2024年4月6日发(作者：薄曜瑞)
三重qPCR法快速检测肺炎克雷伯菌的方法建立与应用
邹享珍;蔡淑英;刘妙娥;林丹丽;桑慧
【摘 要】目的 建立三重qPCR法(实时荧光定量)快速检测肺炎克雷伯氏菌rcsA和
23s RNA基因,期以快速精准诊断呼吸道肺炎克雷伯氏菌感染,为早期精准治疗提供
依据.方法 根据GenBank公布的肺炎克雷伯氏菌rcsA和23s RNA基因序列选择
保守区设计测序引物,高保真扩增东莞樟木头医院分离到的95株肺炎克雷伯氏菌
rcsA和23s RNA基因,经测序比对后,避开变异区和突变点分别设计检测引物和探
针,建立三重qPCR方法直接检测临床呼吸道样本,并与培养及测序法比较,验证其诊
断灵敏度和特异性等性能指标.结果 三重qPCR法检测肺炎克雷伯氏菌rcsA和
23s RNA基因,其检测下限低至2 cfu/PCR,检测灵敏度98.9％(94/95),检测特异性
97.9％(93/95);诊断灵敏度98.6％(424/430),诊断特异性98.8％(2295/2324);从
样品处理到报告结果≤1.2h.结论 该方法简便、快速、灵敏度高、特异性好,可实现
呼吸道肺炎克雷伯氏菌感染的快速与精准诊断,为早期精准治疗赢得时间.
【期刊名称】《中国实验诊断学》
【年(卷),期】2017(021)006
【总页数】5页(P993-997)
【关键词】肺炎克雷伯氏菌;精准诊断;qPCR;rcsA基因;23s RNA基因
【作 者】邹享珍;蔡淑英;刘妙娥;林丹丽;桑慧
【作者单位】东莞樟木头医院检验科,广东东莞523633;东莞樟木头医院检验科,广
东东莞523633;东莞樟木头医院检验科,广东东莞523633;东莞樟木头医院检验科,
广东东莞523633;东莞樟木头医院检验科,广东东莞523633
【正文语种】中 文
【中图分类】R378
肺炎克雷伯菌是呼吸道感染的病原菌之一，可引起较严重的下呼吸道感染甚至死亡，
其临床症状与其他细菌感染并无两样，临床难以针对该菌精准治疗。近年来，由于
无法早期精准治疗，其耐药问题日益突出，严重影响了治疗效果[1，2]。培养法是
目前常用的检测方法，也是金标准，一般需要2-3天，甚至更久，其时效性、简
便性、灵敏度等均无法满足临床快速精准诊断的需求[3]。实时荧光定量
PCR(qPCR)以其快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点，在病原微生物基因快
速检测方面迅速发展，已成为金标准方法的重要补充[4-6]，比如，国内已公布两
项专利应用于肺炎克雷伯菌的辅助诊断[7，8]。但笔者发现，两项专利技术只检测
单基因，且均未对我国流行分布的肺炎克雷伯菌相关基因进行测序比对，仅根据
NCBI或文献资料来设计引物和探针，由于生物进化、地区分布不同等原因，可能
存在灵敏度不够或特异性不强的致命缺点。在精准医学日益发展的当下，现有发明
已无法满足需求，发明新的能实现精准诊断并适合我国人群的方法迫在眉前。由此，
笔者基于Taqman 荧光探针技术，同时检测肺炎克雷伯菌rcsA和23s RNA两个
持家基因，在进一步提高检测和诊断灵敏度、特异性方面取得了较好效果，现报道
如下。
近年来，随着抗生素、免疫抑制剂、激素的大量使用，肺炎克雷伯菌感染呈上升趋
势，除可引起下呼吸道感染外，还可引发菌血症、脓毒症、肝脓肿及泌尿系感染
[9]。目前，肺炎克雷伯菌的检测以痰培养技术为金标准，该方法检测周期长，操
作繁琐。二十世纪末，Higuchi等[10]人发明了实时荧光Taqman探针定量PCR
技术，将PCR扩增和产物的检测结合一起进行定量分析。而三重qPCR检测方法
的原理，是在实时荧光Taqman探针定量的基础上，采用多孔板，利用荧光染料
和探针，同时检测多个样品或者基因，针对不同基因设计具有相同或接近的退火温
度和延伸时间的引物和探针的分析技术。因反应体积少，还大大的节省试剂和时间，
具有灵敏度高、特异性强、重复性好、自动化程度高、检测快速等特点，所以比细
菌培养方法灵敏快速。
随着分子生物学技术的飞速发展，实时荧光Taqman探针技术也只应用于肺炎克
雷伯菌的RNA基因的单个检测，均未对我国流行分布的肺炎克雷伯菌相关基因进
行测序比对，仅根据NCBI或文献资料来设计引物和探针，由于生物进化、地区分
布不同等原因，可能存在灵敏度不够或特异性不强的致命缺点。本文选取肺炎克雷
伯菌的rcsA和23s RNA两个持家基因来设计引物和探针，在实时荧光Taqman
探针技术的基础上，经测序比对后，避开变异区和突变点分别设计检测引物和探针，
建立三重qPCR方法直接检测临床呼吸道样本，周时检测多个样品和基因。并与
培养及测序法比较，验证其诊断灵敏度和特异性等性能指标。研究表明，三重
qPCR检测体系经优化后检测灵敏度及特异性高为98.9%、97.9%；诊断灵敏度及
特异性高为98.6%、98.8%。具有快速、简便、灵敏度高、特异性强、批量检测
等优点，并在从样品处理到报告结果≤1.2 h极短时间内做出快速诊断，为临床医
生的抗生素治疗方案提供快速有效的科学依据，完全可用于下呼吸道感染的初步筛
选和指导临床抗生素的合理使用，有效预防多重耐药菌的产生和传播。同时为本实
验室将建立一种同时检测多个细菌实施三重荧光定量 PCR方法，形成一套多通道
快速检测儿童重症呼吸道感染病原体的方法提供了参考。
2024年4月6日发(作者：薄曜瑞)
三重qPCR法快速检测肺炎克雷伯菌的方法建立与应用
邹享珍;蔡淑英;刘妙娥;林丹丽;桑慧
【摘 要】目的 建立三重qPCR法(实时荧光定量)快速检测肺炎克雷伯氏菌rcsA和
23s RNA基因,期以快速精准诊断呼吸道肺炎克雷伯氏菌感染,为早期精准治疗提供
依据.方法 根据GenBank公布的肺炎克雷伯氏菌rcsA和23s RNA基因序列选择
保守区设计测序引物,高保真扩增东莞樟木头医院分离到的95株肺炎克雷伯氏菌
rcsA和23s RNA基因,经测序比对后,避开变异区和突变点分别设计检测引物和探
针,建立三重qPCR方法直接检测临床呼吸道样本,并与培养及测序法比较,验证其诊
断灵敏度和特异性等性能指标.结果 三重qPCR法检测肺炎克雷伯氏菌rcsA和
23s RNA基因,其检测下限低至2 cfu/PCR,检测灵敏度98.9％(94/95),检测特异性
97.9％(93/95);诊断灵敏度98.6％(424/430),诊断特异性98.8％(2295/2324);从
样品处理到报告结果≤1.2h.结论 该方法简便、快速、灵敏度高、特异性好,可实现
呼吸道肺炎克雷伯氏菌感染的快速与精准诊断,为早期精准治疗赢得时间.
【期刊名称】《中国实验诊断学》
【年(卷),期】2017(021)006
【总页数】5页(P993-997)
【关键词】肺炎克雷伯氏菌;精准诊断;qPCR;rcsA基因;23s RNA基因
【作 者】邹享珍;蔡淑英;刘妙娥;林丹丽;桑慧
【作者单位】东莞樟木头医院检验科,广东东莞523633;东莞樟木头医院检验科,广
东东莞523633;东莞樟木头医院检验科,广东东莞523633;东莞樟木头医院检验科,
广东东莞523633;东莞樟木头医院检验科,广东东莞523633
【正文语种】中 文
【中图分类】R378
肺炎克雷伯菌是呼吸道感染的病原菌之一，可引起较严重的下呼吸道感染甚至死亡，
其临床症状与其他细菌感染并无两样，临床难以针对该菌精准治疗。近年来，由于
无法早期精准治疗，其耐药问题日益突出，严重影响了治疗效果[1，2]。培养法是
目前常用的检测方法，也是金标准，一般需要2-3天，甚至更久，其时效性、简
便性、灵敏度等均无法满足临床快速精准诊断的需求[3]。实时荧光定量
PCR(qPCR)以其快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点，在病原微生物基因快
速检测方面迅速发展，已成为金标准方法的重要补充[4-6]，比如，国内已公布两
项专利应用于肺炎克雷伯菌的辅助诊断[7，8]。但笔者发现，两项专利技术只检测
单基因，且均未对我国流行分布的肺炎克雷伯菌相关基因进行测序比对，仅根据
NCBI或文献资料来设计引物和探针，由于生物进化、地区分布不同等原因，可能
存在灵敏度不够或特异性不强的致命缺点。在精准医学日益发展的当下，现有发明
已无法满足需求，发明新的能实现精准诊断并适合我国人群的方法迫在眉前。由此，
笔者基于Taqman 荧光探针技术，同时检测肺炎克雷伯菌rcsA和23s RNA两个
持家基因，在进一步提高检测和诊断灵敏度、特异性方面取得了较好效果，现报道
如下。
近年来，随着抗生素、免疫抑制剂、激素的大量使用，肺炎克雷伯菌感染呈上升趋
势，除可引起下呼吸道感染外，还可引发菌血症、脓毒症、肝脓肿及泌尿系感染
[9]。目前，肺炎克雷伯菌的检测以痰培养技术为金标准，该方法检测周期长，操
作繁琐。二十世纪末，Higuchi等[10]人发明了实时荧光Taqman探针定量PCR
技术，将PCR扩增和产物的检测结合一起进行定量分析。而三重qPCR检测方法
的原理，是在实时荧光Taqman探针定量的基础上，采用多孔板，利用荧光染料
和探针，同时检测多个样品或者基因，针对不同基因设计具有相同或接近的退火温
度和延伸时间的引物和探针的分析技术。因反应体积少，还大大的节省试剂和时间，
具有灵敏度高、特异性强、重复性好、自动化程度高、检测快速等特点，所以比细
菌培养方法灵敏快速。
随着分子生物学技术的飞速发展，实时荧光Taqman探针技术也只应用于肺炎克
雷伯菌的RNA基因的单个检测，均未对我国流行分布的肺炎克雷伯菌相关基因进
行测序比对，仅根据NCBI或文献资料来设计引物和探针，由于生物进化、地区分
布不同等原因，可能存在灵敏度不够或特异性不强的致命缺点。本文选取肺炎克雷
伯菌的rcsA和23s RNA两个持家基因来设计引物和探针，在实时荧光Taqman
探针技术的基础上，经测序比对后，避开变异区和突变点分别设计检测引物和探针，
建立三重qPCR方法直接检测临床呼吸道样本，周时检测多个样品和基因。并与
培养及测序法比较，验证其诊断灵敏度和特异性等性能指标。研究表明，三重
qPCR检测体系经优化后检测灵敏度及特异性高为98.9%、97.9%；诊断灵敏度及
特异性高为98.6%、98.8%。具有快速、简便、灵敏度高、特异性强、批量检测
等优点，并在从样品处理到报告结果≤1.2 h极短时间内做出快速诊断，为临床医
生的抗生素治疗方案提供快速有效的科学依据，完全可用于下呼吸道感染的初步筛
选和指导临床抗生素的合理使用，有效预防多重耐药菌的产生和传播。同时为本实
验室将建立一种同时检测多个细菌实施三重荧光定量 PCR方法，形成一套多通道
快速检测儿童重症呼吸道感染病原体的方法提供了参考。