2024年4月12日发(作者：国英发)
肝微粒体和肝S9转化藜芦酸葡萄糖酯比较研究
乔姗姗;郑时奇;方明月;师朵芝;李德利;王腾宇;王如峰
【摘 要】Objective To compare the difference of transformation profile and
transformation rate of tecomin by using two in vitro liver metabolism
models. Methods Liver microsomes and liver S9 fraction models were
employed to transform tecomin. HPLC was used to determine the contents
of tecomin and its metabolites at the detecting wavelength of 254 nm. The
gradient elution (0–6 min, 5％–40％ A; 6–9 min, 40％–50％ A; 9–11 min, 50％
–5％ A) was carried out by using mobile phase of acetonitrile (A) - 1％
acetic acid (B) at a flow rate of 1 mL/min. Results Both models could
transform tecomin into veratric acid; however, the metabolites obtained
with liver S9 were more than those obtained with liver microsomes, and
the transformation rate of the former was higher than that of the latter.
Conclusion The liver S9 fraction can more efficiently transform esters than
liver microsomes.%目的 比较2种体外肝代谢模型转化藜芦酸葡萄糖酯的转化样
式和转化率差异.方法 通过大鼠肝微粒体和肝S9体外转化模型对藜芦酸葡萄糖酯
进行生物转化,采用HPLC检测转化底物及产物的含量,检测波长254 nm,流动相为
乙腈(A)-1％乙酸溶液(B),梯度洗脱(0～6 min,5％～40％A;6～9 min,40％～50％
A;9～11 min,50％～5％A),流速1.0 mL/min.结果 2种模型均可将藜芦酸葡萄糖
酯转化为藜芦酸,但应用肝S9模型得到的代谢产物多于肝微粒体模型,且肝S9模型
对酯类的转化率高于肝微粒体模型.结论 肝S9模型对酯类的转化能力高于肝微粒
体模型.
【期刊名称】《中国中医药信息杂志》
【年(卷),期】2017(024)012
【总页数】4页(P60-63)
【关键词】藜芦酸葡萄糖酯;藜芦酸;肝微粒体;肝S9
【作 者】乔姗姗;郑时奇;方明月;师朵芝;李德利;王腾宇;王如峰
【作者单位】北京中医药大学生命科学学院,北京 100102;北京中医药大学生命科
学学院,北京 100102;北京中医药大学生命科学学院,北京 100102;北京中医药大学
生命科学学院,北京 100102;北京中医药大学生命科学学院,北京 100102;北京中医
药大学生命科学学院,北京 100102;北京中医药大学生命科学学院,北京 100102
【正文语种】中 文
【中图分类】R285.6
肝脏是药物代谢的重要器官，是机体进行生物转化的主要场所。以肝脏为基础
的体外代谢模型以其特有的优势在药物代谢研究中得到广泛应用。肝微粒体和肝
S9是2种常用的模拟药物肝代谢的体外模型。肝S9是将肝组织匀浆后，经9000
r/min离心所得的上清液，可在肝微粒体的早期制备阶段获得，含有微粒体和胞质
分数，含有生物转化Ⅰ相反应所需的CYP450酶类和Ⅱ相代谢酶（如葡萄糖酸转
移酶、甲基转移酶、硫酸转移酶、乙酰基转移酶等）和其他的一些氧化酶和脱氢酶，
如负责酒精代谢的乙醛脱氢酶等[1-2]。与肝S9不同，肝微粒体只含有内质网亚细
胞分数，包括负责药物代谢的CYP450酶和极少量的Ⅱ相代谢酶[3-4]。既然二者
所含的代谢酶存在差异，它们对药物的代谢是否存在差异值得关注。藜芦酸葡萄糖
酯是本课题组从金莲花Flos Trollii中首次分离出的一种酚酸类化合物（见图1），
前期研究已经显示其可在肝内代谢，具有抗炎和抑菌活性，被视为金莲花的抗炎和
抑菌有效成分之一[5-7]。从分子结构来看，藜芦酸葡萄糖酯是由藜芦酸的羧基和
葡萄糖C1位的羟基脱水形成的糖酯类化合物[8]。前期研究表明，藜芦酸葡萄糖
酯在体内可被代谢为藜芦酸，并推测其主要代谢器官为肝脏[9-10]。因此，本研究
以藜芦酸葡萄糖酯为底物对这2种模型的代谢样式和代谢速率进行比较，为选择
合适可行的体外肝代谢模型提供依据。
SPF级雄性SD大鼠10只，8周龄，体质量（200±10）g，斯贝福（北京）实
验动物科技有限公司，动物许可证号SCXK（京）2011-0004，常规饲养于北京中
医药大学生物制药实验室动物房。
Waters Breeze 1525型液相色谱仪（包括Waters 1525二元溶剂输液泵、
Waters 2489紫外检测器、Waters breeze 2色谱工作站），美国Waters公司；
Phenomenex色谱柱（250 mm×4.6 mm，4 µm），美国Phenomenex公司；
TU-1901型紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；T10 basic型匀
浆器，德国IKA公司；电热恒温振荡水槽，金坛市华立实验仪器厂；CP100WX
型超速离心机，日本株式会社日立制作所；漩涡混匀仪，海门市气林贝雨仪器厂；
高速低温离心机，美国Kendro仪器公司；氮气吹干仪，北京市优晟联合科技有限
公司；pH计，徐州亚名仪器仪表有限公司；AE240十万分之一电子天平，瑞士
Mettler公司。
氧化型辅酶Ⅱ（NADP）、还原性辅酶Ⅰ（NADH）、葡萄糖-6-磷酸（G-6-
P）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PDH），Sigma公司；DL-硫酸苏糖醇
（DTT），北京拜尔迪生物技术有限公司；氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯
化镁、乙二胺四乙酸二钠，北京高华伟业食品添加剂有限公司；分析纯乙腈、甲醇、
乙酸乙酯，北京东方飞思科技发展有限公司；色谱纯乙腈、甲醇，美国Fisher公
司；Folin-酚试剂盒，北京鼎国昌盛生物技术有限公司；苯巴比妥钠注射液，中国
中医科学院望京医院；藜芦酸葡萄糖酯和藜芦酸均由本实验室从金莲花中分离得到，
按照面积归一化法测得其纯度不低于98%。
采用一次离心法制备大鼠肝S9，二次离心法制备大鼠肝微粒体。大鼠在动物房
适应1周后，腹腔注射苯巴比妥钠注射液（80 mg/kg），连续3 d，诱导肝酶产
生。大鼠禁食不禁水12 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉处死，迅速打开腹腔，
从肝门静脉注射冰冷生理盐水，清除肝内残留血液，取出肝脏，用冰冷生理盐水洗
净，去除肝脏表面血液，滤纸吸干液体，称重。将肝脏剪成小块后，按1∶3比例
加入50 mmol/L磷酸盐缓冲液，用电动匀浆机匀浆，将匀浆液于4 ℃、9000×g
离心30 min，弃去上层脂质和下层沉淀后的清液即为制得的肝S9，分装，于-80 ℃
冰箱贮存备用。将匀浆液在4 ℃、12 500×g离心15 min，取弃去上层脂质和下
层沉淀后的清液，再于105 000×g离心70 min，沉淀部分即肝微粒体，将肝微
粒体重悬浮于磷酸盐缓冲液（20%甘油、50 mmol/L KH2PO4-K2HPO4、0.1
mmol/L EDTA，pH 7.4）中，分装，于-80 ℃冰箱贮存备用。
采用Folin-酚试剂盒测定肝S9、肝微粒体的蛋白浓度。按照Lowry法[11]，采
用牛血清白蛋白标准工作液（BSA）进行测定，将蛋白含量对紫外可见吸收值
（OD）作图，得到标准曲线，OD＝2.019 41C＋0.089 82，r＝0.999 8，表明在
0～0.25 mg/mL范围内线性关系良好。最后测定肝S9蛋白浓度为20.92 mg/mL，
肝微粒体蛋白浓度为28.13 mg/mL。
精密量取藜芦酸葡萄糖酯适量，溶于磷酸盐缓冲液中备用。将配制好的酶系
（NADPH再生系统，包括2.0 mmol/L NADP、1.0 mmol/L NADH、20
mmol/L G-6-P、2.0 IU/mL G-6-PDH、8.0 mmol/L MgCl2）、肝微粒体（蛋白
浓度8.0 mg/mL）、肝S9（蛋白浓度8.0 mg/mL）定量加入各反应组中，摇匀
后，37 ℃水浴温孵5 min，再定量加入藜芦酸葡萄糖酯开始反应，实验体系见表
1。120 min后加入等量冰冻的乙酸乙酯终止反应，14 800 r/min离心10 min，
取上清液，加入等量乙酸乙酯萃取3次，氮气吹干，以500 µL甲醇复溶，0.45
µm微孔滤膜过滤后，HPLC分析。
2.4.1 色谱条件 Phenomenex色谱柱（250 mm×4.6 mm，4 µm），有预柱；
流动相为乙腈（A）-1%乙酸溶液（B），梯度洗脱（0～6 min，5%～40%A；
6～9 min，40%～50%A；9～11 min，50%～5%A）；流速1.0 mL/min，检测
波长254 nm，柱温35 ℃，进样量10 µL。结果藜芦酸葡萄糖酯与藜芦酸的峰形
良好，分离完全，无杂质峰干扰，空白肝微粒体、肝S9对测定无干扰，专属性强，
见图2。
2.4.2 系统适用性试验 测定结果显示，藜芦酸葡萄糖酯和藜芦酸的保留时间分别
为7.702、9.803 min，理论塔板数分别为26 292、50 607，拖尾因子分别为
0.95、1.01，检测限（LOD）分别为0.06、0.03 ng，定量限（LOQ）分别为
0.19、0.10 ng。以上数据表明上述条件适用于2种化合物的分析。
2.4.3 方法学考察
2.4.3.1 线性关系考察 精密称取藜芦酸葡萄糖酯6.40 mg和藜芦酸3.30 mg，置
于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，为对照品贮备液。分别精
密吸取对照品贮备液0.125、0.25、0.5、1、1.25、1.75、2、2.5 mL置于5 mL
容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，配制成8个不同浓度的对照品溶液。分别进样
测定，以藜芦酸葡萄糖酯和藜芦酸的峰面积对其各自浓度进行线性回归，求得标准
曲线回归方程。藜芦酸葡萄糖酯Y＝722 359X－1806.3（r＝0.999 2），线性范
围0.016～0.32 mg/mL；藜芦酸Y＝2 372 949X＋1061.8（r＝0.999 3），线性
范围0.008 25～0.165 mg/mL。
2.4.3.2 精密度和准确度试验 配制3个不同浓度的藜芦酸葡萄糖酯和藜芦酸的混
合对照品溶液。按“2.4.1”项下色谱条件，在同一日内分别将各浓度的同一样品
连续进样6次。根据标准曲线，按照色谱峰的峰面积求得样品中藜芦酸葡萄糖酯
和藜芦酸的浓度，并计算3个浓度各连续6次进样的RSD和RE，结果表明本方
法的日内精密度和准确度良好。然后，分别将各浓度的同一样品每日连续进样2
次，连续进样3 d，同法求得样品中藜芦酸葡萄糖酯和藜芦酸的浓度，并计算3个
浓度各6次进样的RSD，结果表明本方法的日间精密度良好。见表2。
2.4.3.3 重复性和稳定性试验 用空白温孵体系（肝S9）配制3个不同浓度的藜芦
酸葡萄糖酯和藜芦酸溶液，每个浓度6份，按“2.3”项下方法除去蛋白，得到供
试品溶液。分别进样，根据标准曲线，按照色谱峰的面积求得样品中藜芦酸葡萄糖
酯和藜芦酸的浓度，并计算3个浓度各6份样品的RSD，结果表明重复性良好。
用空白温孵体系配制3个不同浓度的藜芦酸葡萄糖酯和藜芦酸溶液，每个浓度3
份，按“2.3”项下方法除去蛋白，得到供试品溶液。分别在室温下放置0、4、8
h及-20 ℃放置4、7、10 d进样，根据标准曲线，按照色谱峰的面积求得样品中
藜芦酸葡萄糖酯和藜芦酸的浓度，并分别计算短期和长期稳定性的RSD，结果表
明样品的短期和长期稳定性良好。见表2。
2.4.3.4 绝对回收率试验 制备低、中、高浓度的大鼠肝微粒体、肝S9温孵样品
（含藜芦酸葡萄糖酯和藜芦酸），按“2.3”项下方法除去蛋白，以相同浓度的藜
芦酸葡萄糖酯和藜芦酸所得色谱峰面积为对照，二者的平均回收率（n＝3）分别
为91.23%、87.61%。
2.4.4 定性和定量分析 由图2可知，肝微粒体和肝S9均可将藜芦酸葡萄糖酯转
化为藜芦酸，但是，通过对底物藜芦酸葡萄糖酯和代谢产物藜芦酸的定量分析可知，
在相同的作用条件下，肝S9转化模型对藜芦酸葡萄糖酯的转化效率高于肝微粒体
模型。结果见表3。
肝微粒体和肝S9是研究药物肝代谢的常用模型，这2种模型由于制备方法不同，
导致其所含的酶系有所差异。相对而言，肝S9所含酶的种类，特别是Ⅱ相代谢酶
要多于肝微粒体，由此可能造成肝S9模型催化的Ⅱ相代谢多于肝微粒体。已有研
究表明，肝S9是一种稳定、可靠、低成本的体外肝代谢模型[11-14]。本研究发
现，肝S9导致的藜芦酸葡萄糖酯的代谢产物多于肝微粒体（见图2），在高极性
区，肝S9的代谢产物比肝微粒体的代谢产物明显多2个峰（6.05、6.85 min），
其极性大于藜芦酸葡萄糖酯，推测可能是Ⅱ相代谢产物。在相同蛋白浓度条件下，
肝S9对藜芦酸葡萄糖酯的转化率明显高于肝微粒体，说明肝S9对酯类化合物的
转化明显强于肝微粒体，并且随着底物浓度的增加，肝微粒体对藜芦酸葡萄糖酯的
转化率明显降低，但肝S9的转化率始终大于50%（见表3）。因此，与肝微粒体
模型比较，肝S9模型是一种制备简单、快速、低成本、转化率高、酶系丰富的体
外肝代谢模型。
[1] 李素梅,张可煜,王霄旸,等.抗球虫新药纳川珠利在大鼠肝S9中的代谢稳定性研
究[J].动物医学进展,2012,33(12)：95-98.
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2024年4月12日发(作者：国英发)
肝微粒体和肝S9转化藜芦酸葡萄糖酯比较研究
乔姗姗;郑时奇;方明月;师朵芝;李德利;王腾宇;王如峰
【摘 要】Objective To compare the difference of transformation profile and
transformation rate of tecomin by using two in vitro liver metabolism
models. Methods Liver microsomes and liver S9 fraction models were
employed to transform tecomin. HPLC was used to determine the contents
of tecomin and its metabolites at the detecting wavelength of 254 nm. The
gradient elution (0–6 min, 5％–40％ A; 6–9 min, 40％–50％ A; 9–11 min, 50％
–5％ A) was carried out by using mobile phase of acetonitrile (A) - 1％
acetic acid (B) at a flow rate of 1 mL/min. Results Both models could
transform tecomin into veratric acid; however, the metabolites obtained
with liver S9 were more than those obtained with liver microsomes, and
the transformation rate of the former was higher than that of the latter.
Conclusion The liver S9 fraction can more efficiently transform esters than
liver microsomes.%目的 比较2种体外肝代谢模型转化藜芦酸葡萄糖酯的转化样
式和转化率差异.方法 通过大鼠肝微粒体和肝S9体外转化模型对藜芦酸葡萄糖酯
进行生物转化,采用HPLC检测转化底物及产物的含量,检测波长254 nm,流动相为
乙腈(A)-1％乙酸溶液(B),梯度洗脱(0～6 min,5％～40％A;6～9 min,40％～50％
A;9～11 min,50％～5％A),流速1.0 mL/min.结果 2种模型均可将藜芦酸葡萄糖
酯转化为藜芦酸,但应用肝S9模型得到的代谢产物多于肝微粒体模型,且肝S9模型
对酯类的转化率高于肝微粒体模型.结论 肝S9模型对酯类的转化能力高于肝微粒
体模型.
【期刊名称】《中国中医药信息杂志》
【年(卷),期】2017(024)012
【总页数】4页(P60-63)
【关键词】藜芦酸葡萄糖酯;藜芦酸;肝微粒体;肝S9
【作 者】乔姗姗;郑时奇;方明月;师朵芝;李德利;王腾宇;王如峰
【作者单位】北京中医药大学生命科学学院,北京 100102;北京中医药大学生命科
学学院,北京 100102;北京中医药大学生命科学学院,北京 100102;北京中医药大学
生命科学学院,北京 100102;北京中医药大学生命科学学院,北京 100102;北京中医
药大学生命科学学院,北京 100102;北京中医药大学生命科学学院,北京 100102
【正文语种】中 文
【中图分类】R285.6
肝脏是药物代谢的重要器官，是机体进行生物转化的主要场所。以肝脏为基础
的体外代谢模型以其特有的优势在药物代谢研究中得到广泛应用。肝微粒体和肝
S9是2种常用的模拟药物肝代谢的体外模型。肝S9是将肝组织匀浆后，经9000
r/min离心所得的上清液，可在肝微粒体的早期制备阶段获得，含有微粒体和胞质
分数，含有生物转化Ⅰ相反应所需的CYP450酶类和Ⅱ相代谢酶（如葡萄糖酸转
移酶、甲基转移酶、硫酸转移酶、乙酰基转移酶等）和其他的一些氧化酶和脱氢酶，
如负责酒精代谢的乙醛脱氢酶等[1-2]。与肝S9不同，肝微粒体只含有内质网亚细
胞分数，包括负责药物代谢的CYP450酶和极少量的Ⅱ相代谢酶[3-4]。既然二者
所含的代谢酶存在差异，它们对药物的代谢是否存在差异值得关注。藜芦酸葡萄糖
酯是本课题组从金莲花Flos Trollii中首次分离出的一种酚酸类化合物（见图1），
前期研究已经显示其可在肝内代谢，具有抗炎和抑菌活性，被视为金莲花的抗炎和
抑菌有效成分之一[5-7]。从分子结构来看，藜芦酸葡萄糖酯是由藜芦酸的羧基和
葡萄糖C1位的羟基脱水形成的糖酯类化合物[8]。前期研究表明，藜芦酸葡萄糖
酯在体内可被代谢为藜芦酸，并推测其主要代谢器官为肝脏[9-10]。因此，本研究
以藜芦酸葡萄糖酯为底物对这2种模型的代谢样式和代谢速率进行比较，为选择
合适可行的体外肝代谢模型提供依据。
SPF级雄性SD大鼠10只，8周龄，体质量（200±10）g，斯贝福（北京）实
验动物科技有限公司，动物许可证号SCXK（京）2011-0004，常规饲养于北京中
医药大学生物制药实验室动物房。
Waters Breeze 1525型液相色谱仪（包括Waters 1525二元溶剂输液泵、
Waters 2489紫外检测器、Waters breeze 2色谱工作站），美国Waters公司；
Phenomenex色谱柱（250 mm×4.6 mm，4 µm），美国Phenomenex公司；
TU-1901型紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；T10 basic型匀
浆器，德国IKA公司；电热恒温振荡水槽，金坛市华立实验仪器厂；CP100WX
型超速离心机，日本株式会社日立制作所；漩涡混匀仪，海门市气林贝雨仪器厂；
高速低温离心机，美国Kendro仪器公司；氮气吹干仪，北京市优晟联合科技有限
公司；pH计，徐州亚名仪器仪表有限公司；AE240十万分之一电子天平，瑞士
Mettler公司。
氧化型辅酶Ⅱ（NADP）、还原性辅酶Ⅰ（NADH）、葡萄糖-6-磷酸（G-6-
P）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PDH），Sigma公司；DL-硫酸苏糖醇
（DTT），北京拜尔迪生物技术有限公司；氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯
化镁、乙二胺四乙酸二钠，北京高华伟业食品添加剂有限公司；分析纯乙腈、甲醇、
乙酸乙酯，北京东方飞思科技发展有限公司；色谱纯乙腈、甲醇，美国Fisher公
司；Folin-酚试剂盒，北京鼎国昌盛生物技术有限公司；苯巴比妥钠注射液，中国
中医科学院望京医院；藜芦酸葡萄糖酯和藜芦酸均由本实验室从金莲花中分离得到，
按照面积归一化法测得其纯度不低于98%。
采用一次离心法制备大鼠肝S9，二次离心法制备大鼠肝微粒体。大鼠在动物房
适应1周后，腹腔注射苯巴比妥钠注射液（80 mg/kg），连续3 d，诱导肝酶产
生。大鼠禁食不禁水12 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉处死，迅速打开腹腔，
从肝门静脉注射冰冷生理盐水，清除肝内残留血液，取出肝脏，用冰冷生理盐水洗
净，去除肝脏表面血液，滤纸吸干液体，称重。将肝脏剪成小块后，按1∶3比例
加入50 mmol/L磷酸盐缓冲液，用电动匀浆机匀浆，将匀浆液于4 ℃、9000×g
离心30 min，弃去上层脂质和下层沉淀后的清液即为制得的肝S9，分装，于-80 ℃
冰箱贮存备用。将匀浆液在4 ℃、12 500×g离心15 min，取弃去上层脂质和下
层沉淀后的清液，再于105 000×g离心70 min，沉淀部分即肝微粒体，将肝微
粒体重悬浮于磷酸盐缓冲液（20%甘油、50 mmol/L KH2PO4-K2HPO4、0.1
mmol/L EDTA，pH 7.4）中，分装，于-80 ℃冰箱贮存备用。
采用Folin-酚试剂盒测定肝S9、肝微粒体的蛋白浓度。按照Lowry法[11]，采
用牛血清白蛋白标准工作液（BSA）进行测定，将蛋白含量对紫外可见吸收值
（OD）作图，得到标准曲线，OD＝2.019 41C＋0.089 82，r＝0.999 8，表明在
0～0.25 mg/mL范围内线性关系良好。最后测定肝S9蛋白浓度为20.92 mg/mL，
肝微粒体蛋白浓度为28.13 mg/mL。
精密量取藜芦酸葡萄糖酯适量，溶于磷酸盐缓冲液中备用。将配制好的酶系
（NADPH再生系统，包括2.0 mmol/L NADP、1.0 mmol/L NADH、20
mmol/L G-6-P、2.0 IU/mL G-6-PDH、8.0 mmol/L MgCl2）、肝微粒体（蛋白
浓度8.0 mg/mL）、肝S9（蛋白浓度8.0 mg/mL）定量加入各反应组中，摇匀
后，37 ℃水浴温孵5 min，再定量加入藜芦酸葡萄糖酯开始反应，实验体系见表
1。120 min后加入等量冰冻的乙酸乙酯终止反应，14 800 r/min离心10 min，
取上清液，加入等量乙酸乙酯萃取3次，氮气吹干，以500 µL甲醇复溶，0.45
µm微孔滤膜过滤后，HPLC分析。
2.4.1 色谱条件 Phenomenex色谱柱（250 mm×4.6 mm，4 µm），有预柱；
流动相为乙腈（A）-1%乙酸溶液（B），梯度洗脱（0～6 min，5%～40%A；
6～9 min，40%～50%A；9～11 min，50%～5%A）；流速1.0 mL/min，检测
波长254 nm，柱温35 ℃，进样量10 µL。结果藜芦酸葡萄糖酯与藜芦酸的峰形
良好，分离完全，无杂质峰干扰，空白肝微粒体、肝S9对测定无干扰，专属性强，
见图2。
2.4.2 系统适用性试验 测定结果显示，藜芦酸葡萄糖酯和藜芦酸的保留时间分别
为7.702、9.803 min，理论塔板数分别为26 292、50 607，拖尾因子分别为
0.95、1.01，检测限（LOD）分别为0.06、0.03 ng，定量限（LOQ）分别为
0.19、0.10 ng。以上数据表明上述条件适用于2种化合物的分析。
2.4.3 方法学考察
2.4.3.1 线性关系考察 精密称取藜芦酸葡萄糖酯6.40 mg和藜芦酸3.30 mg，置
于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，为对照品贮备液。分别精
密吸取对照品贮备液0.125、0.25、0.5、1、1.25、1.75、2、2.5 mL置于5 mL
容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，配制成8个不同浓度的对照品溶液。分别进样
测定，以藜芦酸葡萄糖酯和藜芦酸的峰面积对其各自浓度进行线性回归，求得标准
曲线回归方程。藜芦酸葡萄糖酯Y＝722 359X－1806.3（r＝0.999 2），线性范
围0.016～0.32 mg/mL；藜芦酸Y＝2 372 949X＋1061.8（r＝0.999 3），线性
范围0.008 25～0.165 mg/mL。
2.4.3.2 精密度和准确度试验 配制3个不同浓度的藜芦酸葡萄糖酯和藜芦酸的混
合对照品溶液。按“2.4.1”项下色谱条件，在同一日内分别将各浓度的同一样品
连续进样6次。根据标准曲线，按照色谱峰的峰面积求得样品中藜芦酸葡萄糖酯
和藜芦酸的浓度，并计算3个浓度各连续6次进样的RSD和RE，结果表明本方
法的日内精密度和准确度良好。然后，分别将各浓度的同一样品每日连续进样2
次，连续进样3 d，同法求得样品中藜芦酸葡萄糖酯和藜芦酸的浓度，并计算3个
浓度各6次进样的RSD，结果表明本方法的日间精密度良好。见表2。
2.4.3.3 重复性和稳定性试验 用空白温孵体系（肝S9）配制3个不同浓度的藜芦
酸葡萄糖酯和藜芦酸溶液，每个浓度6份，按“2.3”项下方法除去蛋白，得到供
试品溶液。分别进样，根据标准曲线，按照色谱峰的面积求得样品中藜芦酸葡萄糖
酯和藜芦酸的浓度，并计算3个浓度各6份样品的RSD，结果表明重复性良好。
用空白温孵体系配制3个不同浓度的藜芦酸葡萄糖酯和藜芦酸溶液，每个浓度3
份，按“2.3”项下方法除去蛋白，得到供试品溶液。分别在室温下放置0、4、8
h及-20 ℃放置4、7、10 d进样，根据标准曲线，按照色谱峰的面积求得样品中
藜芦酸葡萄糖酯和藜芦酸的浓度，并分别计算短期和长期稳定性的RSD，结果表
明样品的短期和长期稳定性良好。见表2。
2.4.3.4 绝对回收率试验 制备低、中、高浓度的大鼠肝微粒体、肝S9温孵样品
（含藜芦酸葡萄糖酯和藜芦酸），按“2.3”项下方法除去蛋白，以相同浓度的藜
芦酸葡萄糖酯和藜芦酸所得色谱峰面积为对照，二者的平均回收率（n＝3）分别
为91.23%、87.61%。
2.4.4 定性和定量分析 由图2可知，肝微粒体和肝S9均可将藜芦酸葡萄糖酯转
化为藜芦酸，但是，通过对底物藜芦酸葡萄糖酯和代谢产物藜芦酸的定量分析可知，
在相同的作用条件下，肝S9转化模型对藜芦酸葡萄糖酯的转化效率高于肝微粒体
模型。结果见表3。
肝微粒体和肝S9是研究药物肝代谢的常用模型，这2种模型由于制备方法不同，
导致其所含的酶系有所差异。相对而言，肝S9所含酶的种类，特别是Ⅱ相代谢酶
要多于肝微粒体，由此可能造成肝S9模型催化的Ⅱ相代谢多于肝微粒体。已有研
究表明，肝S9是一种稳定、可靠、低成本的体外肝代谢模型[11-14]。本研究发
现，肝S9导致的藜芦酸葡萄糖酯的代谢产物多于肝微粒体（见图2），在高极性
区，肝S9的代谢产物比肝微粒体的代谢产物明显多2个峰（6.05、6.85 min），
其极性大于藜芦酸葡萄糖酯，推测可能是Ⅱ相代谢产物。在相同蛋白浓度条件下，
肝S9对藜芦酸葡萄糖酯的转化率明显高于肝微粒体，说明肝S9对酯类化合物的
转化明显强于肝微粒体，并且随着底物浓度的增加，肝微粒体对藜芦酸葡萄糖酯的
转化率明显降低，但肝S9的转化率始终大于50%（见表3）。因此，与肝微粒体
模型比较，肝S9模型是一种制备简单、快速、低成本、转化率高、酶系丰富的体
外肝代谢模型。
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