2024年4月9日发(作者：之春娇)

利用同工酶电泳分析种（属）间亲缘关系

POD和EST（酯酶）

1. 原理

1.1

同工酶（isozyme，isoenzyme）是指催化反应相同而结构及理化性质不同的一组酶，它

们几乎存在于所有生物中。同工酶作为一类蛋白质，广泛存在于生物的同一种属， 同一个

体的不同组织，同一组织或同一细胞中。根据同工酶来源和结构的不同，从遗传学的角度可

将它分为4类：①单基因决定的同工酶；②多基因决定的同工酶；③复等位基因决定的同工

酶；④修饰同工酶或次生同工酶。在生物进化过程中，同工酶是 为了适应细胞代谢的多方

面需求而产生的，其功能在生理上表现为对代谢的调节作用。在遗传上，当一种酶同时受几

个基因控制时，更容易适应环境 的变化，一个基因由于突变而无用时，其它基因的存在仍

然可以产生类似作用的同工酶，这有助于机体减小基因突变造成不利后果的影响广义。

1.2同工酶分析技术是通过电泳和组织化学方法进行特异性染色而把酶蛋白分子分离，

并将其位置和活性直接在染色区带以酶谱的形式标记出来的技术。同工酶是基因分子水

平的表现型，基因的微小变化都会引起同工酶的变化。因此可以从同工酶谱的变化揭示

种间的亲缘关系。同工酶分析技术已在植物系统学研究中广泛应用于研究植物间的亲缘

关系，并获得了较为准确的结果。

2. 同工酶分析技术

2.1同工酶分离方法同工酶分离方法主要有电泳法、层析法、酶学法和免疫学法等，其

中以电泳法应用最为广泛。其原理在于同工酶是功能相同但结构不同的一组酶，由于其

结构中氨基酸序列或组成有差异，致使同工酶在电泳时，其迁移率也存在差异_7 J。

2.2同工酶分离的常用电泳技术

2.2.1淀粉凝胶电泳法 这是最古老的电泳方法之一，其优点在于便宜，无化学毒性物质，

可以迅速筛分不同活性的酶，但其分辨率不高。

2.2.2聚丙烯酷胺凝胶电泳(PAGE)PAGE在分 离蛋白质和核酸上应用广泛。实践中采用

不连续电泳，即通过浓缩胶的收缩效其中聚丙烯酰胺凝胶电泳由于方法简单、分辨率较

高、同工酶不易失活而使用最为普遍。应和分离效应，将同工酶分成一条条狭窄的区带

2.2.3等电聚焦 利用同工酶的等电点不同，在电泳支持物中加入两性电解质载体，因电

场的作用，同工酶在PR梯度凝胶中泳动，当迁移至其等电点的PH处，则不再泳动，

而浓缩成狭窄的区带。这种方法分辨率很高，但该法得到的同工酶常失活。

2.2.4双向电泳 利用蛋白质或酶样品中不同组分等电点的差异，进行第一向分离；然后

纵向切割以垂直于第一向的方向进行第二向电泳，从而使不同分子量的蛋白质或酶样品

进一步分离。本法分辨率高于各种单向电泳，但同工酶易失活，特别是碱性同工酶的分

析，应采用其它技术方法。

2.3同工酶位点及酶系统的选择

同工酶是基因表达的产物。通过适当的酶系统可以准确识别染色体上的基因位点，从而在最

接近DNA的水平上来研究植物群体的变异。同工酶电泳方法克服了传统分析方法所固有的

弱点，排除了环境的干扰，使不同的物种及不同的研究可在同水平上进行比较。由于分析的

物种，所用的材料不同，分析及所利用的酶系统也存在差别。因此，初次研究某一树种时，

筛选并确定适宜的等位酶系统及位点是非常重要的基础工作。

2．4同工酶的染色方法

染色技术即同工酶的染色方法有原染色法、荧光染色法、放射染色法、电子传递染色法和酶

连锁染色法等，后三种较为常用，其中以电子传递染色法最常用。染色的原理是利用酶活性

的特异性，在染色液中加入底物和酶活性所需的因子，通过酶促反应生成有色物，显示酶带，

以便观察和记录结果。

2.5常用分析的同工酶

尽管可用来分析的同工酶有百余种，但过氧化物酶和脂酶是两种最常被用来分析的同工酶。

过氧化物酶在植物组织中广泛分布，参与多种生理活动，并且为生长发育提供了基因表达的

灵敏指标，是一种重要的遗传标记。脂酶则与植物体内各种酶类的水解息息相关。

2.6酶谱分析

根据迁移率R，值绘制同工酶酶谱及聚类分析；①计算酶谱的相似性系数：c=2w／( +b)，

其中，n为种A酶谱的酶带数，b为种B酶谱的酶带数。W为A，B两种的相同酶带数，②

计算不相似性系数值：d：z—f。③采用未加权配群法，即UPGMA法，进行聚类分析，根

据结果绘出树系图。④计算x值：Xi=(L+Da—Db)／2L。把不相似值总计最大的种酶谱定为

n，在x轴上标记为0，Xi为所求种酶沿 轴对种A酶谱的距离；L为种A的n与B的b之

间的不相似值，Da为种A的a与所求种酶之间的不相似值；Db为种B的b与所求种酶之

间的不相似值。经过计算得到各酶谱在x坐标轴上的排序，通过在轴上距离的远近，可以来

推测各分类群之间的亲缘关系。

3.材料与方法

3.1材料

3.2酶液提取

3.2.1 提取介质：50 mmol/L磷酸缓冲液（PBS，pH 7.0）（100ml=39ml A储备液+61ml

B储 备液，其中A储备液：0.2mol/L KH

2

PO

4

；

B储备液：0.2mol/L

K

2

H

PO

4

）

，含1

mmol/L EDTA，1％PVP（聚乙烯吡咯烷酮）。

3.2.2 提取步骤： 0.5 g叶片液氮研磨，待液氮挥发后，加入10 ml提取介质，研磨2 min，

4℃，15000 g离心20 min，上清液直接测定酶活性和同工酶谱分析或液氮速冻后－20℃保

存备用。

3.3电泳分析

3.3.1凝胶贮液及电极缓冲液的配制

以下各种试剂的配制方法：

30%Acr-Bis溶液：称取30 g Acr，0.8 g Bis用双蒸水定容至100 mL，充分溶解后，用

滤纸过滤装入棕色瓶，并置于4℃冰箱中保存。

Tris-HCl pH 8.9缓冲液：称取Tris 36.6 g，加入1mol/L HCl 48 mL，用浓HCl调至pH 8.9

后，再用双蒸水定容至100 mL，用时加入TEMED0.4 mL，于4℃保存。

Tris-HCl pH 6.7缓冲液：称取Tris 6.0 g，加入1mol/L HCl 48 mL，用浓HCl调至pH 6.7

后，再用双蒸水定容至100 mL，用时加入TEMED0.4 mL，于4℃保存。

电极缓冲液（Tris-Gly pH 8.3）：称取Tris 6.0 g，gly 28.8 g。用蒸馏水溶解并定容至1000

mL。用时稀释10倍。

10%过硫酸铵（W/V）：称取AP10 g，溶于100 mL双蒸水，用时现配。

溴酚蓝缓冲液：含0.25%溴酚蓝和40%的蔗糖。

醋酸联苯胺染液（母液）：2g 联苯胺溶于18 ml冰醋酸中，加72 ml ddH

2

O。用时取醋

酸联苯胺溶液5 m1加30% H

2

O

2

0.2 ml用94.8 ml ddH

2

O稀释

3.3.2 凝胶制备及电泳

电泳槽的安装：本实验使用DYY-Ⅲ型垂直板电泳槽，将配套的玻璃板与胶槽安装好，

并用1%琼脂封口。

分离胶：分离胶（7％，10％）成分见下表，按顺序取以下各种成分，加入小烧杯中，

混匀并缓缓倒入胶室，避免产生气泡，胶液加至距玻璃板顶部约3 cm处，然后将胶室垂直

放置，并用胶头滴管在分离胶上表面缓缓加入0.5 cm左右的水层。10-20 min后，可以看到

胶与水之间有一清晰的界面出现，此时分离胶已聚合，可以继续加入浓缩胶。

表 1 分离胶组成

Table 1 Composition of separation gel

试剂名称

30% Acr-Bis溶液（mL）

pH 8.9 Tris-HCl缓冲液（mL）

双蒸水 (mL)

10% AP (mL)

TEMED (mL)

分离胶（7%）

2.333

2.500

4.975

0.200

0.010

浓缩胶（10%）

3.333

2.500

3.975

0.200

0.010

浓缩胶：待分离胶凝聚后，用滤纸吸干水层，并配制浓缩胶。浓缩胶成分见下表，按以

下顺序在小烧杯中加入各种成分，混匀后倒入胶室，避免产生气泡，并立即插入样品梳。约

10min后，浓缩胶聚合。小心取下样品梳，并倒入电极缓冲液（负极缓冲液）。

表2 浓缩胶组成

Table 2 Composition of concentration gel

试剂名称 浓缩胶（4%） 浓缩胶（5%）

30% Acr-Bis溶液（mL）

pH 6.7 Tris-HCl缓冲液（mL）

双蒸水 (mL)

10% AP (mL)

TEMED (mL)

0.666

1.250

2.979

0.100

0.005

0.833

1.250

2.812

0.100

0.005

加样及电泳：取8μL酶液和2μL溴酚蓝缓冲液，混合均匀。点样。加样完毕后，将电

泳槽放置在4℃冰箱中，接通电源，调节电压至80 V，待指示剂（溴酚蓝）进入分离胶后，

稳压120 V电泳。

3.4.1 POD同工酶分析: 浓缩胶4％，分离胶7％。

步骤：将胶浸入醋酸联苯胺染色液中5-10 min，取出置蒸馏水中漂洗，终止染色

3.4.2

常见问题及分析

1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？

在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是

pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH

环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，

两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成

反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区

带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，

直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有

的带电性和分子大小进行分离。

所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很

好解决问题的情况，应首要考虑该因素，当然其他的因素也可以从多方面考虑。

2. 样品如何处理？

根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、

带有烷基化作用的还原SDS处理。

1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白

质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来

分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，

再离心加样。

2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固

的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理

现象。100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。

3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，

未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。

3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？

聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳

成功与否，与促凝剂及环境密切相关；

制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEMED

与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基磺

酸钠（SDS）：阴离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋

白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？

聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在

室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导

致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。

一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，

具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。

5.“ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？

主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。

处理办法：待其充分凝固再作后续实验。

6. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？

主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。

处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

7. 为什么带出现拖尾现象？

主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间

过长，重新配制；降低凝胶浓度。

8. 为什么带出现纹理现象？

主要是样品不溶性颗粒引起的。

处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。

9. 什么是“鬼带”，如何处理？

“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶

中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而

失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其

分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在

WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。

处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；

或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？

我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲

液和分离胶的浓度有关。

处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。

11. 为什么电泳的条带很粗？

电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。

处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；

12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？

这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于

电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底

部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。

处理办法：电泳槽正确装配即可。

13. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？

这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不

均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。

14. 凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？

通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。

APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。 如果凝的太快，可能是APS和

TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。

15. 电泳时间比正常要长？

可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物

质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。

16.分离胶加上后为什么要立即加水？

加入分离胶后，立即覆一层双蒸水，一是为了使分离胶界面保持水平，用水就可以把它

压平，使蛋白质分子跑时在同一水平线上；二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。

2024年4月9日发(作者：之春娇)

利用同工酶电泳分析种（属）间亲缘关系

POD和EST（酯酶）

1. 原理

1.1

同工酶（isozyme，isoenzyme）是指催化反应相同而结构及理化性质不同的一组酶，它

们几乎存在于所有生物中。同工酶作为一类蛋白质，广泛存在于生物的同一种属， 同一个

体的不同组织，同一组织或同一细胞中。根据同工酶来源和结构的不同，从遗传学的角度可

将它分为4类：①单基因决定的同工酶；②多基因决定的同工酶；③复等位基因决定的同工

酶；④修饰同工酶或次生同工酶。在生物进化过程中，同工酶是 为了适应细胞代谢的多方

面需求而产生的，其功能在生理上表现为对代谢的调节作用。在遗传上，当一种酶同时受几

个基因控制时，更容易适应环境 的变化，一个基因由于突变而无用时，其它基因的存在仍

然可以产生类似作用的同工酶，这有助于机体减小基因突变造成不利后果的影响广义。

1.2同工酶分析技术是通过电泳和组织化学方法进行特异性染色而把酶蛋白分子分离，

并将其位置和活性直接在染色区带以酶谱的形式标记出来的技术。同工酶是基因分子水

平的表现型，基因的微小变化都会引起同工酶的变化。因此可以从同工酶谱的变化揭示

种间的亲缘关系。同工酶分析技术已在植物系统学研究中广泛应用于研究植物间的亲缘

关系，并获得了较为准确的结果。

2. 同工酶分析技术

2.1同工酶分离方法同工酶分离方法主要有电泳法、层析法、酶学法和免疫学法等，其

中以电泳法应用最为广泛。其原理在于同工酶是功能相同但结构不同的一组酶，由于其

结构中氨基酸序列或组成有差异，致使同工酶在电泳时，其迁移率也存在差异_7 J。

2.2同工酶分离的常用电泳技术

2.2.1淀粉凝胶电泳法 这是最古老的电泳方法之一，其优点在于便宜，无化学毒性物质，

可以迅速筛分不同活性的酶，但其分辨率不高。

2.2.2聚丙烯酷胺凝胶电泳(PAGE)PAGE在分 离蛋白质和核酸上应用广泛。实践中采用

不连续电泳，即通过浓缩胶的收缩效其中聚丙烯酰胺凝胶电泳由于方法简单、分辨率较

高、同工酶不易失活而使用最为普遍。应和分离效应，将同工酶分成一条条狭窄的区带

2.2.3等电聚焦 利用同工酶的等电点不同，在电泳支持物中加入两性电解质载体，因电

场的作用，同工酶在PR梯度凝胶中泳动，当迁移至其等电点的PH处，则不再泳动，

而浓缩成狭窄的区带。这种方法分辨率很高，但该法得到的同工酶常失活。

2.2.4双向电泳 利用蛋白质或酶样品中不同组分等电点的差异，进行第一向分离；然后

纵向切割以垂直于第一向的方向进行第二向电泳，从而使不同分子量的蛋白质或酶样品

进一步分离。本法分辨率高于各种单向电泳，但同工酶易失活，特别是碱性同工酶的分

析，应采用其它技术方法。

2.3同工酶位点及酶系统的选择

同工酶是基因表达的产物。通过适当的酶系统可以准确识别染色体上的基因位点，从而在最

接近DNA的水平上来研究植物群体的变异。同工酶电泳方法克服了传统分析方法所固有的

弱点，排除了环境的干扰，使不同的物种及不同的研究可在同水平上进行比较。由于分析的

物种，所用的材料不同，分析及所利用的酶系统也存在差别。因此，初次研究某一树种时，

筛选并确定适宜的等位酶系统及位点是非常重要的基础工作。

2．4同工酶的染色方法

染色技术即同工酶的染色方法有原染色法、荧光染色法、放射染色法、电子传递染色法和酶

连锁染色法等，后三种较为常用，其中以电子传递染色法最常用。染色的原理是利用酶活性

的特异性，在染色液中加入底物和酶活性所需的因子，通过酶促反应生成有色物，显示酶带，

以便观察和记录结果。

2.5常用分析的同工酶

尽管可用来分析的同工酶有百余种，但过氧化物酶和脂酶是两种最常被用来分析的同工酶。

过氧化物酶在植物组织中广泛分布，参与多种生理活动，并且为生长发育提供了基因表达的

灵敏指标，是一种重要的遗传标记。脂酶则与植物体内各种酶类的水解息息相关。

2.6酶谱分析

根据迁移率R，值绘制同工酶酶谱及聚类分析；①计算酶谱的相似性系数：c=2w／( +b)，

其中，n为种A酶谱的酶带数，b为种B酶谱的酶带数。W为A，B两种的相同酶带数，②

计算不相似性系数值：d：z—f。③采用未加权配群法，即UPGMA法，进行聚类分析，根

据结果绘出树系图。④计算x值：Xi=(L+Da—Db)／2L。把不相似值总计最大的种酶谱定为

n，在x轴上标记为0，Xi为所求种酶沿 轴对种A酶谱的距离；L为种A的n与B的b之

间的不相似值，Da为种A的a与所求种酶之间的不相似值；Db为种B的b与所求种酶之

间的不相似值。经过计算得到各酶谱在x坐标轴上的排序，通过在轴上距离的远近，可以来

推测各分类群之间的亲缘关系。

3.材料与方法

3.1材料

3.2酶液提取

3.2.1 提取介质：50 mmol/L磷酸缓冲液（PBS，pH 7.0）（100ml=39ml A储备液+61ml

B储 备液，其中A储备液：0.2mol/L KH

2

PO

4

；

B储备液：0.2mol/L

K

2

H

PO

4

）

，含1

mmol/L EDTA，1％PVP（聚乙烯吡咯烷酮）。

3.2.2 提取步骤： 0.5 g叶片液氮研磨，待液氮挥发后，加入10 ml提取介质，研磨2 min，

4℃，15000 g离心20 min，上清液直接测定酶活性和同工酶谱分析或液氮速冻后－20℃保

存备用。

3.3电泳分析

3.3.1凝胶贮液及电极缓冲液的配制

以下各种试剂的配制方法：

30%Acr-Bis溶液：称取30 g Acr，0.8 g Bis用双蒸水定容至100 mL，充分溶解后，用

滤纸过滤装入棕色瓶，并置于4℃冰箱中保存。

Tris-HCl pH 8.9缓冲液：称取Tris 36.6 g，加入1mol/L HCl 48 mL，用浓HCl调至pH 8.9

后，再用双蒸水定容至100 mL，用时加入TEMED0.4 mL，于4℃保存。

Tris-HCl pH 6.7缓冲液：称取Tris 6.0 g，加入1mol/L HCl 48 mL，用浓HCl调至pH 6.7

后，再用双蒸水定容至100 mL，用时加入TEMED0.4 mL，于4℃保存。

电极缓冲液（Tris-Gly pH 8.3）：称取Tris 6.0 g，gly 28.8 g。用蒸馏水溶解并定容至1000

mL。用时稀释10倍。

10%过硫酸铵（W/V）：称取AP10 g，溶于100 mL双蒸水，用时现配。

溴酚蓝缓冲液：含0.25%溴酚蓝和40%的蔗糖。

醋酸联苯胺染液（母液）：2g 联苯胺溶于18 ml冰醋酸中，加72 ml ddH

2

O。用时取醋

酸联苯胺溶液5 m1加30% H

2

O

2

0.2 ml用94.8 ml ddH

2

O稀释

3.3.2 凝胶制备及电泳

电泳槽的安装：本实验使用DYY-Ⅲ型垂直板电泳槽，将配套的玻璃板与胶槽安装好，

并用1%琼脂封口。

分离胶：分离胶（7％，10％）成分见下表，按顺序取以下各种成分，加入小烧杯中，

混匀并缓缓倒入胶室，避免产生气泡，胶液加至距玻璃板顶部约3 cm处，然后将胶室垂直

放置，并用胶头滴管在分离胶上表面缓缓加入0.5 cm左右的水层。10-20 min后，可以看到

胶与水之间有一清晰的界面出现，此时分离胶已聚合，可以继续加入浓缩胶。

表 1 分离胶组成

Table 1 Composition of separation gel

试剂名称

30% Acr-Bis溶液（mL）

pH 8.9 Tris-HCl缓冲液（mL）

双蒸水 (mL)

10% AP (mL)

TEMED (mL)

分离胶（7%）

2.333

2.500

4.975

0.200

0.010

浓缩胶（10%）

3.333

2.500

3.975

0.200

0.010

浓缩胶：待分离胶凝聚后，用滤纸吸干水层，并配制浓缩胶。浓缩胶成分见下表，按以

下顺序在小烧杯中加入各种成分，混匀后倒入胶室，避免产生气泡，并立即插入样品梳。约

10min后，浓缩胶聚合。小心取下样品梳，并倒入电极缓冲液（负极缓冲液）。

表2 浓缩胶组成

Table 2 Composition of concentration gel

试剂名称 浓缩胶（4%） 浓缩胶（5%）

30% Acr-Bis溶液（mL）

pH 6.7 Tris-HCl缓冲液（mL）

双蒸水 (mL)

10% AP (mL)

TEMED (mL)

0.666

1.250

2.979

0.100

0.005

0.833

1.250

2.812

0.100

0.005

加样及电泳：取8μL酶液和2μL溴酚蓝缓冲液，混合均匀。点样。加样完毕后，将电

泳槽放置在4℃冰箱中，接通电源，调节电压至80 V，待指示剂（溴酚蓝）进入分离胶后，

稳压120 V电泳。

3.4.1 POD同工酶分析: 浓缩胶4％，分离胶7％。

步骤：将胶浸入醋酸联苯胺染色液中5-10 min，取出置蒸馏水中漂洗，终止染色

3.4.2

常见问题及分析

1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？

在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是

pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH

环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，

两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成

反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区

带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，

直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有

的带电性和分子大小进行分离。

所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很

好解决问题的情况，应首要考虑该因素，当然其他的因素也可以从多方面考虑。

2. 样品如何处理？

根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、

带有烷基化作用的还原SDS处理。

1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白

质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来

分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，

再离心加样。

2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固

的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理

现象。100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。

3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，

未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。

3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？

聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳

成功与否，与促凝剂及环境密切相关；

制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEMED

与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基磺

酸钠（SDS）：阴离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋

白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？

聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在

室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导

致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。

一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，

具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。

5.“ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？

主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。

处理办法：待其充分凝固再作后续实验。

6. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？

主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。

处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

7. 为什么带出现拖尾现象？

主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间

过长，重新配制；降低凝胶浓度。

8. 为什么带出现纹理现象？

主要是样品不溶性颗粒引起的。

处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。

9. 什么是“鬼带”，如何处理？

“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶

中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而

失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其

分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在

WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。

处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；

或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？

我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲

液和分离胶的浓度有关。

处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。

11. 为什么电泳的条带很粗？

电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。

处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；

12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？

这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于

电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底

部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。

处理办法：电泳槽正确装配即可。

13. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？

这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不

均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。

14. 凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？

通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。

APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。 如果凝的太快，可能是APS和

TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。

15. 电泳时间比正常要长？

可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物

质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。

16.分离胶加上后为什么要立即加水？

加入分离胶后，立即覆一层双蒸水，一是为了使分离胶界面保持水平，用水就可以把它

压平，使蛋白质分子跑时在同一水平线上；二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。