2024年4月6日发(作者：漆学)

新疆农业科学

2001,53(4)

：

700

-7H

Xinjiany

AgUca/urai

Sciescas

doi

/

41

6448/j.

isx.

641

-

4334.

Hl.

44.413

4

种

RNA

的

dsRNA

提取方法

果评价

常瑞

3

王

俊

2

,

付开*

5

,

廖兰兰

5

,

丁新华

5

,

何

江

5

,

郭文超

4

,

吐尔逊•阿合买提

5

,

任羽

1

(1

.喀什大学生命与地理科学学

3,

新疆喀什

844006

；

2.

新疆农业农村厅植物保护

O

,

鸟鲁木齐

830049

；

5.

新疆农业科学

3

植物保护研究所/

农业部西北荒漠化绿

｛

作物有害生物综合洽理

E

点实验

I,

鸟鲁木齐

830091

；

4.

新疆农业科学

3

微生物

｛用研究所

/

新疆特殊环境微生

GE

点实验

I,

鸟鲁木齐

836691

)

摘

要

：

【

目的

】

构建表达不同片段长度和

GC

含量的

dseWp

片段

，

比较

4

种

dsRNA

提取方法,获得最佳的提

取方

法

以及dsRNA

相对

最优

的表达载体

，

为

dsRNA

的降解研究提

供

基础

。

【

方法

】

4

pET-2p

和

L4444

为载

体

，

分别构建

5

组不同长度

、

不同

CG

含量的

Op

-241

-34CG

、

Wp

-241

-54

-

CG

、

Wp

-423

-

32CG

、

gfp

-423

-54CG

和

Wp-403

-74CG

为目的片段的

dsWp

表达载体

，

运用

T/zoi

法

、

酚

氯仿

法

、

RNA-

不均提取液以及

75%

酒精沉淀法分别提取

1

和

54

mL

经异丙基硫代

-

0

-

D

-

半乳糖

3(

(

PTG)

诱导菌液表达的

dsWu,

核酸检

测

A

4o/

A

4o

、

A

4o/

A

o/

比较纯度，

以体外合成

dsWp

为对照

，

评价

4

种方法提取效率及

2

种载体

dsWp

表达能

力

。

【

结果

4

种提取方法经多重方差分析，

其中提取纯度最高的是

TUzoi

法和酚氯仿法

A

2

00/

/

A

28

7-,A

2

00/

/

A

0

3

0

均

值分别可达

7

83

、

/

97;

7

78

、

2.

1,

损失率分别为

23.

83%

H

24%

。

其次是

75%

酒精沉淀法

A

2

00/

/

A

28

0

，

A

26

0/

(

A

56

均值可达

78,7

78,

损失率为

36.

8%

o

提取纯度最低的为

RNA

-

平均提取液

，

其

A

26

0/

/

A

28

9

A

26

0/

/

A

0

3

7

均值

可达

7

56

、

7

56,

损

失率

为

371

60%

。

利用内标混合

纯

dsRNA

的方

法

，

计

算获得每毫

升

pET-2P

和

L4444

表

，

达载体诱导菌液可发酵产生

&7~24.39

R

g

、

7.28~22.47

R

g

dsWp

。

【

结论

】

提取

pET-2p

和

L4444

表达的

-W

p

,

其中酚氯仿法可用于快速提取高质量

、

高

纯

度原核表达的

dsWp,pET

-2p

为

ds/u

最优表达载体

。

关键词

原核;双链

RNA

；

提取;降解

中图分类号:

S188

文献标识码:

A

文章编号

：

641

-

4336

(2401)44

-

4744

-

17

4

引言

【

研究意义

】

马铃薯甲虫

(

LeptUotara

decem-

Puata

Sna

专一性

、

安全性强

，

且植物生

响

，

对

挖

掘更多生物防

要

［

］

。

但

dsRNA

生产成本高

、

产量无法预测

、

稳定性低

。

)

是马铃

性害虫

。

持续化学防治

【

前

进展

］

dsRNA

在环境中极

定

，

自然

。

并且其

使马铃

虫对部分拟除虫

、

氨基甲酸酯

、

有

机磷

、

新

类和微生物杀虫剂产生了抗性

［

］

。

下

3

~7

h

就

NA

在紫外

；

示

等

［

］

发现

dsR-

下

,4h

就

系统

，

植物

使用

RNAi

技术,喂食马铃薯甲虫涂抹

dsRNA

的

铃薯叶片

2

低

、

沉默马铃

机制

、

扩增

虫特定基

-RNA

以及有害生物对

RNAi

敏感性差别大等因

因表达

，

抑制马

铃

虫的正常生

，

具有高

素⑷

。

目前

，

dsRNA

主要通过

3

个方法大量生

收稿日期

(Receives)

：

2020

-

11

-47

基金项目

：

勺治区创新环境(人才、

基地)建设专项(人才专项计划

-

天山雪松计划

)(

218XS36

)

新疆农业科学院科技创新重点培育专

项

“

新疆重大新发农林入侵生物监测预警与综合防控

”

(XU

cp

-002

)

作者简介

：

常瑞

(693

--

，

男

，

新疆人

，

硕士研究生

，

研究方向为资源微生物开发与利用

,(E-maii)

；

cyagpSS

@0

x

111.

cm

通信作者

：

文超

(

666-

)

男，

可北人

，

研究员

，

博士生导师

，

研究方向为农业害虫综合防治

,

E-mUi)

增

**********

付开赞

(

1987

-

-

，

男

，

浙江人

，

助理研究员

，

在站博士后

，

研究方向为昆虫生理生化与分子生物学

,

E-maii)fuUaiyyuC7@

65

2

anm

9

期

常瑞等

7

种原核表达双链

RNA

的

dsRNA

提取方法效果评价

771

产:一是合成含有

T3

启动子的

-RNA

特异性引

物

2

外合成试剂盒合成

dsRNA

S4］

。

二是

原核生物

生产

-RNA,

最早用于干扰秀丽引

线虫

，

喂食

引线虫时可产生强烈干扰

。

将构

建完成的

-RNA

表达载体导入

RNase

III

缺陷型

大肠杆菌

HT115

（

DE3

-感受态中

，

经异丙基硫代

-0

-D

-

半乳糖

3

（

ITG

）

诱导

，

产生

dsR-

NA

［

2,

］

。

过转基因植物表达

dsRNA

,

使植

物具有

“

终生

”

防御性

，

害虫啃食植物后

2

次

抑制其生

死亡

，

无

为干

预

［

,1

。

【

本

切入点

】

方法可大量合成

-R-

NA,

快速高效

，

合成

dsRNA

可直接使用,但体外

合成试剂盒成本较高

，

实际大规模推广使

切

际

。

方法

得到大量

-RNA,

且成本较

低

。

但

、

诱导过程中

，

如何保

高活

性

、

持续产生

-RNA,

仍需有待研究

。

针对

RNAi

的特异性以及原

获得

-RNA

良好的应用

前景

，

以

pET-2p

和

）

444

为载体发酵产生

dsR-

NA

的

法为基础

。

筛选

4

种提

取菌液总

RNA

方法以提高菌液

-RNA

的获取

率

。

【

拟解决的关键问题

】

利用

720

bp

-

荧光

蛋白

Wu

［1_I5

］

为模板

，

分别随机改变碱基改变

GC

含量,并构建

5

组

组合的

-增

0

片段

：

201

bp

长度的

30%

CG

含量的

dsWp

（

简称

201

-

37CG

,

下同

）

,201

-

50CG

、

423

-

37CG

、

423

-

50CG

、

423

-72CG

。

运用试剂盒体外合成以上

7

种

dpf,

检测其浓度

、

纯

为

标准

。

将以

上

6

组表达

原

，

运用

TUzoi

法

、

酚

氯仿法

、

RNA-

平均

提取液

、

以及

75%

酒精沉淀

法

分另

U

提取

―增小

。

建立菌液表达

dsRNA

的最佳

提

法以及最优表达

提供理论支持

。

1

材料与方法

1

2

材料

1.1.1

载体

pET

-2p

、

L449

质粒实验室保存

。

1.1.6

菌株

大肠杆菌

HT115

（

DE3

-菌株购自上海唯地生

物技术有限公司

，

培养至二代菌株由该实验室保

。

1.1.3

主要试剂及仪器

试剂:

Truss

-

T1

感受态细胞

、

2xEasy

Taq

PCR

Supee

MS

（

全式金

）

；

琼脂糖

（

西班牙

）

；

LB

broth

（

MDBia

,

Ise

-;

卡那霉素

（

Kans

-

、

四环素

（

Tel

）

、

氨节青霉素

（

Amp

）

、

I

PTG

粉末

；

苯酚:氯仿

合液

（

20

：

24

）

等

（

SolarUia

-

；

质

提试剂盒

、

琼脂糖凝胶

剂盒

（

OMEGA

-

；

Hibcribe™T

2

High

Yield

RNA

Syythesis

Kii

（

NEB

-;限制性内切

酶

EcoRS

、

NotO

、

HUgA

i

、

XhoU

（

Thermo

-

;

ClosEx-

pressI

I

Osa

Step

Closinq

Kit

、

RNA

-

essp

提取液

（

Vazyme

）

；

TUzoi

Reaqest

（

ambios

-

;

焦炭酸二乙酯

（

DEPC

2

Sshap

）

;

异丙醇

、

无水乙醇均为分析纯

；

D

全

se-/R

全

se

-

0

平

离心管

、

移液器枪头

（

BU

o/pix

）

。

:离心机

（

湘立

TGL6M

）

；

PCR

仪

（

ICy-

cliny

96

梯度-

；

摇床

（

TASITEDY

-200B

-

；

电热恒

温干燥箱

（

TASITE299

-1AB

）

；

水浴锅

（

BATHS

-

；

核酸电泳系统

（

北京六一

DYY-6D

）；

凝胶成像

系统

（

Wealtac

Dolphin

）

D

）

；

B

-

500

BIUPHOTO

METER

（

METASH

-

；

-87°C

冰箱

（

Thermo

ULTS1873

-

；

超净工作台

（

江苏通净

VD

-650

-

；

超纯水机

（

青岛富勒姆

FBZ0502

-

SUP

）

。

1.3

方法

1.2.3

dsfC

基因

、

引物合成

以来自于

720

bpWu

的序列为模板

，

对其基因

进行设计优化

,

随

变碱基

CG

含量

，

交由南京

金

斯

瑞生物科技有限公司完成基因合成

。

合

成了

7

组不同长度组合的―增小片段

：

2

01

bp

长度

的

37%

CG

含量的

dsWp

（

简称

201

-

37CG

,

下

同

）、

201

-50CG

、

423

-30CG

、

423

-50CG

、

423

-

77CG

。

以

T

2

启动子为起始序列设计

、

合成引物

，

用于体外合成

―增小

。

以

XhoI

、

HUidIII

（

L4444

）

和

KpU

、

Nof

（

4hT

-20-

为双酶切位点设计

、

合成引

物

，

用于构建

）

444

-

增

0

和

pET

-2p

-

Wu

表达

载体

。

表

3

图

1

722

53

卷

表

、

用于

dsRNA

合成

、

载体

构建引物序列

Table

1

POmer

Ur

dsRNA

synthesis

and

化＜^

00

111

x

1:01

引

物

Prinmes

T7-G221-32-F

T7-G221-32-R

T

-

G201

-56

-F

序

列

(5tW

J

)

Sequences

(5

toO

5

TAATACGACTCACTATAGGGAATAAGTTAAGAGACTGCA

TAATACGACTCACTATAGGTCTTCTTTATTATCTAAC

TAATACGACTCACTATAGGGACTAAGTGCAGAGAGTGCG

TAATACGACTCACTATAGGTCTTCTTGCGTGTCTAACTTGTAATA

T

-G201

-56

-R

T

-G425

-30

-F

TAATACGACTCACTATAGGGATTAAGTTCAATGTGTCATATG

TAATACGACTCACTATAGGTGATTCATCTTGATATCGATCAT

T-G425

-30

-R

T

-G425

-56

-F

TAATACGACTCACTATAGGGATTAAGTTCAAAGAGTTCGTCGTGG

TAATACGACTCACTATAGGGGACTCCCCCTGGTGGC

TAATACGACTCACTATAGGGACTAAGTTCAGCGTGTGC

T-G425

-56

-R

T

-G425

-77

-F

T-G425

-77

-R

L-G201

-30

-F

*

L-G221-32-R

TAATACGACTCACTATAGGGCTTTCGCCCTGATGAC

GGCAGATCTGATATCAAGCTTGAATAAGTTAAGAGACTGCA

GGTACCGGGCCCCCCCTCGAGTCTTCTTTATTATCTAACTTGT

L

-

G201

-56

-F

L-G201

-56

-R

GGCAGATCTGATATCAAGCTTGACTAAGTGCAGAGAGTGCG

GGTACCGGGCCCCCCCTCGAGTCTTCTTGCGTGTCTAACTTGTAATA

GGCAGATCTGATATCAAGCTTGATTAAGTTCAATGTGTCATATG

GGTACCGGGCCCCCCCTCGAGTGATTCATCTTGATATCGATCAT

L

-

G405 -30

-F

L-G405

-30

-R

L

-

G405 -56

-F

L-G405

-56

-R

GGCAGATCTGATATCAAGCTTGATTAAGTTCAAAGAGTTCGTCGTGG

GGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGGACTCCCCCTGGTGGC

L

-

G405 -77

-F

L-G405

-77

-R

GGCAGATCTGATATCAAGCTTGACTAAGTTCAGCGTGTGC

GGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGCTTTCGCCCTGATGAC

CTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGAATAAGTTAAGAGACTGCA

AAGGGGTTATGCTAGGGTACCTCTTCTTTATTATCTAAC

P-G221-32-F

P-G221-32-R

P

-

G201

-56

-F

P-G201

-56

-R

CTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGACTAAGTGCAGAGAGTGCG

AAGGGGTTATGCTAGGGTACCTCTTCTTGCGTGTCTAACTTGTAATA

CTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGATTAAGTTCAATGTGTCATATG

AAGGGGTTATGCTAGGGTACCTGATTCATCTTGATATCGATCAT

CTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGATTAAGTTCAAAGAGTTCGTCGTGG

P

-

G405 -30

-F

P-G405

-30

-R

P

-

G405 -56

-F

P-G405

-56

-R

AAGGGGTTATGCTAGGGTACCGGACTCCCCCTGGTGGC

CTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGACTAAGTTCAGCGTGTGC

AAGGGGTTATGCTAGGGTACCGTCTTTCGCCCTGATGAC

P

-

G405 -77

-F

P-G405

-77

-R

pET

-

0p/L4447uw

TAATACGACTCACTATAGGG

注

5

:

L

为

L4447

载体缩写

,

P

为

pET-2p

载体缩写

Note

:

*

:

L

is

the

aUbreviation

of

L4440

vector

,

P

2-

the

adbreviaUw

of

pET

-

2p

vector

9

期

常瑞等

7

种原核表达双链

RNA

的

dsRNA

提取方法效果评价

773

201-30CG

201-50CG

423-30CG

423-70CG

GA

TAAGTtcA

G

gT

c

tcGtgGt

G

GGt

GtTg

cAt

TaCgtcAAgc

GAtc

GAaGTTCA

T

AtcAT

G

A

gc

G

gc

T

c

cA

c

a

g

GA

CA

Cc

H0

160

'GAA

'GU

CA|C|

180

AT

200

220

201-30CG

201-50CG

423-30CG

423-50CG

I

40

jat

J

at

B

a

S

gt

j

H

cmtg

I

t

T

3

T

AT

TATAATAT

1

I

(:

ICAAGTT0

201

201

hAGTT

hAGTT

mm

A.

T

'GU

taat

I

CG

C

C

TC

'CCATGAATATACCATCTTATTCAAGGACAAC

TCTAAGACCAGi

jTGCTCATCATCTTCtAi

238

230

238

423-7OCG

i

；

C

■CG

CGC

TC

GC

hAGTT

|TGCGC|TC

TCTGCGTCCGG

TGCGCtChCCIGCjGi

:

TGCAGGGTCGTC

GA

cT

cgt

g

gc

c

T

cAacC tTaCc

agaCcaCAtGAA

g

a

G

T

T

CAAGTT

g

cA

aGa

G

260

201-30CG

201-50CG

423-30CG

423-50CG

423-70CG

PACTAGA

CTAATAK|AGGTGAAGTTC®®T|hTT

:

TGGTGAATCATATTGAATTGAATGAT

TAmTAACAT^

TAGTATAC1AATTGGAGTA

357

35?

GCAGGATCCCCGjAGAGGTGAAGTTCGTGGTA&ACATC!

:

AGGTGAACCTCATAGAGCTGAAGGGC

|TCJ

GCI

TGCAAGACCCGCGTCGTGGTGAAGTTCGTGGCCGTCACC

:

CGGGTGAACCGC|Tc|TGCGpAG|Tc|c

y^G|AGG?Tl

'GGCCGTCAACACCCGGGCGCGCAGGCGGGTGTG

357

360

300

MO

420

201-30CG

201-50CG

n3-30CG

CAACTAi

:

AACAATUCA

ATGTCTATATCATGATTGACAAATAGATGATCGATATCAAGATGAATCA

423

423

423

423-50CG

423-70CG

:

AATEAi

:

AACAACCTC4

AAGATTATATCAC

■GTCGCCAGGCAGAAGAACG

CCi

GGEAGTCC

CAACTGCAGCAGCCGCAGCGTCTGTATCAC

1GTCGTCAAGCGGAGGAGCG

TC

ATCAGGGCGAAAGC

图

1

不同长度

、

CG

组合的

dsgfp

片段

序列

Fig.

1

Sequeece

of

dsgfp

fragmeets

of

differeet

leegths

and

CG

cambinations

1.2.2

重组表达载体构建

1.2.2.

2

目的基因

PCR

扩增及回收

1.2.2.3

感受态细胞制备

HT119

（

DE3

）

X

代甘油超低温保存菌种以

1

：

110

圭

以人工合成的目的片段为模板,使用表

1

引

物进行

）

444

-

Wu

、

pET-2p-Wu

Q

的片段

PCR

反应

:94

c

3

mk

；

94°C

30$

、

65

30s

,

每个循环降

0.5°C

、

72°C

30

均

17

个循环

；

94°C

30x56°C

30

均

72°C

30s,

35

个循环

；

72°C6

mk

。

7

9%

琼脂糖

含四环素

（

Te/

）

-

LB

培养基

中

，

37C

250

g

离心力培养过夜

。

挑取单克隆

37°C

250

y

离心力培养

7

h

o

活化后菌液

1

:

60

在

LB

液体培养基

（

Te/

）

37°C

250

g

离心力培养

0

~3

量至

OD

为

0.

4

~0.

6

。

将菌液冰上放置

10

凝胶电泳检测

，

切下目的条带运用试剂

的构建

。

1.2.2.

3

L4449

-

Wu

与

P

ET-2P-Wu

表达载体

mis,

使温度降至

0

°C

,0-

1

mol/L

CaC/

溶液同时

放置冰上预冷

。

4C

9

10

y

离心力

6

mk

。

沉淀

中加入

5

：

1

体积预冷后

0.

1

mo/L

CaC/

溶液悬

（

11

L4449

载体与

pET

-

2p

载体线性化

）

440

载体双酶切体系为

：

6

r

L

DNA

、

2

r

L

XhoI

、

2

r

L

HkSIII

、

2

r

L

17xFast/igesi

Green

Buff-

vr^

r

L

I

HO,

总体积为

20

r

L,37

o

C

6

mk

；

浮

。

冰上放置

6

~37

增

（

,

4

七

9

000

y

离心力

10

mk

。

沉淀加入

27

：

1

体积

0.

1

mol/L

CaC/

溶液和

27

：

1

体积

37%

甘油

,

冰上放置

17

mk

o

菌体重

87C

17

mko

pET

-

2p

载体双酶切的体系为

：

6

r

L

DNA

、

2

r

L

N

o

U

悬,分装并

-80°C

保存

。

、

2

r

L

K

p

U

、

2

r

L

17xFast/igesi

724

Green

Buffer

、

、

»L

dd

比

0,

总体积为

2/

»L,37°C

5

min;84C

5

m

—

。

1%

琼月旨糖凝胶电泳

，

回收目

的

DNA

o

（

2

）

L4440

-

Fu

与

pET

-

2p

-

gfj

重组载体构

建与表达

使用

C

—

nExpressII

Ona

Step

Clon

—

p

Kit

将线

性化质粒与目的片段重组

，

反应体系为

50

r

L

重

组产物加入

62

r

L

Trans

-

T1

感受态

,

5

鱼固

体

LB

培养基

（

L440

：

氨节青霉素

AmppET

-

2

品卡那霉素

KaNW

）

37°C

过夜

。

次日挑取

单克隆

37C

250

g

离心力培养

5

h

o

运用表

1

的

引物进行菌液

PCR

验证

。

验证正确的菌液

5

62

接种于

LB

液体培养基中

（

L4444

：

AmupET

-

2

品

KaNW

）

37°C

250

y

离

心力培养

8.6

代

提取

质

进行

双

酶

切验证

，剩

送

北京华大

基因

公

司

测序

。

将验证正确的质粒转入

HT118

（

DE3

）

感受

态,涂布至

LB

固体培养基上

（

L4444

：

AmppET

-2

品

KaNW

）

37°C

倒置过夜

。

次日挑取单克隆

87%

256

a

离心力培养

5

h

o

运用表

1

引物进行

菌液

PCR

验证,保存验证成功的菌液

。

1.0.8

dsgfp

的诱导表达

将验证正确的菌液

5

1

002

接种于

LB

液体

培养基

（

L4440

:

Amp

Tet

；

pET

-

2p

:

KaNa

（

、

TeU

）

37°C

256

p

离心力活化过夜

。

以

1

：

80

接

种于

LB

液体培养基

（

L440

:

AmpTet

+

；

pET

-

2

品

KaNa

+

、

TU

）

37°C

250

p

离心力培养

8.6

U

,

加入

IPTG

溶液继续振荡培养

5

ho

取

1

mL

菌液

提取总核酸

5%

琼月旨糖电泳检测

,41X5

J

软件灰

度分析电泳条带

。

将成功诱导

dsgfj

的菌液加

56%

甘油

（

1

：

1

）

-82C

保存

。

1.2.0

体外合成

dsgfp

1.0.4.

1

DNA

模板制备

将成功诱导

PFu

的菌液

5

1

002

接种于

LB

液体培养基

（

L4440

：

Amp

+

、

TU

；

pET

-

2p

:

Ka-

NaTei

+

）

37

o

C

256

p

离心力培养

16

~

6

h

提取

质粒

。

含有

T

丿

目的引物进行

PCR

反

应

,5

5%

糖

凝胶电泳检

测

，

切下目的条带运

剂

。

表

1

1.0.

0.

0

体外转录

、

退火形成

dsbu

反

应体系为

：

NTP

Buffar

Mia

16

r

L,

Temp

lata

DNA

3

r

L

（

2.

6

Ry

）

,

T

RNA

po

—

merasa

Mia

6

53

卷

r

L,

总体积

为

20

r

L

o

37°C

温浴

4~6

代

将反

应

液于

74°C

水浴

12

m

—

,冷却至室温

。

加入

10

：

1

体积

Dnnsa

I

和

Rnnsa

A

稀释液

（

稀释

2/0

倍

）

,

37

°C

39

m

—

。

取

1

r

L

合成

dsbu

溶于

6

r

L

Nn-

cleusa

-

Frea

water,

5

5%

糖凝

胶电泳检

测

，

产物

-84C

保存

。

1.2.0

4

种方法分别提取

-440

-

Fu

和

pET-2p

-

Fu

表达

PFu

1

.0.

0.

1

Trizol

法

52mL

，

4C

7522g

离

心

5mnt

。

沉淀加入

52

：

1

体积

Trizol,

震荡

，

室温放置

5

m

—

o

加入

5

：

1

体积氯仿

，

震荡

5s,

室温放置

12

mix

,

4C

6

002

n

离心

5

m

—

o

上清加入

2

：

1

体积异

丙醇

，

颠倒

5~6

次

，

室温静置

6

m

—,

O

C

6

002

g

离心力

12

m

—

o

沉淀加入

1

:

1

体积

75%

乙

醇

4C

7

570

g

离心力

5

m

—

o

重复洗涤

、

次

。

沉淀

室温静置

5

~12

mix

后加入

39

r

L

DEPC

水

。

溶

解的

dsRNA

加入

12

：

1

体积稀释的

Rnnsa

A

和

Dnasa

I

消化后

,37

°C

6

mP

,

-82°C

保存

。

1.0.7.0

酚氯仿法

取

56

mL

诱导菌液

，

4C

7

570

y

离心力

5

m

—

o

沉淀加入

62

：

1

体积

STE

buffer,

涡旋振荡

。

加入

、

：

1

体积苯

酚:氯

合液

（

25

：

24

）

,

涡旋

102s

。

4C

6

002

y

离

心

力

5

min,

上清加入

2

：

1

体积异

丙

醇

，

室温

16

m

—,

O

C

6

002

g

离

心

力

6

m

—

o

沉淀加入

1

:

1

体积

75%

乙醇

4C

7

570

g

离

心

力

5

m

—

o

重复洗

涤

、

次

。

沉淀室温

静置

5

~

12

mix

后加入

39

r

L

DEPC

水

。

溶解的

dsRNA

力

［

J

入

12

：

1

体积稀释的

Rnnsa

A

和

Dnasa

I

消化后

,37°C

6

mP

,

-82°C

保存

o

1.2.

5.

3

RNA

-

eusp

提取液

52mL

的

，

4C

7522g

离心力

5

m

—

,1xPBS

清洗沉淀

。

加入

102

：

1

体积

RNA

-

easy

提取液

，

室温

6

002

p

离心力

5

mix

。

上清

加入

、

：

1

体积异丙醇

，

室温静置

6

m

—

o

室温

16

002

y

离心力

16

m

—

o

沉淀加入

1

：

体积

75%

乙醇

4C

7

502

g

离心力

5

m

—

o

重复洗涤

、

次

。

沉淀室温静置

5

~16

mix

后加入

39

r

L

DEPC

水

。

溶解的

dsRNA

加入

6

：

1

体积稀释的

Rnasa

A

和

Dnasa

I

消化后

,37

°C

6

mP

,

-82°C

保存

。

1.0.

7.0

75%

酒精沉淀法

取

56

mL

诱导菌液

，

4C

7

570

y

离心力

5

4

期

常瑞

等

：

4

种原核表达双

链

RNA

的

dsRNA

提取方法效果评价

725

同/自沉淀加入

25

：

1

体积

75%

乙

醇

，

室

温静置

5

液

dsFu

测定浓度

，

根据提取方法损失率

，

计算

pET

-2P

、

L440

表达的

dsFu

产量

。

m

—

o

加入

4

：

1

体积

66

mmo

—

L

NaCt

溶液

，

室温

静置

60

mix,

2

°C

6

002

p

离心力

6

m

—

。

上清加

入

6

：

1

体积稀释的

Rnasa

A

和

Dnnsa

I

消

化后

，

87

°C

5

mP

,

-84°C

保存

o

1.2.6

dsFu

浓度

、

纯度讽

'J

定

1.5

数据处理

运用

Imapa

J

软件分析载体表达

dsFu

灰度

值

。

Microsoft

offica

Excel

2/6

、

SPSS

25.

0

软件对

体外合成

PFu

以及菌液提取

dsFuA

26

o

/

/

A

28

4

4

1.2.6.

1

体外合成

dsFu

浓度

、

纯度

A262/A232

值进行多重方差分析和新复极差法进行

显著性分析

。

2

样本间均数比较采用配对

T

检

取

2

r

L

dsFu

样品于

B

-

570

BIOPHOTO

METER

检测

，

用

Nncleusa

-

Free

watar

分别稀释

。

至浓度为

、

002

、

502

、

252

、

125

、

62.5

和

8

5

05

平/

r

L

并检测

A264/

A2

54

4

A262/

A

232

。

稀释

dsFu

5

5%

6

结果与分析

2.

1

IPTG

诱导基于

PET-

2

P

、

L4440

产生

dsFu

琼脂糖凝胶电泳检测

6/

V

25

m

—

o

1.0.

0.

0

菌液提取

dsFu

浓度

、

纯度

pET

-

2

品

和

L440

经

IPTG

诱导表达产生

取

2

r

L

dsFu

样本于

B

-

570

BIOPHOTO

METER

检测

，

用

Nncleusa

-

Free

watar

分别稀释

PRNA

,

经

RNase

A

消化后

5

5%

琼脂糖凝胶电泳

检测

，

pET

-

2p

-

Fu

和

L4440

-

Fu

表达载体

。

图

6

2

.

4

pET

-2P.L4440

产生

dsFu

电泳条带

至浓度为

、

002

、

502

、

252

、

125

、

62.5

和

8

5

05

平/

r

L

并检测

A264/

A2

54

4

A262/

A

/32

。

稀释

PFu

5

6%

琼脂糖凝胶电泳检测

6/

V

25

m

—

o

1.2.0

损失率检测及

dsFu

产量

研究表明

,

基于

pET

-

2P

载体表达的

5

组不

同长度

、

不同

CG

含量的

dsFu

灰度值均高于基于

L440

载体表达的

5

组

量

/

将体外合成的

5

组

PFu

分别稀释至

1

002

中

，

运用以上

2

、

不同

CG

含量的

r

L,

将

39

r

L

稀释液混合至

56

mL

未经

IPTG

dsFu

，

具有显著差异

（

P<0.05

）

。

其中

法进行提取

，

B-

pET-2p

表达

2/1

-

39CG

以及

4/8

-

39CG

灰度

570

BIXPHOTO

METER

检测浓

^4

A

26

0

/A

28

4

>

值明显高于

L440

表达

2/1

-

39CG

和

4/8

-

39CG

灰度值

。

图

8

A

260

/

A

252

。

运用最佳提取方法分别提取

1

mL

菌

D2000

201-30GC

201-50GC

423-30GC

423-50GC

423-70GC

DL5000D2000

201-30CG

201-50CG

423-30CG

423-50CG

423-70CG

500

250

+Rnase

A

*-Rnase

A

+Rnase

A

+Rnase

A

»Rnase

A

a

b

注:品基于

pET-4p

表达

dsFu

；

b

：

基于

L4440

表达/表品

D2600

：

分子质量标记(天根

)

其大小分别是

0

0223

22

、

752

、

502

、

252

、

100

；

DL5002

：

分子质量标记

(

TaKaRa)

，

其大小分别是

5

000

、

5

0024

0023

002

、

752

、

502

、

252

、

62

Note

:

v

:

express

dsFu

bawb

on

pET

-

0p

,

b

:

express

dsFu

bawb

on

L4447.

D2000

:

molecular mass

marker

(Tiangeu)

of

2,500,

1

,200,

756

,

502

,

256

,

102

；

DL5002

:

molecular

mass

marker

(

TaKaRa)

of

5

,

202

,3

,

202

,

2

,202

,

1

,202

,

750

,

562

,

250

,

62

图

2

基于

pET

-2p

和

L4440

表达

dpU

5

5%

琼脂糖凝胶电泳检测

Fig

・

2

Agarose

gei

electrophoresis

detection

based

dsyfu

5

6%

pET

-2p

and

L4440

eapression

706

53

卷

■

pET-2p

D

L4440

输

0

1.

a

8

6

4

■

pET-2p

D

L4440

*

e

。

u

血

-

e

u

©

J

a

l

u

g/d

6sp,

a

a

注

/

表示在

0.93

水平上差异

显著(配

对

T

检验

)o

a

：

基于

pET-4p

和

L4440

表达

201

bp

dsWp

条带灰度

；

b

：

基于

pET-4p

和

L4449

表达

445

bp

dsWp

条带灰度

；

Note

:

*

means

significant

diSeresce

at

the

0.

23

level

)

paiph

T

test),

a

:

Gray

analysis

of

21

bp

dsWp

bands

expresseh

baseh

on

pET

-

4p

and

L4449

；

b

:

Gray

analysis

of

445

bp

dsWp

bands

expresseh

baseh

on

pET

-

4p

and

L4449

图

3

基于

pET-2p

和

L4449

表达

dse

7

5

%

琼脂糖凝胶电泳条带灰度

Fig

・

3

Gey

analysis

dsge

7

5

%

agarrse

get

electrrphoresis

bands

bases

on

pET

-2p

2.

3

体外合成

dsWp

浓度

、

纯度

研究表明

,

分别梯度稀释

6

组浓度

，

每组

du/

fp

八

44

株

281

均在

7

9

〜

2.

2,

合成的

7

组

dsWp

纯度

较髙

。

稀释至

87

25

全

/

r

L

的

5

组

dsWp

稀释液

,

人

26

株

231

值均在

3.

4

-3.4

,

浓度过低

，

达到仪器检

测最

，

进行

，

出现偏差

。

其余

7

组

dsWp

稀释

。

图

4,

图

7

在

2.2

~

3.

4

。

5

组体外合成

dsWp

可以作为

标

准

注:

D2000

：

分子质量标记(天根-,

其大小分别是

2

01

、

1

01

、

750

、

51

、

250

、

60

Note

:

D20

00

:

mcVecy/s

mass

marUce

(

Tiangex

-

of

4

,

000

,

1

,

000

,

750

,

500

,

250

,

60

注

：

a

：

5

组

dsWp

稀释至不同浓度检测

A260/A200

;

b

：

5

组

dsWp

稀释至不同浓度检测

A260/A037

Note

:

a

:

five

gpups

dsWp

di/teh

to

diSerex)

cncen/atioss

A260/

A

255

detection

；

b

:

five

gropps

dsWp

di/teh

to

dikerex)

cnces/atioss

A260/

A237

detection

Fig.

2

Analysis

oO

dsge

cancentration

and

pu

UI

oO

eve

grrups

synthesfee

in

vitrr

m/egstloz

ffl

©

*

」

u

:

a.

,

&

s

p

L

・

0

z

」

p

CA

z

n

*

E

尊

a

2

a

0

201-30CG201-50CG

423-50CG

423-70CG

a

b

and

L4440

eepression

图

4

体外合成

dge

7

5

%

琼脂糖凝胶电泳检测

Fig

・

4

Detection

dsge

7

5

%

agarrse

get

eUctrophoresis

•

1

000

ng/gL

■

500

ng/piL

▲

250

ng/p.L

•

1

000

ng/ptL

■

500

ng/p.L

▲

250

ng/|iL

▼

125

ng/gL

♦

62.5

ng/piL

▼

125

ng/gL

♦

62.5

ng/p.L

O

31.25

ng/p.L

0-

O

31.25

ng/gL

a

b

图

7

体外合成

7

组

dsge

浓度

、

纯度

4

期

常瑞等

：

4

种原核表达双链

RNA

的

dsRNA

提取方法效果评价

7

7

2.

3

4

种方法提取菌液

dsRNA

6.

2.

0

提

取基于

L4440

载体表达

dsFu

6.0.1

提

取基于

pET-2p

载体表达

dsFu

研究表明

,

根据提取

dsFu

核酸检测值

,

对

A264/A284

和

A264/A232

利用

SPSS

分别构建多重比

研究表明

,

根据提取

dsFu

核酸检测值

,

对

A262/

A

54

和

A262/

A

232

利用

SPSS

分别构建多重比

较模型

,

模型截距

(

F

=

16

2/6.

446,

P

=

2.

002

)(

F

=

526.

04

,

P

=

0.002

),

提取方法因素

(F

=

25

.

043,

P

=

2.

002

)

(F

=65

338,

P

=

2.

002

)

分别

较模型

,

模型

截

距

(

F

=

5

246.

017,

P=

2.

002

)

(

F

=

739.011

,

P

=

0.002

),

提取方法因素

(F

=

32.

320,

P=

2.

002

)

(F

=

24.

035,

P

=

2.

022

)

分别

达极显著水平

，

浓度因素分别达到显著

(

F

=

达极显著水平

,

浓度因素分别达到显著

(

F

=

2.

363,

P=

2

.

041

)

和不显著水平

(F

=2

.

227,

P

=

2.

955

)o

新复极差法显著性检验显示不同浓度

3.453,

P=0.021)

和不显著水平

(

F

=

2.

344,

P

=

2.

882

)

。

新复极差法显著性检验显示不同浓度

之间差异不显著

。

提取纯度最高的

Trizol

法和

酚

之间差异不显著

。

提取纯度最高的

Trizol

法和

酚

氯仿法

(

CK

为对照)

，

且这

两

者差异不显著

，

其次

75%

氯仿法

(

CK

为对照)

，

且这两者差异不显著

，

其次

是

75%

法

,

提取纯度最低的为

RNA

-

exy

提取液

。

图

6,

图

7

2.5

法

，

提取纯度最低的为

RNA

-

easy

提取液

。

图

6,

图

7

■

CK

1=1

Tri

1=1

Phe

a

Ale

a

rir

■

CK

口

Tri

pET-2p-gfp

L4440-gfp

pET-2p-gfp

L4440-gfp

a

b

注:数据后附不同字母者表示在

2.

05

水平上差异显著(邓肯氏新复极差法

)

；

CK

：

体外合成

；

Tri

：

Trizol

法;

Pho

：

酚氯仿法

；

Alc

：

75%

酒

精沉淀法

;RIR

:

RNA

-

小同提取液;

a

：

提取

pET-4p

和

L4447

表达/表

3

，

分别稀释至不同浓度检测

A260/A250

;

b

：

提取

pET

-

2p

和

L4447

表达

dsF

品分别稀释至不同浓度检测

A260/A239

Note

:

Those

with

diderent

letters

after

the

data

inddato

zigUVcant

diPerencos

at

Uo

2.05

level

(Duncat

new

multiple

range

method

)

；

CK

:

0-

vitro

syuthesis

;

Tri

:

Trizol

meUod

;

Phe

:

pPeuol

chloroform

mothod

;

Ale

:

75%

alcohol

precipitation

method

;

RIR

:

RNA

-

easy

extract

;

v

:

Ex

­

tract

pET

-

4p

and

L4447

to

express

dsFu

wd

dilute

to

diRereut

conceuUa

均

ns

to

detect

A

26

/z

7

A

28

/

；

b

:

ExUact

pET

-

4p

and

L4447

to

express

dr-

gp

and

dilute

to

diderent

conceuUa

均

ns

to

detect

A260/A

535

图

6

4

种方法提取

pET

-

2p

和

L4440

载体表达

dsyfu

纯度

Fig.

2

Purity

analysis

ot

pET

-2p

and

L444

0

vector

eapression

eatracten

by

four

methods

703

53

卷

注:

D2000

：

分子质量标记(天根-其大小分别是

2

10

、

、

10

、

750

、

51

、

250

、

60

；

a

：

酚氯仿法提取基于

pET2p

表达

d

S

Wu(

经

Dux

I

和

Rnase

A

消化

，

稀释至

500

排株)

；

：

酚氯仿法提取基于

L4449

表达

dxfp

(经

Duel

和

Rnase

A

消化

，

稀释至

500

排

/

r

L

)

eT/zl

法

提取基于

pET2p

表达

dsWp

(经

Dux

I

和

R

排均

A

消化

，

稀释至

500

排

/

r

L)

；

；

：TUzoi

法提取基于

L4449

表达

dyfu

(经

Dux

I

和

R

排均

A

消化,稀释至

500

排

/

)

r

L

Note

:

D2000

:

McOecy/r

mass

marUer

(

Tiangex

)

,

its

size

is

4,200

,

1,200

,

750

,

500

,

250

,

60

；

a

:

Phenol

-

chlorofoun

extraction

methoP

baseh on

pET2p

expression

dsgS

(

digeXeS

with

Dnase

I

and

Rnase

A

,

di/teh

to

500

ng/

r

L)

；

b

:

Phenol

-

chlorofoun

extraction

methoP

baseh

on

L4449

to

express

dsWp

(digeXeS

with

Dnase

I

and

Rnase

A

,

diluteh

to

500

ng/

r

L

)

；

c

:

T/zol

methoP

extracts

dsWp

baseh

on

pET2p

(digeXeS

with

Dnase

I

and

Rnase

A

,

diluteh

to

500

ng/

r

L

)

；

d

:

TUzoi

methoP

extracts

dsWp

baseh

on

L4440

(digeXeS

with

Dnase

I

and

Rnase

A

,

di/teh

to

500

ng/

r

L

)

图

7

酚氯仿法和

Trizei

法提取

50

mL

菌液表达

dsyfe

75

%

琼脂糖凝胶电泳

Fig.

2

Pheeoi

chloroform

method

and

Trizei

method

i

eatract

5

0

mL

bacteriai

solution

i

eepress

dsge

1.5

%

aaarose

get

qectrophoresis

2.5

4

种提取方法损失率

度

、

纯度最高

，

与体外合成的差异最小

，

计算提取

研究表明

2

种方法提取后的体外合成

dsWp

与提取前的体外合成

dsWp

浓度纯

明显差

（

P<

损失率分别为

07

49%

、

23.

38%

,75%

酒精沉淀

法和

RNA

-

essp

提取液提取的

dsWp

浓度

、

纯度

异

，

经

SPSS

软件分析

，

差异有统计

最低,与体外合成差异最大

,

计算提取损失

率

分别

为

32.

3%

、

37.62%

。

表

0

0.

05

）

。

其中

酚氯

仿法和

TUzoi

法提取的

dsWp

浓

表

0

9

种方法提取内标混合纯

dsyfe

浓度

、纯度

Table

0

Comparison

and

analysis

oi

the

canceetration

and

purith

oi

the

internai

standarU

miped

put

dsge

eaaadee

by

four

methods

外合成

Is

vitro

酚氯

法

Phenol

ChloroSmi

*

u

t

values

TUzoi

法

i

t

values

75%

法

RNA-eney

syy

thesis

T/zol

tau

*

75%

a/oPol

i

t

values

提

RNA-eney

extract

*

i

t

values

precipitation

*

676214±6229

浓度

（

排

/

r

L

）

A

200

y/

A

280

A260/A230

998.

72

±3.36

784.56

±5.27

39222

3280

15.96

760.77

±5.37

43290

3280

31.72

62320±622

70283

3260

17220

1.98

±0.24

4.35

±6.27

3

34

±00

1282±00

1218±00

1284±00

32334

41.99

1.35

±00

028±0207

"±00

6.34

0276±00

注:*表示在

0.

23

水平上差异显著

(配

对

T

检验-

Note

:

*

means

significant

diSeresce

at

the

0.

23

level

)

paUeh

T

test

)

4

期

常瑞等

：

种原核表达双链

RNA

的

dsRNA

提取方法效果评价

729

2

.

3

基于

pET

-2

P

、

L4440

产生

dsFu

产量

dsFu

浓度,具有显著差异

(P<0-45

)o

基于

pET

-

2P

和

L440

表达载体

1

mL

研究表明

，

基于

pET-

2P

载体表达

5

组不同

产

长度

、

不同

CG

含量的

PFu

浓度均高于基于

L4442

表达

5

组

1

生

3

6

~24.

39

R

y

、

5.

43

~22.

47

R

y

dsFu

。

图

3

、

CG

含

的

■

pET-2p

口

L4440

盘

.

30-1

5-

6

U

800-1

f"

600-

匸

Mb

400-

M

h

■

pET-2p

■

口

L4440

注

：

*

表示在

2.

05

水平上差异显著(配对

F

检验

)

；

v

：

酚氯仿法提取基于

pET-2p

和

L4447

表达

dsFu

浓度

；

：

基于

pET

-

4p

和

L4447

表达

dwl

产量

Note

:

*

means

WgU

小

ant

PRereuce

at

the

2.

05

level

(

paireb

T

test)

；

v

:

Phenol

chloroform

extraction

method

baseb

on

pET

-

4p

and

L4447

express

dsFu

conceuUatUn

；

b

：

Baseb

on

pET

-

4p

and

L444

2

express

dsFu

yield

Fig

・

2

Analysis

ot

the

concentration

and

yielU

ot

dsyfu

eatracten

from

1

mL

bacteriai

solution

by

phenoi

一

chlooUvm

method

uo

e

lueouooJli

/6U^*"

200-

图

3

酚氯仿法提取

1

mL

菌液

dsyfu

浓度及产量

3

讨论

邹晓蕾

、

Eb

每

以及

Tyagl

等

4/

-

10

］

均报道了提

取细菌总

RNA

的方法

，

主要包括

Trizol

法

，

酚

氯

提取

pET-2p

和

L440

表达的

dsFu,

检测核酸浓

度

，

发现

2

个载体表达的

428

-39CG

明显高于其

他

4

组

，

说明

pET

-2p

和

L440

均具有较强的表

达能力

。

通过浓度分析,根据提取损失率计算

1

mL

菌液

dsFu

产量

，

发现基于

pET

-

2p

产生的

5

仿法以及部分市售

RNA

快速提取试剂盒

。

其中

Trizol

法在细菌总

RNA

提取中使用较为普

遍

，

利

组

dsFu

产量均高于

L4440

产生的

5

组

dsFu

产

量

，

最高可达

24.

39

Rp/mL'

p

ET

-2p

可作为

dsFu

用异硫氧酸弧等物质迅速裂解细胞

，

同时抑制核

酸酶的活性

，

保持

RNA

的完整性,氯仿使

RNA

溶

的相对最优表达

2

。

相

，

从

蛋白等物质相分离,为提取细菌总

提取

、

纯化原核表达

dsRNA

对于真核生物来

说

，

难度更大

，

尚无成熟方法借鉴

［

24

］

,研究采用

4

RNA

的

首

选方法

43

］

。

苯酚

-

氯

提也是提取

细菌总

RNA

常用方法之一

，

利用酚反复抽提使蛋

白质变性

,

SDS

（

十二浣基磺酸钠

）

使细胞裂解

,

种常用提取细菌总

RNA

的方法

，

试图通过提取完

整纯净的总

RNA,

经

Rnasa

A

、

Dtse

I

消化得到

入

氯

仿分层

，

获得含总

RNA

的水相

49

］

。

市售总

RNA

提取试剂盒成本较高

、

使用次数有限

，

不适

纯净的

dsRNA

。

Trizol

法和酚氯仿提取细菌总

RNA,

经

Rnasa

I

消化后

，

稀释核酸检测

A

10/

A

10

4

A264/

A

432

，

均值分别为

5

77

4

5

83

和

用于大量提取检测

，

故未选用进行

。

表

明

，

以体外合成

PFu

为对照

CK,

通过使用

Trizol

法和酚

氯

法

高

提

细

总

RNA

,

Rnasa

A

与

Dnnsa

I

消化后

，

可得到较为纯净的

1.74

、

2.

1,

与体外合成

dsRNA

值差异最

、

。

但

1-3%

糖凝胶电泳检测后

，

稀释至不同浓度的

dsFu

条带均出现不同程度弥散

，

无法得到清晰电

dsFu,

损失率最低

。

RNA

-

eusp

提取液和

75%

酒

泳图

，

可能存在以下原因

：

原核诱导表达的

dsFu

脆弱

，

使用有机溶剂以及提取过程中反复高速离

心损伤

dsFu

；

核酸检测稀释时间过长

,dsFu

在自

法提

率明显低于前者,不适用于快速

1mL

提取细菌总

RNA

以及

dsFu

。

与前人的研究结果

基本一

。

酚

氯

法,分

然环境下发生降解

;

电泳液含有核酸酶

。

712

4

结论

通过

酚

氯仿法提取

2

种载体表达

dsF

品

检测

发现

随

着目的片段

CG

含

,

1

表达的

PFU

浓度及其产

渐降低

。

pET

-

2p

载体

表达能力高于

L4440

载体

,

uET-2p

可作为

dsFu

的相对最优表达载体

。

为

PFu

在不同环境

降解程

以及

产物分析提供了技术

支

。

参考文献

(

References

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3]

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，

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-

955

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GUO

Weuchao

:

Turxpu

,

XU

Jianjun

:

ot

aP

Potato

beetle

ibeuti-

fication

and

its

disUibution,

spread

and

harm

0-

Xinjiang

[

J

].

Xipioag

Agbcdtumi

Scie/es

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,

(5)

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656

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io

the

obso/iPu

cP

Ooas-

poP

g

amPo

adds

to the

potato

beetle

(

Leptiptarso

UeceuUa-

eats)

by

RNA

inf/ere/e

on

the

ipUd

-

Uke

sipnaPp

pahwop

[

D]

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Nanjing

:

Nanjing

Agricultural

University

,

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[3

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San

M

K

,

Scott

f

G.

The

next

xeneraCon

of

insecticides

:

dsRNA

ft

staple

as

a

foliar

-

aqplieU

insecticide

[

J]

.

Put

Manapexent

Seance,

2613,

74(4)

：

821

-805.

[4]

Terenius

0,

Papanicolaou

A

,

Garbut)

J

S.

c)

al.

RNA

—

素廿小种平

0-

Lepiboptem

:

an

overview

of

successful

and

uuuccessPl

stud

­

ies

and

implications

for

experimeutal

desigy

J

]

•

Joupal

of

tped

physdfgy,

2011,57(4)

：

231

-245.

[5

]

Burand

J

P

,

Hunter

W

B.

RNAi

:

Future

in

insect

[

J]

.

Joueol

g

InveXebetc

Pahofpy

,

225,112

：

68

-

74.

[6

]

Ivashuta

S

,

Zhang

Yji

:

Wiggins

BE,)

al.

Environ

mental

RNAi

in

herbivorous

insects

[

J

].

RNA

(

Neo

Yor0

,

N.

Y.

')

,

2013

:

41

(5)

：

840

-856.

[7

]

Z

-

Feng

Shi

:

Jia

Fu

,

Li

-

Li

Mu,

c)

al.

Two

Leptipta/o

uridine

dipPwpPaU

N

-

ace

均

—

ucosamine

pyropPospUoryl

a

scr

are

spe

­

cialized

for

chitin

syuthesis

in

larval

epidermal

cuticle

and

midgut

peritrophic

matox

[

J

].

Irged

BiocUeuiap

and

Molecular

Biolo­

gy

,466

,68.

J

]

Li

Xiaoxxc

:

Zhang

Mingy

an

,

Zhang

Hodgyu.

RNA

—

素廿小种平

of

four

veuer

in

adul)

Bmdocem

dopPP

by

feebing

their

dsRNAs

[J].

Pfb

0/2211,6(3)

：

1

-11.

[9]

Baum

J

A

,

Bogaeri

T

,

Clinton

W,et

al.

Control

of

coleopteray

in

­

sect

pesU

throuah

RNA

murcercuce

[

J

].

Nature

OdtecOrndgy

,

53

卷

2007,

(11)

：

1824-1846.

[12]

Koch

A,Kcpei

K

H.

Nex

wind

in

the

sails

:

improving

the

agro

­

nomic

value

of

crop

p

—

nU

throuah

RNA

、

-

mediaUd

xene

siPn-

cing[

J

].

Plant

BdPcOplopy

Jourual

,

226,12

(

7

)

：

821

-

831.

35

吴沛桥

，

巴晓革

，

胡海

，

等•绿色荧光蛋白

GFP

的研究进展及

应用

J].

生物医学工程研究

2029

28(1)

：

83

-86.

WU

Peiqivo

:

BA

Xiaogo,

HU

Hvi

:

et

al.

Research

progress

and

app/caCon

of

green

Juoresceut

protein

GFP

J

].

BdfeOaxl

E

p

gmeegp

Reseo/U

,2705,28(1)

：

83

-

86.

32]Juvder

BE,

Welch

J

,

Braiby

N

,3"

k.

CcwsOuc

均

n

and

use

of

a

Cuggpibm

sncPor

H16

so

—

Ulc

hyUrooeuase

promoter

(

P4H

)

fusion

to

Fu

(green

Juoresceut protein)

[J].

Peep,

226,4

(7)

：

X269.

[6

]

C

—

rk

Grznarova

P

,

Stansell

E

,

et

al.

A Mason

-

Pfizer

Monkey

Virus

Gag

-

GFP

Fusion

Vector

Allows

Visualization

of

Capsid

Transport

in

Live

Cells

and

Demonstrates

a

Role

for

MProtuPulcs

J].

Plus

O/

,

2013,

8.

[

6

]

邵美丽

，

郭瑞雪

，

韩秀英

，

等•趋磁细菌

RNA

提取方法的比较

研究

[

J]

.

安徽农业科学

265

,1

(5)

：

3680

-

5681,

5743.

SHAO

Meili

,

GUO

Ruixxc

,

HAN

Xiuying

,

e)

al.

Comparative

study

on