2024年4月12日发(作者：东童童)
华中农业大学动物医学院基础兽医系实验报告
实验五 大鼠肝S9的制备和蛋白含量测定
姓名：任妮 2
摘要：目的：研究有效的S9代谢活化酶系统的制备方法，掌握用考马斯亮蓝的方法测定蛋
白质的含量。方法：通过使用80mg/kg苯巴比妥钠对大鼠进行诱导（连续3～5d），停止给
药后24h采样（无菌取出肝脏），制备肝匀浆，9000g速度0～4℃低温环境下离心，取出上
清液（S9组分），最后加入考马斯亮蓝染色液，测定OD595nm值。通过不同浓度的标准蛋
白溶液来建立标准蛋白的标准曲线，根据肝S9组分的OD595nm值计算出样品中蛋白质浓
度。结果：本实验建立的标准曲线方程为y=0.0062x-0.045
，
相关系数为0.9887,相关性较
好。测得肝S9组分样品蛋白的浓度为25.04mg/ml。 结论：苯巴比妥钠作为诱导剂可以成
功制备出大鼠肝S9.
关键词：肝S9；蛋白质含量；考马斯亮蓝染色法（Bradford法）
前言：
许多致癌剂的生物转化是依赖细胞内微粒体混合功能氧化酶系来完成的.
大鼠肝S9是许多体外实验常用的体外活化系统,其主要有效成分为混合功能氧化
酶( MPO)系统,其中许多酶共同组成电子传递体系,其中细胞色素P450(CYP450)
在整个酶系中起着末端氧化酶作用,具有活化氧分子和与底物结合的双重功能。
CYP450在氧化活动和底物结合中的作用决定其在MPO系统中起决定作用,苯巴
比妥钠是目前大鼠肝S9常用的诱导剂,能诱导活化许多致癌性化学物所需要的细
胞色素。因此,本文采用苯巴比妥钠作为诱导剂,制备S9,并采用考马斯亮蓝法测定
所制备的S9的蛋白含量,进而研究有效的S9代谢活化酶系统制备方法和测定方
法。
蛋白质浓度的测定有许多方法，本次试验采用的是考马斯亮蓝染色法
（Bradford法），该方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮蓝染色法
原理：考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质（主要是碱性氨基酸，特
别是精氨酸和芳香族氨基酸残基）结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm
变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。染料在595nm下测定的吸光度
值A595,与蛋白质浓度成正比。
1 实验材料
1.1实验动物
1
华中农业大学动物医学院基础兽医系实验报告
大鼠：健康 雄性 成年 SD 或 Wistar 5~6 周 龄 150g左右
（由于实验条件限制，本次实验采用的是小鼠）
1.2实验器材
可见分光光度计，漩涡混合器，试管和试管架、低温高速离心机、洁净工作
台、匀浆器、注射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等。
1.3实验试剂
1.17% （0.15M） KCl
Tris-HCl缓冲液：6.05g Tris加约80ml蒸馏水溶解，用HCl溶液调pH值至
7.4，最后用蒸馏水定容至1000ml。
标准蛋白质溶液： 1mg/ml牛血清清蛋白（BSA）。
考马斯亮兰G-250染料试剂：称考马斯亮兰G-250 100mg，溶于50ml 95％
的乙醇后，再加入85％的磷酸120ml ，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。
2 实验方法及步骤
2.1大鼠肝S9的制备
2.1.1 诱导
1）苯巴比妥钠 80mg/kg， 腹腔注射，连 续3～5d，最后一次给药后24h
后采样。主要诱导P450。
2）戊巴比妥钠 80mg/kg，腹腔注射，连续3d，第4d采样。主要诱导P450。
3）多氯联苯（Aro-clor1254或国产PCB-五氯）。同时诱导P450和P448。
溶剂 玉米油 浓度 200mg/mL
剂量 500mg/kg 方式 腹腔注射 时间 3d
采样 第4d
4）β-萘黄酮 玉米油， 80mg/kg，腹腔注射连续3d，第4d采样。主要诱
导P448。
2.1.2 采样
采样前禁食24h，但可以自由饮水；
断头处死，放尽血液，迅速剖开胸、腹腔，取出肝脏，用冰冷1.17% KCl
2
2024年4月12日发(作者：东童童)
华中农业大学动物医学院基础兽医系实验报告
实验五 大鼠肝S9的制备和蛋白含量测定
姓名：任妮 2
摘要：目的：研究有效的S9代谢活化酶系统的制备方法，掌握用考马斯亮蓝的方法测定蛋
白质的含量。方法：通过使用80mg/kg苯巴比妥钠对大鼠进行诱导（连续3～5d），停止给
药后24h采样（无菌取出肝脏），制备肝匀浆，9000g速度0～4℃低温环境下离心，取出上
清液（S9组分），最后加入考马斯亮蓝染色液，测定OD595nm值。通过不同浓度的标准蛋
白溶液来建立标准蛋白的标准曲线，根据肝S9组分的OD595nm值计算出样品中蛋白质浓
度。结果：本实验建立的标准曲线方程为y=0.0062x-0.045
，
相关系数为0.9887,相关性较
好。测得肝S9组分样品蛋白的浓度为25.04mg/ml。 结论：苯巴比妥钠作为诱导剂可以成
功制备出大鼠肝S9.
关键词：肝S9；蛋白质含量；考马斯亮蓝染色法（Bradford法）
前言：
许多致癌剂的生物转化是依赖细胞内微粒体混合功能氧化酶系来完成的.
大鼠肝S9是许多体外实验常用的体外活化系统,其主要有效成分为混合功能氧化
酶( MPO)系统,其中许多酶共同组成电子传递体系,其中细胞色素P450(CYP450)
在整个酶系中起着末端氧化酶作用,具有活化氧分子和与底物结合的双重功能。
CYP450在氧化活动和底物结合中的作用决定其在MPO系统中起决定作用,苯巴
比妥钠是目前大鼠肝S9常用的诱导剂,能诱导活化许多致癌性化学物所需要的细
胞色素。因此,本文采用苯巴比妥钠作为诱导剂,制备S9,并采用考马斯亮蓝法测定
所制备的S9的蛋白含量,进而研究有效的S9代谢活化酶系统制备方法和测定方
法。
蛋白质浓度的测定有许多方法，本次试验采用的是考马斯亮蓝染色法
（Bradford法），该方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮蓝染色法
原理：考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质（主要是碱性氨基酸，特
别是精氨酸和芳香族氨基酸残基）结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm
变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。染料在595nm下测定的吸光度
值A595,与蛋白质浓度成正比。
1 实验材料
1.1实验动物
1
华中农业大学动物医学院基础兽医系实验报告
大鼠：健康 雄性 成年 SD 或 Wistar 5~6 周 龄 150g左右
（由于实验条件限制，本次实验采用的是小鼠）
1.2实验器材
可见分光光度计，漩涡混合器，试管和试管架、低温高速离心机、洁净工作
台、匀浆器、注射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等。
1.3实验试剂
1.17% （0.15M） KCl
Tris-HCl缓冲液：6.05g Tris加约80ml蒸馏水溶解，用HCl溶液调pH值至
7.4，最后用蒸馏水定容至1000ml。
标准蛋白质溶液： 1mg/ml牛血清清蛋白（BSA）。
考马斯亮兰G-250染料试剂：称考马斯亮兰G-250 100mg，溶于50ml 95％
的乙醇后，再加入85％的磷酸120ml ，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。
2 实验方法及步骤
2.1大鼠肝S9的制备
2.1.1 诱导
1）苯巴比妥钠 80mg/kg， 腹腔注射，连 续3～5d，最后一次给药后24h
后采样。主要诱导P450。
2）戊巴比妥钠 80mg/kg，腹腔注射，连续3d，第4d采样。主要诱导P450。
3）多氯联苯（Aro-clor1254或国产PCB-五氯）。同时诱导P450和P448。
溶剂 玉米油 浓度 200mg/mL
剂量 500mg/kg 方式 腹腔注射 时间 3d
采样 第4d
4）β-萘黄酮 玉米油， 80mg/kg，腹腔注射连续3d，第4d采样。主要诱
导P448。
2.1.2 采样
采样前禁食24h，但可以自由饮水；
断头处死，放尽血液，迅速剖开胸、腹腔，取出肝脏，用冰冷1.17% KCl
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