事微生物学方向研究.E-mail:****************

通信作者：徐大庆(1972—)，男，河北平泉人，博士，教授，从事分子微生物学和发酵工程研究.E-mail:********************

本刊网址：

92河北农业大学学报第46卷

glutamicum between RBS and the multiple cloning sites (MCS) was used to mediate efficient extracellular secretion

of the target protein. Using the alpha-amylase of Geobacillus stearothermophilus as a reporter protein, the ability to

protein secretory production of the C. glutamicum/pAU29KS expression system was tested. The results of transparent

circle method showed that there were appeared clear transparent circles around the strain C. glutamicum/PAU29KS-

amyF cultures on the starch plate. The SDS-PAGE staining and Western Blotting results of the supernatants of the

strain C. glutamicum/PAU29KS-amyF culture showed clear specific AmyF bands. The tests of AmyF activities

demonstrated that the amylase activity was high in the supernatant of the strain C. glutamicum/PAU29KS-amyF

culture, while no amylase activity was detected in the supernatant of the strain C. glutamicum/PAU29KS-amyF cell

lysis, suggesting that the efficiently expressed alpha-amylase was completely secreted into the medium. These results

demonstrated that the C. glutamicum/pAU29KS system can efficiently express and secrete the target protein, and is

an excellent secretion-type C. glutamicum recombinant proteins production system.

Keywords: Corynebacterium glutamicum; T7 transcription system; expression and secretion of recombinant proteins

重组蛋白高效表达系统是进行具有成本竞争力

的目标蛋白工业化生产的基础。优秀的微生物重组

蛋白表达系统需要1个合适的宿主菌株及1个高效

的基因表达载体。另外，重组蛋白的胞外分泌，因

其能够简化分离纯化步骤，降低生产成本

［1］

，是优

秀的微生物重组蛋白表达系统的又一关键特征。谷

氨酸棒杆菌（

Corynebacterium glutamicum

）是1种

革兰氏阳性、不产芽孢和菌丝体的符合食品安全生

产标准的食品级微生物

［2］

，已广泛应用各种小分子

物质，包括氨基酸、维生素、乙醇和某些有机酸等

的发酵生产

［3］

。谷氨酸棒杆菌因其具有培养条件要

求简单，细胞生长速度快，能够向培养基中分泌胞

外蛋白

［4］

，胞外蛋白酶活性极低以及能够进行高密

度发酵等特点

［5］

，是一种适用于重组蛋白生产的优

秀宿主菌。然而，谷氨酸棒杆菌表达载体拷贝数低

并且缺乏强启动子，致使重组蛋白在谷氨酸棒杆菌

中的表达水平普遍偏低

［6］

。因此，构建高效分泌型

谷氨酸棒杆菌表达系统，对于进行重组蛋白的经济、

高效生产具有十分重要的意义。

源自大肠杆菌T7噬菌体的T7转录系统具有特

异性（指T7 RNA聚合酶只特异性识别T7启动子，

而不与细菌中的其他启动子互作）、简单性（指从

T7 RNA聚合酶识别T7启动子开始，到转录终止的

整个转录过程中，不需任何其他的蛋白因子参与）

和转录高效性的特点，已经在异源细菌中成功用于

重组蛋白的高效表达

［7］

。信号肽是转运蛋白前体N-

末端的一小段氨基酸，其最终被细胞膜上的信号肽

酶切割并不出现在成熟的分泌蛋白中。信号肽的强

弱决定着蛋白跨膜分泌效率

［8］

。目前为止，一系列

强信号肽，诸如

cgl

_2070、

cgl

_0904等，已经在谷

氨酸棒杆菌中被鉴定

［9-10］

。本研究拟以谷氨酸棒杆

菌为宿主菌，构建以T7转录系统控制基因转录，

cgl

_2070强信号肽介导重组蛋白分泌的分泌型基因

高效表达载体，创建一套谷氨酸棒杆菌重组蛋白高

效表达系统，以期为重组蛋白的经济、高效生产提

供新途径。

1 材料与方法

1.1 引物和细菌培养条件

本试验所需引物序列见表1。

表1 本试验所用引物及其序列

Table 1 Primers and their sequences used in this work

引物名称

Names

amyF

-F

amyF

-R

T7-F1

T7-R1

T7-F2

T7-R2

29K-YZ-F

29K-YZ-R

引物序列（5′–3′）

Sequences

ATATGAATTCGCTGCACCATTCAACGGC

ATATAAGCTTTGGCCATGCGACAAGGCG

ATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTGAAAGGAGGCACTAAATGAACACGATTAAC

ATAATACTCCAGAGGCTAGTCCCTCTGGAGCTATCTAGTCGTATTGATTTGGCGTT

ATTACTGCAGTGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATA

ATTAGTCGACAGGCCTATCAACCTTGGGATCCTATAATACTCCAGAGGCTAGTCCCTC

GGAGAACACTTGGTGGGCTG

TCGGGCTTCCCATACAATCG

第4期

任晓昕，等：基于T7转录系统的谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效表达系统的创建

大肠杆菌220 r/min、37 ℃条件下培养于LB液体

培养基中（tryptone 1%、Yeast extract 0.5%、NaCl 1%）

或37 ℃条件下培养于LB固体培养皿中；谷氨酸棒

杆菌200 r/min、30 ℃条件下培养于LBHI液体培

养基中（tryptone 0.5%、Yeast extract 0.25%、NaCl

0.5%、Brain Heart Infusion 1.85 %）或30 ℃条件下

培养于LBHI固体培养皿中; 谷氨酸棒杆菌转化子

筛选200 r/min、30 ℃条件下培养于LBHIS液体培

养基中（tryptone 0.5%、Yeast extract 0.25%、NaCl

0.5%、Brain Heart Infusion 1.85 %、D-Sorbitol 9.1%）

或30 ℃条件下培养于LBHIS固体培养皿中。

1.2 谷氨酸棒杆菌分泌型基因表达载体pAU29KS

的构建

首先，以

E. coli

BL21（DE3）基因组DNA为模板，

T7-F1/T7-R1和T7-F2/T7-R2为引物进行T7 RNA

聚合酶编码基因

T7 gene 1

的PCR扩增；使用限制

性内切酶

Pst I

和

Sal I

对

T7 gene 1

基因片段和本实

验室前期构建的载体pAU2（

E. coli-C. glutamicum

基础穿梭载体，Km

）进行双酶切并纯化，纯化产

物通过DNA Ligation Kit Ver.2.1试剂盒进行连接，

连接产物转化

E. coli

DH5α感受态细胞，涂布于含

有卡那霉素的LB固体培养基中，置于37 ℃条件下

过夜培养；挑选转化子，提取质粒进行

Pst

I单酶切

和

Pst I

、

Sal I

双酶切验证，验证正确的质粒命名为

谷氨酸棒杆菌质粒pAU29K。然后，使用

Bam HI

和

Stu I

分别双酶切质粒pUC57-S-Box1和pAU29K，

经连接、转化、卡那霉素抗性平板筛选，对转化子

进行以29K-YZ-F/29K-YZ-R为引物的菌落PCR验

证，验证正确的转化子提取质粒进一步的测序验证，

测序验证正确的质粒即为谷氨酸棒杆菌质粒分泌型

表达载体pAU29KS。

1.3 重组表达载体pAU29KS

amyF

的构建及其谷

氨酸棒杆菌转化

使用人工合成的经过谷氨酸密码子偏爱性优

化嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶编码基因

amyF

作为报告基因。首先，应用在线信号肽预测软

件SignalP5.0（SignalP-5.0-Services-DTU Health

Tech）对

amyF

基因进行信号肽编码序列分析，以

质粒pUC57-

amyF

为模板，amyF-F/amyF-R为引

物进行去除自身信号肽编码序列的

amyF

报告基因

的PCR扩增；然后，使用限制性内切酶

Eco RI

和

Hin dIII

对表达载体pAU29KS和

amyF

基因分别

进行双酶切;第三步，分别将双切并纯化后的质粒

pAU29KS与

amyF

基因进行片段连接，通过热激法

将上述连接产物转化至

coli

DH5α感受态细胞

中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基中，

置于37 ℃恒温培养箱中过夜培养；最后，长出清晰

可见的转化子后，挑选转化子进行双酶切以及进一

步的测序验证，验证正确的重组表达载体，命名为

pAU29KS-

amyF

。

参照Liebl等的电转化法

［11］

，将重组表达

载体pAU29KS-

amyF

电转化至谷氨酸棒杆菌

glutamicum

ATCC13032感受态细胞，涂布于含有卡

那霉素的LBHIS固体培养基上，于30 ℃培养箱中

过夜培养；对转化子进行质粒提取验证，验证正确

的谷氨酸棒杆菌转化子即为pAU29KS-amyF转化成

功的谷氨酸棒杆菌工程菌，命名为

C. glutamicum

pAU29KS-

amyF

。

1.4 α

淀粉酶AmyF在谷氨酸棒杆菌表达系统

C. glutamicum

/pAU29KS

amyF

中的分泌表

达及检测

1.4.1 透明圈法检测α

淀粉酶分泌情况利用透

明圈法，对工程菌

C. glutamicum

/pAU29KS-

amyF

分泌表达AmyF情况进行分析，具体步骤如下：

首先，将

C. glutamicum

/pAU29KS-

amyF

在含卡那

霉素的LBHI液体培养基中培养过夜；然后，将

glutamicum

/pAU29KS-

amyF

以及不含载体的野生型

菌株

C. glutamicum

ATCC13032划线于含2%淀粉

的LBHI平板培养基上，置于30 ℃条件下培养36 h；

最后，将培养后的平板用配置好的碘液均匀涂抹平

皿，观察有无透明圈现象。

1.4.2

C. glutamicum

/pAY29KS

-amy

F培养物上清

液中α

淀粉酶的SDS

PAGE检测对照菌株

glutamicum

ATCC13032和工程菌株

C. glutamicum

pAU29KS-

amyF

分别接种LBHI培养基12 h过夜培

养，按照1∶10比例转接到50 mL LBHI培养基中

培养36 h，12 000 r/min、4 ℃条件下离心2 min，

收集培养物上清液。按照常规方法制备SDS-PAGE

的变性聚丙烯酰胺凝胶，将上述谷氨酸棒杆菌培

养物上清液按比例加入5倍上样缓冲液，煮沸10

min，按照15 μL/孔上样量上样，然后进行电泳。

将SDS-PAGE凝胶使用考马斯亮蓝R250染色后

进行脱色，可清晰看到凝胶上的蛋白条带后终止

脱色反应。

94河北农业大学学报

(U/mL)表示。试验设3个生物学重复。

第46卷

1.4.3

C. glutamicum

/pAU29KS

-amyF

菌体胞内及

培养物上清中α-淀粉酶活性检测菌体沉淀重悬

液超声波破碎，离心除去细胞碎片，制备细胞裂解

上清液，用于胞内α-淀粉酶活性检测。应用QB/

T1803-1993国标法

［12］

，对菌体胞内及培养物上清

中α-淀粉酶进行活性检测。具体方法如下：第一

步将诱导表达完成后的样品12 000 r/min、4 ℃离

心2 min，并将菌体沉淀进行超声破碎后收集破碎

液上清；第二步设置6个试验组，取6支试管，放

入20 mL可溶性淀粉溶液，然后加入5 mL pH6.0

缓冲液混匀后60 ℃水浴5 min；第三步将待测酶

溶液进行梯度稀释后，各取1 mL加入至相应编号

的离心管中混匀，及时反应5 min，再加入1 mL

反应液和5 mL稀碘液混匀；以稀碘液为对照

组，使用分光光度计测定样品OD

660

；按照QB/

T1083–1993表A1计算待测样品的酶浓度；待测样

品酶活力=查表A1求得酶浓度×稀释倍数。一单

位淀粉酶活性(U/mL)被指定为1 g固体酶粉（或

1 mL液体酶），于60 ℃、pH=6.0条件，1 h液化

1 g可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以U/mg

12 000

8 000

6 000

5 000

4 000

3 000

2 500

2 000

1 500

1 000

2 结果与分析

2.1 分泌型基因表达载体pAU29KS的构建

以实验室前期构建的大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌

穿梭质粒pAU2（4 713 bp）为骨架，将T7 RNA

聚合酶编码基因

T7 gene 1

片段（2 818 bp）插入

到pAU2的

Pst I

和

Sal I

两个限制酶位点之间，构

建质粒pAU29K（7 531 bp）。在质粒pAU29K的

Bam

HI和

Stu

I位点之间，插入465 bp的人工合成

的克隆/表达盒S-Box1，构建谷氨酸棒杆菌分泌型

基因表达载体pAU29KS（7 978 bp）。琼脂糖凝胶

电泳检测及测序验证与预期结果相一致，表明成功

构建谷氨酸棒杆菌分泌型基因表达载体pAU29KS，

见图1。克隆表达盒S-Box1多克隆位点MCS由

EcoRI

、

Not I

、

Bgl II

、

Nhe I

和

Hind III

组成，主要

使用T7启动子来控制目的基因的转录，使用谷氨

酸棒杆菌强核糖体结合位点RBS和强信号肽序列

cgl

_2070来控制蛋白质的翻译及介导蛋白质的胞外

分泌。

7 978 bp

T7 gene

S-Box

rep

(PMBI)

aphI

pAU29KS

7 978 bp

rep

(pBL1)

500

注：A：质粒pAU29KS电泳图. M：GsBL2502 DNAMarker；第1泳道： pAU29KS质粒单酶切；B：质粒pAU29KS图谱.

rep

(pMB1)，

C. glutamicum

质粒复制子；

aphI

，卡那霉素抗性基因；

rep

(pBL1)，

E. coli

质粒复制子；

T7 gene 1

， T7 RNA聚合酶编码基因；

S-Box，克隆/表达盒； C：S-Box具体序列。

图1 谷氨酸棒杆菌分泌型基因表达载体pAU29KS的构建

Fig. 1 Construction of the secretion-type gene expression vector pAU29KS in C. glutamicum

第4期

任晓昕，等：基于T7转录系统的谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效表达系统的创建

2.2 谷氨酸棒杆菌重组蛋白表达系统

C. glutamicum

pAU29S

amyF

的构建

嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶AmyF能够在谷

氨酸棒杆菌中以Sec（the general secretion pathway）

和Tat（the twin arginine translocation pathway）

2种不同分泌途径进行活性分泌，本研究选择使

用AmyF作为报告蛋白来检测谷氨酸棒杆菌

glutamicum

/pAU29KS表达系统的蛋白生产能力。将

经过谷氨酸密码子偏爱性优化，且去除自身信号肽

编码序列的

amyF

连接到表达载体pAU29KS上，转

化大肠杆菌，获得重组表达载体pAU29KS-

amyF

。

对照载体pAU29KS及重组载体pAU29KS-

amyF

分

别转化谷氨酸棒杆菌，提取谷氨酸棒杆菌转化子质

粒进行酶切验证。琼脂糖凝胶电泳检测（图2）及

测序验证与预期结果相一致，表明成功获得谷氨酸

棒杆菌重组蛋白表达系统

C. glutamicum

/pAU29KS-

amyF

。

12 000

8 000

6 000

5 000

4 000

3 000

2 500

2 000

1 500

1 000

500

注：M：GsBL10001 DNAMarker；第1泳道：pAU29KS-

amyF

质粒

Eco

RI单酶切；第2泳道pAU29KS-

amyF

质粒

Eco

RI和

Hin

dIII双酶切。

M 1 2

9 523 bp

7 978 bp

注：A：对照菌株

C. glutamicum

/pAU29KS；B：

C. glutamicum

pAU29KS-

amyF

。

图3

C. glutamicum

/pAU29KS

amyF

淀粉酶

分泌的透明圈法检测

Fig.3 Activity analysis of C. glutamicum/pAU29KS-amyF

by α-amylase transparent circle method

淀粉酶SDS

PAGE法分析为确认

icum

/ 2.3.2 α

pAU29KS-

amyF

的α-淀粉酶AmyF胞外分泌表

达水平，对工程菌培养物上清液中AmyF含量进

行了SDS-PAGE检测。SDS-PAGE考马斯亮蓝染

色检测结果显示，相比于对照菌株

C. glutamicum

pAU29KS培养物上清液，

C. glutamicum

/pAU29KS-

amyF

培养物上清液样品清晰地呈现1条特异性的蛋

白条带，且其分子量大小与预测的AmyF蛋白分子

量57 kD大小相一致（图4）。这些结果证明了

glutamicum

/pAU29KS-

amyF

在T7转录系统的作用

下进行了报告蛋白α-淀粉酶的高效表达。

180

130

100

57 kD

M 1 2

1 545 bp

图2 谷氨酸棒杆菌重组表达载体pAU29KS

amyF

的电泳检测

Fig.2 Agarose gel electrophoresis assay of recombinant

vector pAU29KS-amyF of C. glutamicum

2.3

icum

/pAU29KS

amyF

分泌表达报告

蛋白α

淀粉酶AmyF的检测

2.3.1 α

淀粉酶透明圈法活性检测应用透明圈法

可方便快速地对

C. glutamicum

/pAU29KS-

amyF

能

否分泌表达α-淀粉酶AmyF进行判定。试验结果

显示，

C. glutamicum

/pAU29KS-

amyF

经过在平板培

养物上培养，产生了清晰可见的透明圈，而对照菌

株

C. glutamicum

/pAU29KS未见透明圈的产生（图

3），说明

C. glutamicum

/pAU29KS-

amyF

能够表达

并向胞外分泌α-淀粉酶。

注：M：蛋白质分子量Marker；第1泳道：对照菌株

C. glutamicum

/pAU29KS；第2泳道：

C. glutamicum

/pAU29KS-

amyF

。

图4

C. glutamicum

/pAU29KS

amyF培养物上清液

SDS

PAGE分析

Fig.4 SDS-PAGE analysis of culture supernatant of

C. glutamicum /pAU29KS-amyF

96河北农业大学学报第46卷

2.3.3 α

淀粉酶比酶活测定为检测胞内表达的

AmyF是否完全分泌到胞外培养基中，进行了

glutamicum

/pAU29KS-

amyF

菌体胞内及培养物上清

中α-淀粉酶活性检测试验。酶活检测结果显示培

养物上清液具有高淀粉酶活力，而细胞裂解上清液

未检测到淀粉酶活力（图5），说明高效表达的α-

淀粉酶在由强信号肽

cgl

_2070的介导下完全分泌到

胞外培养基中。以上检测结果，共同证明了本研究

构建的基于T7转录系统的

icum

/pAU29KS

能够对目标蛋白进行高效分泌生产，是一套优秀的

谷氨酸棒杆菌分泌型重组蛋白高效表达系统。

120

然强启动子。在源自大肠杆菌T7噬菌体的T7转录

系统中，T7 RNA聚合酶只单一负责T7启动子，能

够高效转录T7启动子下游基因

［7］

。有研究表明，

将T7 RNA聚合酶编码基因整合到谷氨酸棒杆菌染

色体DNA上构建工程宿主菌，并通过构建表达载

体形成表达系统，证明了T7转录系统在谷氨酸棒杆

菌中的可用性

［13-14］

。与上述表达系统相比，本研

究构建的

C. glutamicum

/pAU29KS表达系统，将T7

转录系统的2个组分，即T7 RNA聚合酶编码基因

和T7启动子共同构建在同一表达载体上来高效表达

目的基因，据目前所知尚属首次报道。其优势在于，

表达载体pAU29KS可以使用具有不同天然特性或

经遗传改造的谷氨酸棒杆菌作为宿主菌株，拓宽了

C. glutamicum

/pAU29KS表达系统的宿主使用范围，

更加方便其应用于特定条件下的蛋白生产。

使用双启动子来控制基因转录，已经被证明是

增加异源蛋白产量的1种有效方式

［15］

。在真核生

物中，可将同一目的基因插入表达载体上相互分离

的2个强启动子下形成双启动子系统来进行高效转

录，而由于细菌同源重组系统活性强，其双启动子

转录系统都是将目的基因插入到2个串联启动子

下

［16］

。在前期研究中，通过对在大肠杆菌中使用

的tac启动子进行理性设计而获得的1个谷氨酸棒

杆菌强启动子tac-M，并且应用于谷氨酸棒杆菌表

达载体的构建

［17-18］

。本研究中，除了使用T7启动

子外，表达载体pAU29KS还使用了tac-M启动子

来共同转录目的基因。与已知的双启动子使用报道

中的每一个启动子都是通过与宿主菌自身RNA聚合

酶互作来控制基因的转录不同

［17］

，本研究使用的

双启动子分别属于2个不同的转录系统，即T7转录

系统和谷氨酸棒杆菌自身转录系统，tac-M启动子

的使用是进一步增加目的基因转录产物的有效方式。

一般而言，大多数蛋白都只能通过Sec或Tat 1种途

径进行活性分泌

［19］

，因此，在构建Sec分泌型表

达载体pAU29KS的同时，也构建了使用Tat型强

信号肽cgl_0904的表达载体pAU30KT，二者不同

之处仅在于使用了不同的信号肽序列。试验证明

glutamicum

/pAU30KT也是1个高效谷氨酸棒杆菌

重组蛋白分泌型表达系统，其可用于依赖Tat途径

进行活性分泌的重组蛋白的高效分泌生产。

100

比

酶

活

(

蛋

白

质

)

ﬁ

上清液

Supernatant

注：1：细胞裂解液上清液；2：菌体培养物上清液。

图5

C. glutamicum/pAU29KS-amyF

的

α-

淀粉酶活性测定

Fig.5 The specific activities of AmyF production in

C. glutamicum/pAU29KS-amyF

3 结论与讨论

基因转录是通过RNA聚合酶与启动子相互作

用来实现的，启动子的强弱决定了结构基因的表达

效率。目前发现的谷氨酸棒杆菌天然质粒都是低拷

贝质粒，表达载体在谷氨酸棒杆菌中的低拷贝数，

使得强启动子应用于重组蛋白表达载体的构建具有

更关键的意义。可能是由于在谷氨酸棒杆菌自身转

录系统中，其自身RNA聚合酶需要负责3 000多个

基因的转录，目前在谷氨酸棒杆菌中还没有发现天

第4期

参考文献：

任晓昕，等：基于T7转录系统的谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效表达系统的创建

cells［J］. FEMS Microbiology Letters, 1989, 65(3):

299-303.

［12］中华人民共和圆轻工业部. 工业酶制剂通用试验方法:

QB/T 1803—1993［S］. 北京: 中国轻工业出版社,

1994.

［13］ Kortmann M, Kuhl V, Klafﬂ S, et al. A chromosomally

encoded T7 RNA polymerase-dependent gene expression

system for

Corynebacterium glutamicum

: construction

and comparative evaluation at the single-cell level［J］.

Microb Biotechnol,2015, 8(2):253-265.

［14］ Shuhei H, Yasuhiko C, Haruka K, et al. Efficient

production of long double-stranded RNAs applicable to

agricultural pest control by

Corynebacterium glutamicum

equipped with coliphage T7-expression system［J］.

Applied Microbiology and Biotechnology, 2021,

105(12): 1-14.

［15］ Sibel Ö, Gündüz E B, Pınar Ç. Double promoter

expression systems for recombinant protein production

by industrial microorganisms［J］. Applied

Microbiology and Biotechnology, 2017, 101(20): 7459-

7475.

［16］ Zhang F, You S, Huang T, et al. Dual promoter strategy

enhances co-expression of α-L-rhamnosidase and

enhanced ﬂuorescent protein for whole-cell catalysis and

bioresource valorization［J］. Sci Total Environ, 2020,

722:137865.

［17］ Xu D, Tan Y, Shi F, et al. An improved shuttle vector

constructed for metabolic engineering research in

Corynebacterium glutamicum

［J］. Plasmid, 2010, 64:

85-91.

［18］ Jia H, Li H, Zhang L, et al. Development of a novel

gene expression system for secretory production of

heterologous proteins via the General Secretory (Sec)

pathway in

Corynebacterium glutamicum

［J］. Iran J

Biotechnol, 2018, 16: e1746.

［19］ Freudl R. Beyond amino acids: Use of the

Corynebacterium glutamicum

cell factory for the

secretion of heterologous proteins［J］. J Biotechnol,

2017, 258: 101-109.

［1］ Klaus G, Andreas P. Manufacturing of recombinant

therapeutic proteins in microbial systems［J］.

Biotechnology Journal, 2006, 1(2): 164-186.

［2］ Cheng F, Luo Z, Guo Z, et al. Enhanced biosynthesis

of hyaluronic acid using engineered

Corynebacterium

glutamicum

via metabolic pathway regulation［J］.

Biotechnol J, 2017, 12: 1700191.

［3］ Tauch A, Pühler A, Kalinowski J, et al. Plasmids in

Corynebacterium glutamicum

and their molecular

classiﬁcation by comparativegenomics［J］. Biotechnol

J, 2003, 104: 27-40.

［4］ Suzuki, N, Watanabe K, Okibe N, et al. Identiﬁﬁcation

of new secreted proteins and secretion of heterologous

amylase by

Corynebacterium glutamicum

［J］. Appl

Microbiol Biotechnol,2009, 82, 491-500.

［5］ Geisseler D, Horwath W. Regulation of extracellular

protease activity in soil in response to different sources

and concentrations of nitrogen and carbon［J］. Soil

Biol Biochem, 2008, 40:3040-3048.

［6］ Xu D, Tan Y, Wang X. Construction of a new promoter-

probe vector and its application for screening strong

promoter for

Brevibacterium flavum

metabolic

engineering［J］. World J Microbiol Biotechnol, 2011,

27: 961-968.

［7］ Liu X, Yang Y, Zhang W, et al. Expression of

recombinant protein using

Corynebacterium glutamicum

progress, challenges and applications［J］. Crit Rev

Biotechnol, 2015,15: 1-13.

［8］ Freudl R. Signal peptides for recombinant protein

secretion in bacterial expression system［J］. Microb

Cell Fact, 2018, 17: 52.

［9］ Watanabe K, Tsuchida Y, Okibe N, et al. Scanning

the

Corynebacterium glutamicum

R genome for

high-efficiency secretion signal sequences［J］.

Microbiology, 2009, 155: 741-750.

［10］李川敏, 张玮祎, 张献, 等. 谷氨酸棒杆菌信号肽探

测载体的构建及强信号肽筛选［J］. 河北农业大学学

报, 2021, 44(4): 69-75.

［11］ Liebl W, Bayerl A, Schein B, et al. High efficiency

electroporation of intact

Corynebacterium glutamicum

（责任编辑：李川）