2024年4月6日发(作者：丛工)
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634
•
国际免疫学杂志 2020 年 11 月第 43 卷第 6 期 Int J Irmminol，Nov. 2020，Vol. 43，No. 6
PAX
2和
E
-
cadherin
/
cx-SMA
在肾间质纤维化
大鼠肾小管上皮共表达的作用及意义
李丽
p
王长山1
'中国科学院大学深圳医院（光明），广东深圳
518107;2
佳木斯大学附属第一医院儿科，
黑龙江佳木斯
152400
通信作者：王长山，
Email: wcs0451 @ 163
.
com
，
电话
**************
【摘要】目的阐明胚胎发育基因
PAX2
在肾间质纤维化大鼠中的再表达与肾小管上皮细胞-间
充质转化细胞表型（
epithelial-mesenchymal transition, EMT)
特异性标志物
E-cadherin
和
a-SMA
的关系，
探讨
PAX2
在肾间质纤维化中可能的作用机制。方法
80
只雄性
Wistar
大鼠随机分成假手术组
（sham
组）和模型组（
UUO
组），每组各
40
只。于术后
3
、
5
、
7
、
14d(
每组
10
只）处死取肾组织。光镜观察肾脏病
理形态学改变，免疫组化双染检测
PAX2
和
E-cadherin/tx-SMA
的关系、实时荧光定量
PCR
检测肾组织
PAX2
、
E-cadherin
和
ct-SMA mRNA
的表达。结果①
HE
和
Masson
染色观察到
UU0
组出现明显的纤维
化表现
;
②免疫组化双染结果发现
sham
组大鼠
PAX2
蛋白在肾小管上皮细胞无表达，
E-cadherin
蛋白大
量表达于肾小管上皮细胞，
ot-SMA
蛋白仅表达于小动脉的肌层，
PAX2
和
E-cadherin /a-SMA
之间无共表
达
;UUO
组随着梗阻时间的延长
PAX2
和
a-SMA
表达更加明显，
E-cadherin
表达逐渐减少，
PAX2
和
ct-SMA
蛋白共表达区域增加；③
PCR
结果显示
sham
组肾皮质中
PAX2 mKNA
少量表达，
E-cadherin
mRNA
大量表达，
a-SMA mRNA
有微量表达；与
sham
组相比
,3d UUO
组
PAX2 mRNA
出现表达，
E-cad-
herin mRNA
表达减少
,a-SMA mRNA
表达增加，随着梗阻时间的延长
,PAX2 mRNA
和
a-SMA mRNA
表
达量逐渐增加
,E-cadherin mRNA
表达量明显减少，以上三个指标
UUO
组与
sham
组及
UUO
组各时间点
mRNA
相对表达量比较均有统计学差异
（P
值均
<0.05
)。
④相
关分析表明：
PAX2 mRNA
水平与
a-SMA
mRNA
水平呈正相关
（r = 0. 993, P <0.05
),与
E-cadherin mRNA
水平呈负相关
（r = -0. 983 ,P < 0. 05
)。
结论胚胎发育基因
PAX2
在肾间质纤维化大鼠肾小管上皮细胞再表达与
EMT
细胞表型特异性标志物
E-cadherin/a-SMA
蛋白和
mRNA
表达存在一定的联系，
PAX2
再表达参与了肾间质纤维化
EMT
过程。
【关键词】肾间质纤维化
;PAX2
基因；
E-cadherin ;a-SMA
基金项目：黑龙江省自然科学基金项目（
LH2019H117);
黑龙江省卫生计生委立项科研项目（
2018-
224);
广东省医学科学技术研究基金项目（
A2020588);
中国科学院大学深圳医院科研项目（
HRF-
2020003,HRF-2020007);
深圳市光明区卫生系统科研博士创新项目（
2020R01075,2020R01079)
DOI
：
10. 3760/cma. j. issn. 1673-4394. 2020.06.006
Role and significance of PAX2 and E-cadherin / a-SMA in renal tubular epithelium of renal interstitial
fibrosis rats
Li Li' 2, Wang Changshan
' University of Chinese Academy of Sciences Shenzhen Hospital ’ Shenzhen ’ China;2 Department of Pediat-
rics, the First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 152400,China
Corresponding author：Wang Changshan,Email
：
m
)
C
5〇451@ 163.
com, Tel
：
*************
【Abstract
】
Objective To elucidate the relationship between the reexpression of the embryonic devel
opmental gene PAX2 in renal interstitial fibrosis rats and renal tubular epithelial-mesenchymal transition cell
phenotype ( EMT) specific markers E-cadherin and a-SMA, and to explore the role of PAX2 of action in renal
interstitial fibrosis. Methods A total of
80
male Wistar rats were randomly divided into the sham group ( n =
•论著•
国际免疫学杂志 2020 年 11 月第 43 卷第 6 期 Int J Immunol，Nov. 2020，Vol. 43 , No. 6
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40) and UUO model group ( n =40). Renal tissues were sacrificed at 3 ,5 ,7 and 14 d (10 rats in each group)
after operation. The pathological and morphological changes of the kidney were observed under light micro
scope. The relationship between PAX2 and E-cadherin / a-SMA was detected by immunohistochemical double
staining. The expression of PAX2, E-cadherin and a-SMA mRNA in renal tissue was detected by real-time flu
orescent quantitative PCR. Results (1)HE and Masson staining showed obvious fibrosis in the UUO group；®
Double staining results showed that PAX2 protein was not expressed in renal tubular epithelial cells, E-cadherin
protein was abundantly expressed in renal tubular epithelial cells, and a-SMA protein was expressed only in the
muscular layer of small arteries. PAX2 There was no co-expression between E-cadherin and a-SMA
；
in the
UUO group, the expression of PAX2 and a-SMA became more pronounced with the increase of the obstruction
time, the expression of E-cadherin gradually decreased, and the area of co-expression of PAX2 and a-SMA pro
tein increased
；
®PCR results
：
PAX2 mRNA was slightly expressed in the renal cortex of the sham group, E-
cadherin mRNA was heavily expressed, and a-SMA mRNA was slightly expressed
；
compared with the sham
group, PAX2 mRNA was expressed in the 3d UUO group, while the E-cadherin mRNA expression was re
duced, and a -SMA mRNA expression increased. With the extension of obstruction time, PAX2 mRNA and a-
SMA mRNA expression gradually increased, and E-cadherin mRNA expression decreased significantly. There
were statistically significant differences in the relative expression of mRNA at each time point between the UUO
group, the sham group and the UUO group (all P values <0. 05).④Correlation analysis showed that PAX2
mRNA level was positively correlated with a-SMA mRNA level ( r = 0. 993 , P <0. 05) , and negatively correla
ted with E-cadherin mRNA level (r= -0.983, P<0.05). Conclusion The expression of embryonic devel
opment gene PAX2 in renal tubular epithelial cells of renal interstitial fibrosis rats has a certain relationship with
the expression of E-cadherin / a-SMA protein and mRNA in phenotype-specific markers of EMT cells. The
PAX2 re-expression is involved in the EMT process of renal interstitial fibrosis
。
【Key words
】
Renal interstitial fibrosis; Paired box 2 gene; E-cadherin; a-SMA
Fund program
：
Heilongjiang Provincial Natural Science Foundation Project (LH2019H117)
；
Guangdong
Provincial Medical Science and Technology Research Fund Project (A2020588 )
；
Chinese Academy of Sciences
University Shenzhen Hospital Scientific Research Project (HRF-2020003, HRF- 2020007)
；
Shenzhen Guang-
ming District Health System Research Doctor Innovation Project (2020R01075, 2020R01079)
DOI
：
10. 3760/cma. j. issn. 1673^394.2020.06.006
肾间质纤维化
（renal
interstitial
fibrosis
，
RIF
)是
转化（
mesenchymal epithelial transition，MET
)过程，
各种慢性肾病发展至终末期肾功能衰竭的共同通路
EMT
实质上是
MET
的逆过程[5]。
和重要原因m。尿路梗阻是小儿终末期肾脏疾病
PAX2(Paired Box 2)
基因编码核转录因子，是肾
的主要原因之一[2]。单侧输尿管结扎
（unilateral
u
-
脏胚胎发育过程中诱导
MET
的关键性基因，参与胚
reteral
obstruction
，
UUO
)模型是诱导肾纤维化最经
胎肾脏各个发育阶段的调控，成熟肾单位其表达消
典的模型[3]。
失[6]。近年来研究发现，
PAX2
基因在多种肾脏疾病
目前，许多学者通过体内外实验对肾小管间质
存在重新表达，本课题组前期研究证实
PAX2
在
UUO
纤维化虽进行了大量的研究，但对其发生、发展的机
大鼠肾小管上皮细胞存在重新表达，参与了肾间质纤
制尚未完全阐明。肾脏纤维化的一个关键步骤是发
维化的过程[7]。但是，
PAX2
基因是否通过作用于
生了胚胎肾发育过程的逆转，即固有的肾脏细胞退
EMT
途径而参与肾间质纤维化的机制尚不明确。因
回到原始的胚胎间质表型，发生肾小管上皮细胞-间
此，本实验建立
UU0
大鼠模型，探讨
PAX2
基因在肾
充质细胞转化（
epithelial-mesenchymal
transition
，
间质纤维化中的再表达与
EMT
细胞表型特异性标志
EMT
)，它是肾间质纤维化的重要发病机制之一[4]。
物
E-cadherin
和
a-SMA
的关系，阐明
PAX2
在肾间质
从发育学角度来看，除集合管外的肾小管上皮细胞
纤维化中的作用机制，为临床进行肾间质纤维化防治
在胚胎期是由间充质细胞转化而来，即间充质-上皮
提供一种新途径和实验性理论依据。
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国际免疫学杂志 2020 年 11 月第 43 卷第 6 期 IntJ Immunol，Nov. 2020, Vol.43,No. 6
i
材料和方法
1.1
模型制备及分组
雄性清洁级
Wistar
大鼠80只（120〜150克，4
~6周），购自于中国医科大学的实验动物中心[合
格证号:
SYXK
(辽）2003-0019]。以随机排列表法
随机分为假手术组（
sham
组）40只；模型组（
UU
0
组)40只，于术后3、5、7、14
d
分为4组，每组10只。
术式为以10 %的水合氯醛(300
mg
/
kg
)腹腔注射麻
醉后，行左侧耻骨上切口，沿左肾下极寻找到左输尿
管，用44号丝线上下结扎两处，从中剪断输尿管以
防逆行性感染，分层缝合关闭腹腔。假手术组，分离
输尿管不结扎，随即缝合腹腔。
1.2 取材
每组大鼠于术后3、5、7、14
d
处死，取左侧肾
脏
，一
部分置4 %多聚甲醛中固定，石蜡包埋，待做
病理形态学检测和免疫组化双染。另一部分剥离表
面脂肪后分离肾脏皮质和髓质，包入无菌锡纸中置
液氮罐内，再转移至-80
T
冰箱，待做实时荧光定
量
PCR
。
1.3模型的鉴定
取左侧梗阻肾行
HE
染色及
Masson
染色
。HE
染色,后光镜下观察肾间质纤维化、蛋白管型、肾小
管扩张和肾间质炎细胞浸润程度判定肾小管间质损
伤的程度。每个参数分为4个等级:0分为正常，1
分为轻度受损，2分为中度受损，3分为重度受损，每
个样本小管间质损伤评分总分为〇 ~ 9分
A
;
Masson
染色，借助
NIS-Elements
BR
2. 10图像分析软件定
量分析肾间质纤维化程度。每例切片取10个不重
复的400倍视野，以蓝色胶原沉积为阳性，计算蓝染
面积占整个视野的百分比，得出肾间质胶原面积与
视野内肾小管间质总面积（去除肾小管管腔）的比
值,取其平均值为每例切片的肾间质相对面积
W
。
1.4 检测方法
1.4.1 肾组织
PAX
2 蛋白和
E
-
cadherin
/
a-SMA
蛋
白免疫组化双染：取肾组织，制备切片，按免疫组化
双染试剂（
Polymer
双染检测试剂盒，北京中杉金桥
生物技术有限公司）说明书步骤操作。
PAX
2兔抗
大鼠单克隆抗体（美国
Zymed
提供）用辣根过氧化
物酶标记，显色为棕黄色;
E
-
cadherin
和
ct
-
SMA
均为
小鼠抗大鼠单克隆抗体（美国
Santa
Cruz
公司）用碱
性磷酸酶标记，显色为红色。免疫组化双染步骤：
5um
肾切片常规脱蜡水化后，抗原修复。在
3%
的
H
2〇2中孵育
10 min,
即用型封闭液孵育
10 min, PBS
液漂洗后，将一抗
PAX2
(工作浓度1:
100)
和一抗
E
-
cadherin
或
a-SMA
(工作浓度
1:100)
混合物加入
切片上,4=^冰箱孵育过夜;第二天取出在37
T
中孵
育
40 min
后
PBS
液漂洗，滴加二抗酶标记山羊抗小
鼠
IgG
聚合物和酶标记山羊抗兔
IgG
聚合物（两种
二抗等量混合），湿盒中孵育
30 min;
按照试剂盒说
明配好
DAB
显色液和
AP-Red
显色液进行显色;蒸
馏水冲洗后进行苏木素染色,用封片剂覆盖组织不
加盖玻片，水平放置切片
50 t
烤箱孵育
30 min。
光
学显微镜下观察结果。
1.4.2
实时荧光定量
PCR
分析
PAX
2
mRNA
表达：
采用
Trizol
(美国
Invitrogen
试剂公司提供）试剂，按
说明书进行操作。用紫外分光光度计测260
rnn
/280
nm
的吸光度比值及样本浓度，检测提取的
RNA
产量
及质量。
RNA
逆转录反应体系，经37丈15
min
,
85尤5
sec
，逆转录合成
cDNA
,以此为模板用
PAX
2、
a
-
SMA
(
l
: 1000)和
E-cadherin
引物经
PCR
方法进行
扩增。引物序列见表1(上海生工试剂公司合成）。
表
1 PAX2
、
a-SMA
和
E-cadherin
引物序列
基因
引
物
片段长度
(bP)
PAX2F5
，
-CGGTGAGAAGAGGAAACGAG-3'
246
R
S^GCTTGGAAGACATCG GGATA-3/
GAPDHF5，-GGC ACAGTCAAGGCTGAGAATG-3f
143
R5
，
-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3,
E-cadherinF5
，
-TGCTCCTACTGTTTCTACG-3'111
R5
，
-CTTCTCCACCTCCCTCTT-3 <
a-SMAF5
，
-AGCCAGTCGCCATCAGGAAC-3;
90
R5 '-CCGGAGCCATTGTCACACAC-3'
扩增条件为：95丈10
sec
, 95丈5
sec
, 60
T
；
34
sec
，共40个循环。融解曲线条件（
ABI
7500机器
自行设定）：95 115
sec
,60
tl
min
，95
T
15
see
。
每个基因以预实验中
Ct
值最大的样品作为其标准
品，用
EAZY
Dilution
依次稀释成四个梯度，与样品
同时扩增。应用
ABI
7500
Real-time
PCR
system
(美
国应用生物系统公司）荧光定量
PCR
仪根据标准曲
线自动分析并显示结果，用
AACT
法进行计算3
1.5 统计分析
实验数据采用均数±标准差
（Mean
±
SD
)表示，
国际免疫学杂志2020年1丨月第43卷第6期Int J Imimmol
,
Nov. 2020，Vol. 43
，
No. 6
•
637
•
采用
SPSS
17.0统计软件，两组间均数比较采用
t
检
验,两变量相关分析采用
Pearson
相关分析，以
P
<
〇.〇5为差异有统计学意义。
2 结果
结构严重破坏，肾小管萎缩，肾小管、集合管扩张呈
囊状，管腔塌陷，上皮细胞大量坏死，肾间质弥漫性
巨噬细胞、淋巴细胞浸润和成纤维细胞增生及胶原
形成。各时间点肾小球均未见明显病变;
sham
组大
鼠肾脏肾小管结构正常、排列紧密整齐，小管基底膜
光滑完整。两组肾小管损伤程度评分比较差异有统
计学意义
（P
<〇.〇5);
UUO
组各时间点相比
P
<
0.05(表2和图1)。
2.1 肾组织形态学改变
2.1.1
HE
染色：
UUO
组术后3
d
，可见肾小管扩
张，小管间质区域出现单核细胞、淋巴细胞浸润；随
梗阻时间延长肾脏损伤逐渐加重，术后14
d
肾小管
表2
两组大鼠肾小管损伤程度评分比较（
Mean
i
士
SD,
分，
n =8)
5 (1
0.134 ±0.028
3.590 ±0.629ab
15.520
0.0015
0.0005
7 d
0.128 ±0.030
4.734 ±0.522th
24.920
0.0013
0.0008
14 d
0. 149 ±0.019
6.352 ±0.861ab
20.370
组别
sh
臓组
UUO
组
3d
0.101 ±0.019
2.548 ±0.119*
34.690
0.0012
<值
•P
值
0.0011
0.0001
1■尸值
-
注：与sham组比较/尸< 0.05;UUO组内比较,bP<0.05。
细血管周围,而小管周围间质染色较少。
UUO
组肾
间质纤维组织相对面积较
sham
组明显增髙
（P
<
0. 05) ;
UU
0组各时间点相比，
P
值均< 0. 05 (表3
和图2)。
图I
各组大鼠
HE
染色
组大鼠未见异常改
变;1
B
.
UUO
组梗阻14
d
肾小符纳构《到严重破坏管腔塌
陷
、杆间质弥漫
性巨嘸
细胞、淋巴细胞浸润和成纤维细胞
坩生
i
放大倍数
x
400。
2.1.2
Masson
染色:
UU
0术后3
d
可见胶原沉积,
随梗阻时间延长进行性增多，肾间质逐渐增宽，间质
细胞及细胞外基质成分增多;组肾脏胶原染色
主要位于小管基膜、肾小*、系膜区和肾小管间的毛
表3
组别
»ham 组
UUO组
尤值
•户值
哕值
3d
1.708 ±0. 188
6.968 ±1.913"
7.740
0.0003
-
图
2 各组大鼠
Mas*〇n
染色（蓝色代表胶原沉积,
400
x
) 2
组大鼠未见异常改变;2
B
.
UU
0组
Md
肾间®纤维化程度明显加
t
、细胞外基质成分增多、胶原
沉积明
M
。
阏组大鼠肾间质相对
Iftf
积比较（
Mean
±
SD
,%,
n
=8)
5 d
1.587 ±0.294
15.363 ±1.791
21.470
0.0003
0.0004
7 d
1.580 ±0.232
22.594 ± 2.464
24.020
0.0001
0.0006
14 d
1.708 ±0.327
32.943 ±3.093^
17.310
0.0001
0.0005
注，与，ham组比较,■/><0.0],UUO组内比较,kP<0.03。
.638 .
2.2
国际免疫学杂志2020年11月第43卷第6期
ImJ
Imimm
〇
l
,
NOT
.2020,
V
〇1.43.
N
〇.6
免疫双染观察
PAX
2蛋白与
E
-
cadherin
/
而
UU
0组各时间点肾皮质中的
PAX
2
mRNA
/
GAP
-
DH
mRNA
相对表达量差异有统计学意义
（P
<0.05)
ot
-
SMA
蛋白的共表达
为了观察
PAX
2的表达与小管上皮细胞表型
E-cadherin
及肌成纤维细胞表型
a-SMA
的相互关
系，本研究采用免疫组化双染技术，结果发现在
sham
组，
PAX
2大鼠肾小管上皮细胞无表达
，
E
-
cad
herin
大量表达于肾小管上皮细胞，
PAX
2 与
E
-
cad
herin
无共表达;
UU
0 3 天后，
PAX
2 在肾小管上皮细
胞出现表达，
E-cadherin
表达量减少，
PAX
2与
E
-
cadherin
可见共表达;
UU
0 14天，
PAX
2表达更加明
显，
E-cadherin
表达逐渐减少，
PAX
2 与
E-cadherin
少量共表达;在
Sham
组大鼠
a-SMA
仅表达于小动
脉的肌层,
PAX
2与
a-SMA
无表达；
UU
0 3天后，a-
SMA
可表达于间质区及肾小管上皮，
PAX
2与a-
SMA
出现共表达；
UU
0 14天，
PAX
2和
a-SMA
共表
达区域增加。（图3)
2.3 实时荧光定量
PCR
检测
PAX
2、
E
-
cadherin
与
a-SMA
mRNA
在大鼠
UU
0模型中的表达变化
(表4和图4)。
图3 免疫双染观察两组大鼠不同时间点
PAX
2与
E
-
cadherin
(
Cl
-
C
3)/
PAX
2 与
ot
-
SMA
(
Dl
-
D
3)的共表达
3
A
.在
sham
组,
PAX
2 与
E-cadherin
无共表达;3
B
.
UU
0 3
天后，
PAX
2与
E
-
cadherin
可见共表达；3
C
.
UU
0 14天
PAX
2与
E
-
cadherin
可见少量共表达；3
D
.在
Sham
组
PAX
2 与
a-SMA
无表达;3
E
.
UU
0 3 天后，
PAX
2 与
ot-SMA
2.3. 1
PAX
2
mRNA
的表达：实时荧光定量
PCR
法
检测结果，
UU
〇组术后3
d
PAX
2
mRNA
出现表达，随着
梗阻时间的延长表达逐渐增加;
sham
组肾皮质中有
少量
PAX
2
mRNA
表达，两组
PAX
2
mRNA
/
GAPDH
mRNA
相对拷贝数比较有统计学差异
（P
<0.05);
表4
组别
出现共表达;3
F
.
UU
0 14天
PAX
2和
a
-
SMA
共表达区域
重叠增加（
PAX
2为胞核染色呈棕黄色、
E
-
cadherin
为胞
膜和胞浆染色呈红色及
a
-
SMA
为胞浆染色呈红色;箭头
所示为共表达区域，放大倍数为400
x
)。
两组大鼠肾皮质
PAX
2
mRNA
相对表达量的动态变化（
PAX
2基因拷贝数/
GAPDH
基因拷贝数
,Means
±
SD,n
=8)
3
d
0.0093 ±0_019
0.013 ± 0.002
a
4.098
0.00108
-
5
d
0.0089 ± 0.0021
0.016 ±0.0024
6.302
0.00002
0.040
7
d
0.0088 ±0.0031
0.023 ±0.003^
11.760
0.00001
0.006
14
d
0.0086 ±0.0033
0.037 ± 0.0064
13.050
0.00001
0.008
sham
组
UU
0组
f
值
a
尸值
值
注
< 0_01，与
sham
组比较
；bP
<0.05,
UU
0组内比较。
ca sham^ll
图4实时定量
PCR
检测各组大鼠肾皮质
PAX
2、
E
-
cadherin
和
a
-
SMAmRNA
的相对表达量
国际免疫学杂志2020年1丨月第43卷第6期 Int J Immunol，Nov. 2020，Vol. 43，No. 6
•
639
•
2.3.2
E-cadherin
mRNA
的表达
：UUO
组术后 3
d
E
-
caclherin
表达减少，而且随着梗阻时间的延长，
E
-
ca
(丨
herin
mRNA
表达减少更加明显；
sham
组大鼠
量比较差异有统计学意义（
P
<〇. 05);而
UUO
组各
时间点肾皮质中的
E-cadherin
mRNA
/
GAPDH
mR
NA
相对表达量差异有统计学意义 （
P
< 0. 05 )( 表 5
肾皮质中
E-cadherin
mRNA
大量表达。
UU
0组与
sham
组
E-cadherin
mRNA
/
GAPDH
mRNA
相对表达
和图4)。
表5
两组大鼠肾皮质
E-cadherin
mKNA
相对表达量变化
（Mean
±
SD,n
=8)
组别
sham 组
UU0组
f值
**尸值
bP值
3d
0.956 ±0.203
0.771 ±0.087a
2.380
0.032
-
5 d
0.991 ±0. 198
0.658 ±0.098ah
4.247
0.008
0.062
7 d
1.003 ±0. 148
0.483 ±0. 117ab
7.741
0.001
0.037
14 d
1.011 ±0. 191
0.237 ±0. 113ab
9.827
0.001
0.004
注:与sham组比较,*P <0.05 ;UU0组内比较，bP <0.05。
2.3. 3
a-SMA
mRNA
的表达
：UUO
组术后 3
d
a-SMA
mRNA
表达增加，而且随着梗阻时间的延长
a-SMA
mRNA
表达逐渐增加;
sham
组大鼠肾皮质中
a-SMA
mRNA
有基础表达量。
UUO
组与
sham
组
表6
组别
sham 组
uuo组
f值
•尸值
bp<6
3d
1.179 ±0.27
3.562 ±〇.792a
8.054
0.00018
-
ot-SMA
mRNA
相对表达量比较差异有统计学意义
(P
< 0. 05);而
UUO
组各时间点
ct-SMA
mRNA
相对
表达量比较差异有统计学意义（
P
值均< 〇. 〇5 )(表
6和图4)。
两组大鼠肾皮质
a-SMA
mRNA
相对表达量变化（
Mean
±
SD
，
n
=8)
5 (1
0.957 ±0.215
5.294 ±1.088®**
11.060
0.00011
0.001
7 d
1.101 ±0.251
7.393 ±1.277ah
13.670
0.00001
0.001
14 d
0.988 ±0.191
12.223 ± 1.80lah
17.550
0.00001
0.001
注:与sham组比较,*/><0.05;UUO组内比较,bP<0.05。
2.3.4 相关性分析：为进一步分析
PAX
2与
EMT
细胞表型特异性标志物表达的关系，本研究采用
Pearson
相关分析，结果显示，肾小管
PAX
2
mRNA
水平与肌成纤维细胞表型
a-SMA
mRNA
水平
（r
=
0.993,
P
<0.05)呈正相关，与上皮细胞表型
E
-
cad
herin
mRNA
水平呈负相关 （
c
= -0.983,
P
< 0.05 )
(图 5)0
H-------------1------------1------------1------------«
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04
PAX2
〇
•
〇
_
0.00
i
0.01
I
0.02
PAX2
i
0.03
i
0.04
图5
PAX
2
mRNA
与
cx-SMA
mRNA
和
E-cadherin
mRNA
水平的相关性分析（散点图）
•
640
•
国际免疫学杂志 2020 年 11 月第 43 卷第 6 期 Im J Immunol，Nov. 2020，Vol. 43，No. 6
3讨论
慢性肾脏病
（chronic
kidney
disease
，
CKD
)已成
为威胁全世界的公共健康问题，慢性肾脏疾病的发
病率在世界范围内持续增加[1W1]。肾间质纤维化
是各种慢性肾病发展至肾功能衰竭的共同通路。在
本研究中，通过
he
和
M
ass〇n染色观察到尿路梗阻
后肾脏纤维化表现:肾间质弥漫性巨噬细胞、淋巴细
胞浸润；肾小管扩张、萎缩、管腔塌陷；肾间质增宽、
胶原纤维的沉积等。证明本实验
UUO
模型造模成
功。
EMT
即肾小管上皮细胞在病理条件下可发生
转分化，失去其特有的细胞表型和特征，获得新的表
型，转化为肌成纤维细胞。
EMT
是一种有序的调节
过程，有四个关键步骤:①上皮细胞失去黏附能力；
②
(X
平滑肌肌动蛋白
（otsmooth
activatorProtein
，
(
X
-
SMA
)的表达;③肾小管基底膜破坏;④细胞迁移和
侵袭能力增强[12]。
E
-
cadherin
是肾小管上皮细胞特
征性标志，在
EMT
时首先消失；
a
-
SMA
是肌成纤维
细胞标志性蛋白己得到公认。因此选择上述两种细
胞表型特异性标志物作为判断小管
EMT
的指标。
本实验研究结果显本，在
sham
组
E-cadherin
mRNA
和蛋白存在大量表达，在
UUO
组第3天，肾皮质
E
-
cadherin
niRNA
表达水平出现下降，随着梗阻时间
的延长表达逐渐降低，术后14
d
E
-
cadherin
表达大
量消失，仅见弱表达。与此同时，
a-SMA
mRNA
在
sham
组表达极少,
UUO
组随着梗阻时间的延续肾间
质损害程度的加重，
a-SMA
mRNA
表达呈现明显的
上调趋势。以上研究结果表明，
UU
0大鼠在肾间质
纤维化的同时伴有肾小管上皮细胞表型特异性标志
物
E
-
cadherin
的下调和肌成纤维细胞表型特异性标
志物
a
-
SMA
表达上调，提示肾小管上皮细胞发生了
EMT
0
在胚胎肾脏发育过程中，胚胎期后肾间充质细
胞在形成肾单位过程中要经历了间充质-上皮转化，
PAX
2是
MET
关键性因子，成熟肾单位其表达消失。
近来发现，在肾脏损伤后出现重新表达[13]。
本实验采用免疫组化双染技术观察
PAX
2的表
达与
E-cadherin
及
a-SMA
的相互关系，结果发现在
sham
组大鼠，
PAX
2蛋白在肾小管上皮细胞无表达，
E-cadherin
蛋白大量表达于肾小管上皮细胞，
a-SMA
蛋白仅表达于小动脉的肌层，
PAX
2和
E-cadherin
或
a
-
SMA
之间无共表达
；UUO
3
d
后，
PAX
2和
E
-
cad
-
herin
/
a-SM
A
之间开始出现共表达；随着梗阻时间
的延长，
PAX
2表达更加明显，
E
-
cadherin
表达逐渐
减少，
PAX
2和
a
-
SMA
蛋白共表达区域增加。
Pear
son
相关分析结果显示
PAX
2
mRNA
水平与
a-SMA
mRNA
水平呈正相关，与
E-cadherin
mRNA
水平呈
负相关。结果提示，肾小管
EMT
过程中，
PAX
2蛋白
的表达与细胞表型的改变有一定的关系，
PAX
2参
与了肾间质纤维化
EMT
过程。
PAX
2存在复杂的信
号传导通路[14_15]，
PAX
2与肾间质纤维化
EMT
之间
具体分子机制及信号通路还有待进一步研究。
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inhibits endothelial-to-mesenchymal transition ( EMT ) under (
收稿日期
:20204)8-30)
high-fat diet-induced hyperglycemia [ J ]. Front Pharmacol ,2018 ,
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@
cma
.
org
.
cn
2024年4月6日发(作者：丛工)
•
634
•
国际免疫学杂志 2020 年 11 月第 43 卷第 6 期 Int J Irmminol，Nov. 2020，Vol. 43，No. 6
PAX
2和
E
-
cadherin
/
cx-SMA
在肾间质纤维化
大鼠肾小管上皮共表达的作用及意义
李丽
p
王长山1
'中国科学院大学深圳医院（光明），广东深圳
518107;2
佳木斯大学附属第一医院儿科，
黑龙江佳木斯
152400
通信作者：王长山，
Email: wcs0451 @ 163
.
com
，
电话
**************
【摘要】目的阐明胚胎发育基因
PAX2
在肾间质纤维化大鼠中的再表达与肾小管上皮细胞-间
充质转化细胞表型（
epithelial-mesenchymal transition, EMT)
特异性标志物
E-cadherin
和
a-SMA
的关系，
探讨
PAX2
在肾间质纤维化中可能的作用机制。方法
80
只雄性
Wistar
大鼠随机分成假手术组
（sham
组）和模型组（
UUO
组），每组各
40
只。于术后
3
、
5
、
7
、
14d(
每组
10
只）处死取肾组织。光镜观察肾脏病
理形态学改变，免疫组化双染检测
PAX2
和
E-cadherin/tx-SMA
的关系、实时荧光定量
PCR
检测肾组织
PAX2
、
E-cadherin
和
ct-SMA mRNA
的表达。结果①
HE
和
Masson
染色观察到
UU0
组出现明显的纤维
化表现
;
②免疫组化双染结果发现
sham
组大鼠
PAX2
蛋白在肾小管上皮细胞无表达，
E-cadherin
蛋白大
量表达于肾小管上皮细胞，
ot-SMA
蛋白仅表达于小动脉的肌层，
PAX2
和
E-cadherin /a-SMA
之间无共表
达
;UUO
组随着梗阻时间的延长
PAX2
和
a-SMA
表达更加明显，
E-cadherin
表达逐渐减少，
PAX2
和
ct-SMA
蛋白共表达区域增加；③
PCR
结果显示
sham
组肾皮质中
PAX2 mKNA
少量表达，
E-cadherin
mRNA
大量表达，
a-SMA mRNA
有微量表达；与
sham
组相比
,3d UUO
组
PAX2 mRNA
出现表达，
E-cad-
herin mRNA
表达减少
,a-SMA mRNA
表达增加，随着梗阻时间的延长
,PAX2 mRNA
和
a-SMA mRNA
表
达量逐渐增加
,E-cadherin mRNA
表达量明显减少，以上三个指标
UUO
组与
sham
组及
UUO
组各时间点
mRNA
相对表达量比较均有统计学差异
（P
值均
<0.05
)。
④相
关分析表明：
PAX2 mRNA
水平与
a-SMA
mRNA
水平呈正相关
（r = 0. 993, P <0.05
),与
E-cadherin mRNA
水平呈负相关
（r = -0. 983 ,P < 0. 05
)。
结论胚胎发育基因
PAX2
在肾间质纤维化大鼠肾小管上皮细胞再表达与
EMT
细胞表型特异性标志物
E-cadherin/a-SMA
蛋白和
mRNA
表达存在一定的联系，
PAX2
再表达参与了肾间质纤维化
EMT
过程。
【关键词】肾间质纤维化
;PAX2
基因；
E-cadherin ;a-SMA
基金项目：黑龙江省自然科学基金项目（
LH2019H117);
黑龙江省卫生计生委立项科研项目（
2018-
224);
广东省医学科学技术研究基金项目（
A2020588);
中国科学院大学深圳医院科研项目（
HRF-
2020003,HRF-2020007);
深圳市光明区卫生系统科研博士创新项目（
2020R01075,2020R01079)
DOI
：
10. 3760/cma. j. issn. 1673-4394. 2020.06.006
Role and significance of PAX2 and E-cadherin / a-SMA in renal tubular epithelium of renal interstitial
fibrosis rats
Li Li' 2, Wang Changshan
' University of Chinese Academy of Sciences Shenzhen Hospital ’ Shenzhen ’ China;2 Department of Pediat-
rics, the First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 152400,China
Corresponding author：Wang Changshan,Email
：
m
)
C
5〇451@ 163.
com, Tel
：
*************
【Abstract
】
Objective To elucidate the relationship between the reexpression of the embryonic devel
opmental gene PAX2 in renal interstitial fibrosis rats and renal tubular epithelial-mesenchymal transition cell
phenotype ( EMT) specific markers E-cadherin and a-SMA, and to explore the role of PAX2 of action in renal
interstitial fibrosis. Methods A total of
80
male Wistar rats were randomly divided into the sham group ( n =
•论著•
国际免疫学杂志 2020 年 11 月第 43 卷第 6 期 Int J Immunol，Nov. 2020，Vol. 43 , No. 6
•
635
•
40) and UUO model group ( n =40). Renal tissues were sacrificed at 3 ,5 ,7 and 14 d (10 rats in each group)
after operation. The pathological and morphological changes of the kidney were observed under light micro
scope. The relationship between PAX2 and E-cadherin / a-SMA was detected by immunohistochemical double
staining. The expression of PAX2, E-cadherin and a-SMA mRNA in renal tissue was detected by real-time flu
orescent quantitative PCR. Results (1)HE and Masson staining showed obvious fibrosis in the UUO group；®
Double staining results showed that PAX2 protein was not expressed in renal tubular epithelial cells, E-cadherin
protein was abundantly expressed in renal tubular epithelial cells, and a-SMA protein was expressed only in the
muscular layer of small arteries. PAX2 There was no co-expression between E-cadherin and a-SMA
；
in the
UUO group, the expression of PAX2 and a-SMA became more pronounced with the increase of the obstruction
time, the expression of E-cadherin gradually decreased, and the area of co-expression of PAX2 and a-SMA pro
tein increased
；
®PCR results
：
PAX2 mRNA was slightly expressed in the renal cortex of the sham group, E-
cadherin mRNA was heavily expressed, and a-SMA mRNA was slightly expressed
；
compared with the sham
group, PAX2 mRNA was expressed in the 3d UUO group, while the E-cadherin mRNA expression was re
duced, and a -SMA mRNA expression increased. With the extension of obstruction time, PAX2 mRNA and a-
SMA mRNA expression gradually increased, and E-cadherin mRNA expression decreased significantly. There
were statistically significant differences in the relative expression of mRNA at each time point between the UUO
group, the sham group and the UUO group (all P values <0. 05).④Correlation analysis showed that PAX2
mRNA level was positively correlated with a-SMA mRNA level ( r = 0. 993 , P <0. 05) , and negatively correla
ted with E-cadherin mRNA level (r= -0.983, P<0.05). Conclusion The expression of embryonic devel
opment gene PAX2 in renal tubular epithelial cells of renal interstitial fibrosis rats has a certain relationship with
the expression of E-cadherin / a-SMA protein and mRNA in phenotype-specific markers of EMT cells. The
PAX2 re-expression is involved in the EMT process of renal interstitial fibrosis
。
【Key words
】
Renal interstitial fibrosis; Paired box 2 gene; E-cadherin; a-SMA
Fund program
：
Heilongjiang Provincial Natural Science Foundation Project (LH2019H117)
；
Guangdong
Provincial Medical Science and Technology Research Fund Project (A2020588 )
；
Chinese Academy of Sciences
University Shenzhen Hospital Scientific Research Project (HRF-2020003, HRF- 2020007)
；
Shenzhen Guang-
ming District Health System Research Doctor Innovation Project (2020R01075, 2020R01079)
DOI
：
10. 3760/cma. j. issn. 1673^394.2020.06.006
肾间质纤维化
（renal
interstitial
fibrosis
，
RIF
)是
转化（
mesenchymal epithelial transition，MET
)过程，
各种慢性肾病发展至终末期肾功能衰竭的共同通路
EMT
实质上是
MET
的逆过程[5]。
和重要原因m。尿路梗阻是小儿终末期肾脏疾病
PAX2(Paired Box 2)
基因编码核转录因子，是肾
的主要原因之一[2]。单侧输尿管结扎
（unilateral
u
-
脏胚胎发育过程中诱导
MET
的关键性基因，参与胚
reteral
obstruction
，
UUO
)模型是诱导肾纤维化最经
胎肾脏各个发育阶段的调控，成熟肾单位其表达消
典的模型[3]。
失[6]。近年来研究发现，
PAX2
基因在多种肾脏疾病
目前，许多学者通过体内外实验对肾小管间质
存在重新表达，本课题组前期研究证实
PAX2
在
UUO
纤维化虽进行了大量的研究，但对其发生、发展的机
大鼠肾小管上皮细胞存在重新表达，参与了肾间质纤
制尚未完全阐明。肾脏纤维化的一个关键步骤是发
维化的过程[7]。但是，
PAX2
基因是否通过作用于
生了胚胎肾发育过程的逆转，即固有的肾脏细胞退
EMT
途径而参与肾间质纤维化的机制尚不明确。因
回到原始的胚胎间质表型，发生肾小管上皮细胞-间
此，本实验建立
UU0
大鼠模型，探讨
PAX2
基因在肾
充质细胞转化（
epithelial-mesenchymal
transition
，
间质纤维化中的再表达与
EMT
细胞表型特异性标志
EMT
)，它是肾间质纤维化的重要发病机制之一[4]。
物
E-cadherin
和
a-SMA
的关系，阐明
PAX2
在肾间质
从发育学角度来看，除集合管外的肾小管上皮细胞
纤维化中的作用机制，为临床进行肾间质纤维化防治
在胚胎期是由间充质细胞转化而来，即间充质-上皮
提供一种新途径和实验性理论依据。
•
636
•
国际免疫学杂志 2020 年 11 月第 43 卷第 6 期 IntJ Immunol，Nov. 2020, Vol.43,No. 6
i
材料和方法
1.1
模型制备及分组
雄性清洁级
Wistar
大鼠80只（120〜150克，4
~6周），购自于中国医科大学的实验动物中心[合
格证号:
SYXK
(辽）2003-0019]。以随机排列表法
随机分为假手术组（
sham
组）40只；模型组（
UU
0
组)40只，于术后3、5、7、14
d
分为4组，每组10只。
术式为以10 %的水合氯醛(300
mg
/
kg
)腹腔注射麻
醉后，行左侧耻骨上切口，沿左肾下极寻找到左输尿
管，用44号丝线上下结扎两处，从中剪断输尿管以
防逆行性感染，分层缝合关闭腹腔。假手术组，分离
输尿管不结扎，随即缝合腹腔。
1.2 取材
每组大鼠于术后3、5、7、14
d
处死，取左侧肾
脏
，一
部分置4 %多聚甲醛中固定，石蜡包埋，待做
病理形态学检测和免疫组化双染。另一部分剥离表
面脂肪后分离肾脏皮质和髓质，包入无菌锡纸中置
液氮罐内，再转移至-80
T
冰箱，待做实时荧光定
量
PCR
。
1.3模型的鉴定
取左侧梗阻肾行
HE
染色及
Masson
染色
。HE
染色,后光镜下观察肾间质纤维化、蛋白管型、肾小
管扩张和肾间质炎细胞浸润程度判定肾小管间质损
伤的程度。每个参数分为4个等级:0分为正常，1
分为轻度受损，2分为中度受损，3分为重度受损，每
个样本小管间质损伤评分总分为〇 ~ 9分
A
;
Masson
染色，借助
NIS-Elements
BR
2. 10图像分析软件定
量分析肾间质纤维化程度。每例切片取10个不重
复的400倍视野，以蓝色胶原沉积为阳性，计算蓝染
面积占整个视野的百分比，得出肾间质胶原面积与
视野内肾小管间质总面积（去除肾小管管腔）的比
值,取其平均值为每例切片的肾间质相对面积
W
。
1.4 检测方法
1.4.1 肾组织
PAX
2 蛋白和
E
-
cadherin
/
a-SMA
蛋
白免疫组化双染：取肾组织，制备切片，按免疫组化
双染试剂（
Polymer
双染检测试剂盒，北京中杉金桥
生物技术有限公司）说明书步骤操作。
PAX
2兔抗
大鼠单克隆抗体（美国
Zymed
提供）用辣根过氧化
物酶标记，显色为棕黄色;
E
-
cadherin
和
ct
-
SMA
均为
小鼠抗大鼠单克隆抗体（美国
Santa
Cruz
公司）用碱
性磷酸酶标记，显色为红色。免疫组化双染步骤：
5um
肾切片常规脱蜡水化后，抗原修复。在
3%
的
H
2〇2中孵育
10 min,
即用型封闭液孵育
10 min, PBS
液漂洗后，将一抗
PAX2
(工作浓度1:
100)
和一抗
E
-
cadherin
或
a-SMA
(工作浓度
1:100)
混合物加入
切片上,4=^冰箱孵育过夜;第二天取出在37
T
中孵
育
40 min
后
PBS
液漂洗，滴加二抗酶标记山羊抗小
鼠
IgG
聚合物和酶标记山羊抗兔
IgG
聚合物（两种
二抗等量混合），湿盒中孵育
30 min;
按照试剂盒说
明配好
DAB
显色液和
AP-Red
显色液进行显色;蒸
馏水冲洗后进行苏木素染色,用封片剂覆盖组织不
加盖玻片，水平放置切片
50 t
烤箱孵育
30 min。
光
学显微镜下观察结果。
1.4.2
实时荧光定量
PCR
分析
PAX
2
mRNA
表达：
采用
Trizol
(美国
Invitrogen
试剂公司提供）试剂，按
说明书进行操作。用紫外分光光度计测260
rnn
/280
nm
的吸光度比值及样本浓度，检测提取的
RNA
产量
及质量。
RNA
逆转录反应体系，经37丈15
min
,
85尤5
sec
，逆转录合成
cDNA
,以此为模板用
PAX
2、
a
-
SMA
(
l
: 1000)和
E-cadherin
引物经
PCR
方法进行
扩增。引物序列见表1(上海生工试剂公司合成）。
表
1 PAX2
、
a-SMA
和
E-cadherin
引物序列
基因
引
物
片段长度
(bP)
PAX2F5
，
-CGGTGAGAAGAGGAAACGAG-3'
246
R
S^GCTTGGAAGACATCG GGATA-3/
GAPDHF5，-GGC ACAGTCAAGGCTGAGAATG-3f
143
R5
，
-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3,
E-cadherinF5
，
-TGCTCCTACTGTTTCTACG-3'111
R5
，
-CTTCTCCACCTCCCTCTT-3 <
a-SMAF5
，
-AGCCAGTCGCCATCAGGAAC-3;
90
R5 '-CCGGAGCCATTGTCACACAC-3'
扩增条件为：95丈10
sec
, 95丈5
sec
, 60
T
；
34
sec
，共40个循环。融解曲线条件（
ABI
7500机器
自行设定）：95 115
sec
,60
tl
min
，95
T
15
see
。
每个基因以预实验中
Ct
值最大的样品作为其标准
品，用
EAZY
Dilution
依次稀释成四个梯度，与样品
同时扩增。应用
ABI
7500
Real-time
PCR
system
(美
国应用生物系统公司）荧光定量
PCR
仪根据标准曲
线自动分析并显示结果，用
AACT
法进行计算3
1.5 统计分析
实验数据采用均数±标准差
（Mean
±
SD
)表示，
国际免疫学杂志2020年1丨月第43卷第6期Int J Imimmol
,
Nov. 2020，Vol. 43
，
No. 6
•
637
•
采用
SPSS
17.0统计软件，两组间均数比较采用
t
检
验,两变量相关分析采用
Pearson
相关分析，以
P
<
〇.〇5为差异有统计学意义。
2 结果
结构严重破坏，肾小管萎缩，肾小管、集合管扩张呈
囊状，管腔塌陷，上皮细胞大量坏死，肾间质弥漫性
巨噬细胞、淋巴细胞浸润和成纤维细胞增生及胶原
形成。各时间点肾小球均未见明显病变;
sham
组大
鼠肾脏肾小管结构正常、排列紧密整齐，小管基底膜
光滑完整。两组肾小管损伤程度评分比较差异有统
计学意义
（P
<〇.〇5);
UUO
组各时间点相比
P
<
0.05(表2和图1)。
2.1 肾组织形态学改变
2.1.1
HE
染色：
UUO
组术后3
d
，可见肾小管扩
张，小管间质区域出现单核细胞、淋巴细胞浸润；随
梗阻时间延长肾脏损伤逐渐加重，术后14
d
肾小管
表2
两组大鼠肾小管损伤程度评分比较（
Mean
i
士
SD,
分，
n =8)
5 (1
0.134 ±0.028
3.590 ±0.629ab
15.520
0.0015
0.0005
7 d
0.128 ±0.030
4.734 ±0.522th
24.920
0.0013
0.0008
14 d
0. 149 ±0.019
6.352 ±0.861ab
20.370
组别
sh
臓组
UUO
组
3d
0.101 ±0.019
2.548 ±0.119*
34.690
0.0012
<值
•P
值
0.0011
0.0001
1■尸值
-
注：与sham组比较/尸< 0.05;UUO组内比较,bP<0.05。
细血管周围,而小管周围间质染色较少。
UUO
组肾
间质纤维组织相对面积较
sham
组明显增髙
（P
<
0. 05) ;
UU
0组各时间点相比，
P
值均< 0. 05 (表3
和图2)。
图I
各组大鼠
HE
染色
组大鼠未见异常改
变;1
B
.
UUO
组梗阻14
d
肾小符纳构《到严重破坏管腔塌
陷
、杆间质弥漫
性巨嘸
细胞、淋巴细胞浸润和成纤维细胞
坩生
i
放大倍数
x
400。
2.1.2
Masson
染色:
UU
0术后3
d
可见胶原沉积,
随梗阻时间延长进行性增多，肾间质逐渐增宽，间质
细胞及细胞外基质成分增多;组肾脏胶原染色
主要位于小管基膜、肾小*、系膜区和肾小管间的毛
表3
组别
»ham 组
UUO组
尤值
•户值
哕值
3d
1.708 ±0. 188
6.968 ±1.913"
7.740
0.0003
-
图
2 各组大鼠
Mas*〇n
染色（蓝色代表胶原沉积,
400
x
) 2
组大鼠未见异常改变;2
B
.
UU
0组
Md
肾间®纤维化程度明显加
t
、细胞外基质成分增多、胶原
沉积明
M
。
阏组大鼠肾间质相对
Iftf
积比较（
Mean
±
SD
,%,
n
=8)
5 d
1.587 ±0.294
15.363 ±1.791
21.470
0.0003
0.0004
7 d
1.580 ±0.232
22.594 ± 2.464
24.020
0.0001
0.0006
14 d
1.708 ±0.327
32.943 ±3.093^
17.310
0.0001
0.0005
注，与，ham组比较,■/><0.0],UUO组内比较,kP<0.03。
.638 .
2.2
国际免疫学杂志2020年11月第43卷第6期
ImJ
Imimm
〇
l
,
NOT
.2020,
V
〇1.43.
N
〇.6
免疫双染观察
PAX
2蛋白与
E
-
cadherin
/
而
UU
0组各时间点肾皮质中的
PAX
2
mRNA
/
GAP
-
DH
mRNA
相对表达量差异有统计学意义
（P
<0.05)
ot
-
SMA
蛋白的共表达
为了观察
PAX
2的表达与小管上皮细胞表型
E-cadherin
及肌成纤维细胞表型
a-SMA
的相互关
系，本研究采用免疫组化双染技术，结果发现在
sham
组，
PAX
2大鼠肾小管上皮细胞无表达
，
E
-
cad
herin
大量表达于肾小管上皮细胞，
PAX
2 与
E
-
cad
herin
无共表达;
UU
0 3 天后，
PAX
2 在肾小管上皮细
胞出现表达，
E-cadherin
表达量减少，
PAX
2与
E
-
cadherin
可见共表达;
UU
0 14天，
PAX
2表达更加明
显，
E-cadherin
表达逐渐减少，
PAX
2 与
E-cadherin
少量共表达;在
Sham
组大鼠
a-SMA
仅表达于小动
脉的肌层,
PAX
2与
a-SMA
无表达；
UU
0 3天后，a-
SMA
可表达于间质区及肾小管上皮，
PAX
2与a-
SMA
出现共表达；
UU
0 14天，
PAX
2和
a-SMA
共表
达区域增加。（图3)
2.3 实时荧光定量
PCR
检测
PAX
2、
E
-
cadherin
与
a-SMA
mRNA
在大鼠
UU
0模型中的表达变化
(表4和图4)。
图3 免疫双染观察两组大鼠不同时间点
PAX
2与
E
-
cadherin
(
Cl
-
C
3)/
PAX
2 与
ot
-
SMA
(
Dl
-
D
3)的共表达
3
A
.在
sham
组,
PAX
2 与
E-cadherin
无共表达;3
B
.
UU
0 3
天后，
PAX
2与
E
-
cadherin
可见共表达；3
C
.
UU
0 14天
PAX
2与
E
-
cadherin
可见少量共表达；3
D
.在
Sham
组
PAX
2 与
a-SMA
无表达;3
E
.
UU
0 3 天后，
PAX
2 与
ot-SMA
2.3. 1
PAX
2
mRNA
的表达：实时荧光定量
PCR
法
检测结果，
UU
〇组术后3
d
PAX
2
mRNA
出现表达，随着
梗阻时间的延长表达逐渐增加;
sham
组肾皮质中有
少量
PAX
2
mRNA
表达，两组
PAX
2
mRNA
/
GAPDH
mRNA
相对拷贝数比较有统计学差异
（P
<0.05);
表4
组别
出现共表达;3
F
.
UU
0 14天
PAX
2和
a
-
SMA
共表达区域
重叠增加（
PAX
2为胞核染色呈棕黄色、
E
-
cadherin
为胞
膜和胞浆染色呈红色及
a
-
SMA
为胞浆染色呈红色;箭头
所示为共表达区域，放大倍数为400
x
)。
两组大鼠肾皮质
PAX
2
mRNA
相对表达量的动态变化（
PAX
2基因拷贝数/
GAPDH
基因拷贝数
,Means
±
SD,n
=8)
3
d
0.0093 ±0_019
0.013 ± 0.002
a
4.098
0.00108
-
5
d
0.0089 ± 0.0021
0.016 ±0.0024
6.302
0.00002
0.040
7
d
0.0088 ±0.0031
0.023 ±0.003^
11.760
0.00001
0.006
14
d
0.0086 ±0.0033
0.037 ± 0.0064
13.050
0.00001
0.008
sham
组
UU
0组
f
值
a
尸值
值
注
< 0_01，与
sham
组比较
；bP
<0.05,
UU
0组内比较。
ca sham^ll
图4实时定量
PCR
检测各组大鼠肾皮质
PAX
2、
E
-
cadherin
和
a
-
SMAmRNA
的相对表达量
国际免疫学杂志2020年1丨月第43卷第6期 Int J Immunol，Nov. 2020，Vol. 43，No. 6
•
639
•
2.3.2
E-cadherin
mRNA
的表达
：UUO
组术后 3
d
E
-
caclherin
表达减少，而且随着梗阻时间的延长，
E
-
ca
(丨
herin
mRNA
表达减少更加明显；
sham
组大鼠
量比较差异有统计学意义（
P
<〇. 05);而
UUO
组各
时间点肾皮质中的
E-cadherin
mRNA
/
GAPDH
mR
NA
相对表达量差异有统计学意义 （
P
< 0. 05 )( 表 5
肾皮质中
E-cadherin
mRNA
大量表达。
UU
0组与
sham
组
E-cadherin
mRNA
/
GAPDH
mRNA
相对表达
和图4)。
表5
两组大鼠肾皮质
E-cadherin
mKNA
相对表达量变化
（Mean
±
SD,n
=8)
组别
sham 组
UU0组
f值
**尸值
bP值
3d
0.956 ±0.203
0.771 ±0.087a
2.380
0.032
-
5 d
0.991 ±0. 198
0.658 ±0.098ah
4.247
0.008
0.062
7 d
1.003 ±0. 148
0.483 ±0. 117ab
7.741
0.001
0.037
14 d
1.011 ±0. 191
0.237 ±0. 113ab
9.827
0.001
0.004
注:与sham组比较,*P <0.05 ;UU0组内比较，bP <0.05。
2.3. 3
a-SMA
mRNA
的表达
：UUO
组术后 3
d
a-SMA
mRNA
表达增加，而且随着梗阻时间的延长
a-SMA
mRNA
表达逐渐增加;
sham
组大鼠肾皮质中
a-SMA
mRNA
有基础表达量。
UUO
组与
sham
组
表6
组别
sham 组
uuo组
f值
•尸值
bp<6
3d
1.179 ±0.27
3.562 ±〇.792a
8.054
0.00018
-
ot-SMA
mRNA
相对表达量比较差异有统计学意义
(P
< 0. 05);而
UUO
组各时间点
ct-SMA
mRNA
相对
表达量比较差异有统计学意义（
P
值均< 〇. 〇5 )(表
6和图4)。
两组大鼠肾皮质
a-SMA
mRNA
相对表达量变化（
Mean
±
SD
，
n
=8)
5 (1
0.957 ±0.215
5.294 ±1.088®**
11.060
0.00011
0.001
7 d
1.101 ±0.251
7.393 ±1.277ah
13.670
0.00001
0.001
14 d
0.988 ±0.191
12.223 ± 1.80lah
17.550
0.00001
0.001
注:与sham组比较,*/><0.05;UUO组内比较,bP<0.05。
2.3.4 相关性分析：为进一步分析
PAX
2与
EMT
细胞表型特异性标志物表达的关系，本研究采用
Pearson
相关分析，结果显示，肾小管
PAX
2
mRNA
水平与肌成纤维细胞表型
a-SMA
mRNA
水平
（r
=
0.993,
P
<0.05)呈正相关，与上皮细胞表型
E
-
cad
herin
mRNA
水平呈负相关 （
c
= -0.983,
P
< 0.05 )
(图 5)0
H-------------1------------1------------1------------«
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04
PAX2
〇
•
〇
_
0.00
i
0.01
I
0.02
PAX2
i
0.03
i
0.04
图5
PAX
2
mRNA
与
cx-SMA
mRNA
和
E-cadherin
mRNA
水平的相关性分析（散点图）
•
640
•
国际免疫学杂志 2020 年 11 月第 43 卷第 6 期 Im J Immunol，Nov. 2020，Vol. 43，No. 6
3讨论
慢性肾脏病
（chronic
kidney
disease
，
CKD
)已成
为威胁全世界的公共健康问题，慢性肾脏疾病的发
病率在世界范围内持续增加[1W1]。肾间质纤维化
是各种慢性肾病发展至肾功能衰竭的共同通路。在
本研究中，通过
he
和
M
ass〇n染色观察到尿路梗阻
后肾脏纤维化表现:肾间质弥漫性巨噬细胞、淋巴细
胞浸润；肾小管扩张、萎缩、管腔塌陷；肾间质增宽、
胶原纤维的沉积等。证明本实验
UUO
模型造模成
功。
EMT
即肾小管上皮细胞在病理条件下可发生
转分化，失去其特有的细胞表型和特征，获得新的表
型，转化为肌成纤维细胞。
EMT
是一种有序的调节
过程，有四个关键步骤:①上皮细胞失去黏附能力；
②
(X
平滑肌肌动蛋白
（otsmooth
activatorProtein
，
(
X
-
SMA
)的表达;③肾小管基底膜破坏;④细胞迁移和
侵袭能力增强[12]。
E
-
cadherin
是肾小管上皮细胞特
征性标志，在
EMT
时首先消失；
a
-
SMA
是肌成纤维
细胞标志性蛋白己得到公认。因此选择上述两种细
胞表型特异性标志物作为判断小管
EMT
的指标。
本实验研究结果显本，在
sham
组
E-cadherin
mRNA
和蛋白存在大量表达，在
UUO
组第3天，肾皮质
E
-
cadherin
niRNA
表达水平出现下降，随着梗阻时间
的延长表达逐渐降低，术后14
d
E
-
cadherin
表达大
量消失，仅见弱表达。与此同时，
a-SMA
mRNA
在
sham
组表达极少,
UUO
组随着梗阻时间的延续肾间
质损害程度的加重，
a-SMA
mRNA
表达呈现明显的
上调趋势。以上研究结果表明，
UU
0大鼠在肾间质
纤维化的同时伴有肾小管上皮细胞表型特异性标志
物
E
-
cadherin
的下调和肌成纤维细胞表型特异性标
志物
a
-
SMA
表达上调，提示肾小管上皮细胞发生了
EMT
0
在胚胎肾脏发育过程中，胚胎期后肾间充质细
胞在形成肾单位过程中要经历了间充质-上皮转化，
PAX
2是
MET
关键性因子，成熟肾单位其表达消失。
近来发现，在肾脏损伤后出现重新表达[13]。
本实验采用免疫组化双染技术观察
PAX
2的表
达与
E-cadherin
及
a-SMA
的相互关系，结果发现在
sham
组大鼠，
PAX
2蛋白在肾小管上皮细胞无表达，
E-cadherin
蛋白大量表达于肾小管上皮细胞，
a-SMA
蛋白仅表达于小动脉的肌层，
PAX
2和
E-cadherin
或
a
-
SMA
之间无共表达
；UUO
3
d
后，
PAX
2和
E
-
cad
-
herin
/
a-SM
A
之间开始出现共表达；随着梗阻时间
的延长，
PAX
2表达更加明显，
E
-
cadherin
表达逐渐
减少，
PAX
2和
a
-
SMA
蛋白共表达区域增加。
Pear
son
相关分析结果显示
PAX
2
mRNA
水平与
a-SMA
mRNA
水平呈正相关，与
E-cadherin
mRNA
水平呈
负相关。结果提示，肾小管
EMT
过程中，
PAX
2蛋白
的表达与细胞表型的改变有一定的关系，
PAX
2参
与了肾间质纤维化
EMT
过程。
PAX
2存在复杂的信
号传导通路[14_15]，
PAX
2与肾间质纤维化
EMT
之间
具体分子机制及信号通路还有待进一步研究。
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