2024年4月22日发(作者：康泰宁)

Code No. RR036A

研究用

PrimeScript™

RT Master Mix

(Perfect Real Time)

说明书

v201605Da

目 录

内 容

● 制品说明

● 制品内容

● 试剂盒外必备材料

● 保 存

● 特 长

● 使用注意

● 操作方法

● Real Time PCR

● 实验例

● 附录

● 关联产品

页 码

1

1

1

1

1

2

2

2

5

5

7

● 制品说明

本制品是2 Step Real Time RT-PCR用的理想反转录反应试剂。5×PrimeScript RT Master Mix中

含有定量RT-PCR的反转录反应所需的所有试剂（PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、Random 6 mers、

Oligo dT Primer、dNTP Mixture、反应Buffer），加入模板RNA和水即可迅速进行反应。使用具有较

强延伸能力的PrimeScript RTase，与制品PrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time）（Code

No. RR037Q/A/B）相同，可以在较短时间内高效合成Real Time PCR用模板cDNA。

本制品合成的cDNA可以用于SYBR

®

Green qPCR分析法和探针分析法，可以根据实验目的与SYBR

Premix Ex Taq

™

II (Tli RNaseH Plus)（Code No. RR820Q/A/B）、SYBR Fast qPCR Mix（Code No.

RR430S/A/B）和Probe qPCR Mix（Code No. RR391S/A/B）等定量试剂配合使用，能够进行高性能

的基因表达分析。

注意：Takara Bio使用SYBR Green I作为研究试剂已得到Molecular Probes Inc.的许可。

● 制品内容

（10 μl反应×200次）

1. 5×PrimeScript RT Master Mix（for Real Time）

*1

400 μl

2. RNase Free dH

2

O

3. EASY Dilution（for Real Time PCR）

*2

Mixture、反应Buffer（含有Mg

2+

）。

*2：制作标准曲线时梯度稀释cDNA或RNA标准品的稀释液。模板DNA或RNA如果用水或TE

Buffer稀释时，由于受Microtube吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验

结果精度降低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围

内获得准确定量的标准曲线。本制品不影响反转录和PCR反应，用其稀释后的样品可直接使

用。EASY Dilution（for Real Time PCR）也可以单独购买（Code No. 9160/9160Q）。

注意：EASY Dilution请与本公司Real Time PCR试剂组合使用，对于其他公司的同类制品

的适用性本公司尚未进行确认。

1 ml×2支

1 ml

*1：含有PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、Random 6 mers、Oligo dT Primer、dNTP

● 试剂盒外必备材料

热循环仪（或37℃水浴和85℃加热块）

反转录反应所用0.2 ml和1.5 ml的微量反应管

微量移液器和枪头（高压灭菌）

● 保 存：

-20℃。

● 特 长

1． 制品为预先混好的Premix形式，只需加入模板RNA和水便可以开始反应。

2． 可以在较短时间内高效合成Real Time PCR用cDNA，是进行2 Step Real Time RT-PCR反应的

理想试剂。

3． 使用了Random 6 mers和Oligo dT Primer 2种反转录引物，可以合成适合Real Time PCR用cDNA。

4． Real-time RT PCR定量需要建立标准曲线，建立标准曲线的条件就是需要将总RNA和反转录cDNA

稀释到较低的浓度。如果用水或TE Buffer稀释时，由于模板浓度低不稳定，因而会缩小曲线范围，结

果精度降低。本制品中附加了标准曲线制作用稀释液EASY Dilution（for Real Time PCR），将Total

RNA或cDNA稀释至低浓度时也能够进行准确稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。

- 1 -

● 使用注意

以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。

1． 5×PrimeScript RT Master Mix在使用前要小心地离心收集到反应管底部。由于5×PrimeScript RT

Master Mix粘度高，用移液枪慢慢反复吸打充分混匀后使用。

2． 分装试剂时务必使用新的枪头（Tip），以防止样品间污染。

3． 本制品中已经加入了反转录Primer（Oligo dT Primer 和Random 6 mers），如果要使用Gene Specific

Primer进行反转录反应，则不能使用本制品。

● 操作方法

反转录反应

RNA的制备方法参见“附录”。

1. 按下列组份配制RT反应液（反应液配制请在冰上进行）。

试剂

5×PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time）

Total RNA

RNase Free dH

2

O

2. 轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下:

37℃ 15 min（反转录反应）

85℃ 5 sec（反转录酶的失活反应）

4℃

注意：得到的RT反应液加入到下一步的Real Time PCR反应体系中，其加入量不要超过Real

Time PCR反应体积的1/10（V/V）量。

使用量

2 μl

*

终浓度

1×

up to 10 μl

* 反应体系可按需求相应放大，10 μl反应体系可最大使用500 ng的Total RNA。

● Real Time PCR

以下是使用本制品进行反转录反应后，选择SYBR

Premix Ex Taq

II（Tli RNaseH Plus）（Code No.

RR820A）进行Real Time PCR反应的操作方法。

◆ 应用Applied Biosystems 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System和StepOnePlus Real-Time

PCR System的操作方法

*请按照仪器使用说明书要求进行实验操作。

1. 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

试剂

SYBR

Premix Ex Taq

II(Tli RNaseH Plus)（2×）

PCR Forward Primer（10 μM）

PCR Reverse Primer（10 μM）

ROX Reference Dye or Dye II（50×）

*2

RT反应液（cDNA溶液）

*3

dH

2

O（灭菌蒸馏水）

Total

整引物浓度。

- 2 -

使用量

10 μl

0.8 μl

0.8 μl

0.4 μl

2 μl

6 μl

20 μl

*4

使用量

25 μl

2 μl

2 μl

1

4 μl

16 μl

50 μl

*4

终浓度

1×

0.4 μM

*1

0.4 μM

*1

1×

*1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～1.0 μM范围内调

*2 ROX Reference Dye II（50×）比ROX Reference Dye（50×）浓度低，使用7500 Real-Time

PCR System 和7500 Fast Real-Time PCR System时，请使用ROX Reference Dye II（50×）。

使用StepOnePlus Real-Time PCR System和7300 Real-Time PCR System时，请使用ROX

Reference Dye（50×）。

*3 建议在20 μl反应液中使用相当于10 pg～100 ng Total RNA量的cDNA为模板。反转录反应

液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%。

2. 进行Real Time PCR反应

建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR

条件的优化。当使用Tm值较低的引物或两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR

扩增反应。

< Applied Biosystems 7300/7500 Real-Time PCR System , StepOnePlus>

< Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System >

两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

◆特别提示：

本制品中使用的

TaKaRa Ex Taq

®

HS是利用抗

Taq

抗体的Hot Start用DNA聚合酶，在PCR

*4 按不同仪器的要求确定反应液的体积。

两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

Reps：1

95℃ 30秒

Stage 2：PCR反应

Reps：40

95℃ 5秒

60℃ 30～34秒

*

Dissociation Stage

* 使用StepOnePlus时请设定在30秒。

使用7300时请设定在31秒。

使用7500时请设定在34秒。

Reps：1

95℃ 30秒

Reps：40

95℃ 3秒

60℃ 30秒

Stage 2：PCR反应

Dissociation Stage

反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，

其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。

- 3 -

3. 实验结果分析

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方

法参见仪器的操作手册。

◆ 应用Thermal Cycler Dice™Real Time System

II

扩增仪的操作方法

1. 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

试剂

SYBR

Premix Ex Taq

II(Tli RNaseH Plus)（2×）

使用量

12.5 μl

1.0 μl

1.0 μl

2 μl

*2

8.5 μl

25 μl

终浓度

1×

0.4 μM

*1

0.4 μM

*1

PCR Forward Primer（10 μM）

PCR Reverse Primer（10 μM）

RT反应液（cDNA溶液）

dH

2

O（灭菌蒸馏水）

Total

μM范围内调整引物浓度。

*1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～1.0

*2 建议在25 μl反应液中使用相当于10 pg～100 ng Total RNA量的cDNA为模

板。反转录反应液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%。

2. 进行Real Time PCR反应。

建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序。如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR

条件的优化。当使用Tm值较低的引物或两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR

扩增反应。

◆特别提示：

本制品中使用的

TaKaRa Ex Taq

HS是利用抗

Taq

抗体的Hot Start用DNA聚合酶，在PCR反应

两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

Repeat：1

95℃ 30秒

Stage 2：PCR反应

95℃ 5秒

60℃ 30秒

Stage 3：Dissociation

Repeat：40

前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR

的扩增效率、定量精度等都会受到影响。

3. 实验结果分析。

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方法

参见仪器的操作手册。

- 4 -

● 实验例

反转录反应时间和cDNA合成量的研讨实验

[方法]

1. 反转录反应

试 剂：

模 板：

PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time）

Human Placenta Total RNA 2 pg～2 μg

20 μl 反应体积：

反应条件： 37℃ 15、30、60 min反应后85℃ 5 sec热变性，4℃保存

2. Real Time PCR反应

试 剂：

模 板：

反应体积：

反应条件：

[结果]

Real Time PCR扩增曲线图及标准曲线图如下：

标准曲线图

15 min（紫色） Rsq: 0.999 Eff＝99％ Y＝-3.346LOG（X）+34.52

30 min（红色） Rsq: 1.000 Eff＝98.9％ Y＝-3.349LOG（X）+34.46

60 min（黄色） Rsq: 0.999 Eff＝100.9％ Y＝-3.301LOG（X）+34.24

以上Real Time RT-PCR扩增结果显示，不同反转录反应时间（15、30、60 min）在宽广模板浓度

范围内都可以得到同等的扩增效率。

扩增曲线图

15 min（紫色）

30 min（红色）

60 min（黄色）

SYBR

Premix Ex Taq

II（Perfect Real Time）

上述反转录反应液2 μl

25 μl

Thermal Cycler Dice Real Time System 标准反应条件

Target Gene：

ACTB

● 附 录

RNA样品制备

本制品是将RNA反转录成cDNA的专用试剂。RNA的纯度会影响cDNA的合成量，而制备RNA的关键

是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采

取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办

法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。

- 5 -

【使用器具】

尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列（1）或者（2）方法进行处理。

(1) 干热灭菌（180℃，60 min）

(2) 用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。然后在120℃下高压灭菌30分钟除

去残留的DEPC。

RNA实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其它实验。

【试剂配制】

用于RNA实验的试剂，需使用干热灭菌（180℃，60 min）或用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻

璃容器盛装（也可使用RNA实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水需用0.1%的DEPC处理后进行高

温高压灭菌。

RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。

【制备方法】

使用简单的RNA纯化方法即可获得满足于RT-PCR反应的RNA（只需少量的RNA便可进行RT-PCR

反应）。但为了保证实验的成功率，建议使用GTC法（异硫氰酸胍法）制备的高纯度RNA。

从培养细胞、组织中提取时，使用RNAiso Plus（Code No. 9108/9109）。纯化的RNA用灭菌蒸馏水或

灭菌的TE缓冲液溶解。

【Total RNA中混有基因组DNA的对策】

提取的Total RNA中常常混有基因组DNA，而基因组DNA可以直接作为PCR模板进行扩增，造成解析

结果不准确。为了避免这种情况发生，我们必须采取如下两种措施：1、引物设计时避免基因组DNA扩

增；2、使用DNase I处理除去基因组DNA。

1、引物设计时避免基因组DNA扩增

我们可以利用基因组DNA具有外显子和内含子的结构，在引物设计上下工夫，使PCR反应时不能扩增

基因组DNA。此时我们首先应确认目的基因的基因组结构，选择较长的内含子。然后，在这个内含子两

侧的外显子上分别设计上、下游引物。Real Time PCR反应时通常扩增的目的DNA片段长度都比较短，

设置的条件也是适合短片段DNA的扩增。所以，当内含子足够长时，基因组DNA来源的扩增就不能发

生；当内含子较短时，基因组DNA来源的扩增可能发生，但基因组DNA来源的扩增产物比mRNA来源

的扩增产物长，可通过分析融解曲线的方法加以区分。但是，此种方法不适合具有单个外显子的基因、或

者不具有内含子的生物种以及基因组情报没被解析的生物种等，此时必须采取2、的方法解决。

2、使用DNase I处理除去基因组DNA

使用常规方法提取Total RNA后，再使用DNase I(RNase-free)(Code No. 2270A)分解混入的基因组

DNA，最后进行苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀等纯化Total RNA。

◆ 操作流程

① 按下列组份配制反应液。

试剂

Total RNA

10×DNase I Buffer

RNase Inhibitor

DNase I（RNase-free）

DEPC处理水

② 37℃ 20 min。

③ 使用以下两种方法使DNase I失活。

A．热处理

（1）加入2.5 μl 0.5 M EDTA 80℃ 2 min。

（2）用DEPC处理水定容至100 μl。

- 6 -

使用量

20～50 μg

5 μl

20 U

2 μl（10 U）

up to 50 μl

B．苯酚/氯仿抽提

（1）用50 μl DEPC处理水定容至100 μl后加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）混匀。

（2）室温，15,000 rpm 5 min离心，取上清。

（3）加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）混匀。

（4）室温，15,000 rpm 5 min离心，取上清。

④ 加入10 μl 3 M醋酸钠，250 μl冷乙醇，冰上放置10 min。

⑤ 4℃，15,000 rpm 15 min离心，弃上清。

⑥ 加入70%冷乙醇洗净，4℃，15,000 rpm 5 min离心，弃上清。

⑦ 沉淀干燥。

⑧ 加入适量DEPC处理水溶解。

【基因组DNA确认方法】

不进行反转录反应，通过Real Time PCR确认基因组DNA混入量。此实验使用从基因组DNA和mRNA

中都能进行扩增的Primer。DNase I处理后的基因组DNA处理情况也可以通过此方法进行确认。另外，

使用跨内含子对基因组DNA不能进行扩增的Primer也有扩增产物时，怀疑有伪基因存在，这种情况也

● 关联产品

可以用此方法进行确认。

SYBR

®

Premix Ex Taq

™ II (Tli RNaseH Plus) (Code No. RR820Q/A/B)

SYBR

®

Fast qPCR Mix (Code No. RR430S/A/B)

SYBR

®

Premix Ex Taq

™ (Tli RNaseH Plus) (Code No. RR420Q/A/B)

Probe qPCR Mix (Code No. RR391S/A/B)

EASY Dilution (for Real Time PCR) (Code No. 9160/9160Q)

Thermal Cycler Dice™ Real Time System III (Code No. TP950/TP970/TP980/TP990)

Thermal Cycler Dice™ Real Time System

II

(Code No. TP900/TP960)

Thermal Cycler Dice™ Real Time System

Lite

(Code No. TP700/TP760)

PrimeScript™ RT Reagent Kit (Perfect Real Time) (Code No. RR037Q/A/B)

PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (Code No. RR047Q/A/B)

RNAiso Plus (Code No. 9108/9109)

TaKaRa Ex Taq

is a registered trademarks of TAKARA BIO INC.

SYBR is a registered trademark of Molecular Probes,Inc.

PrimeScript、Thermal Cycler Dice 、

Premix Ex Taq

are trademarks of TAKARA BIO INC.

注意

本产品仅供科学研究使用，不能用于人、动物的医疗或诊断程序，不能使用本产品作为食品、化妆品或

家庭用品等。

TAKARA BIO INC.书面许可授权或批准，不得制造、许诺销售、销售、进口Takara产品，或者使未经

用

Takara产品所有的相关专利及相关商标。

如果您需要其他用途的许可授权，请联络我们，或访问我们网站。

您使用本产品必须遵守产品网页上适用的全部许可要求。阅读、了解并遵守此类声明的所有限制性条款

是您的责任。

所有商标均属于各自商标所有者的财产。某些商标并未在全部行政区注册。

本文件由宝生物工程 (大连) 有限公司翻译制作，最新版本文件请参考TAKARA BIO INC.网站。为正确使

用Takara产品，您应当掌握本产品的相关知识和使用说明。

- 7 -

技术咨询热线：

*************，87641686

4006518761，4006518769

URL:

v201605Da

2024年4月22日发(作者：康泰宁)

Code No. RR036A

研究用

PrimeScript™

RT Master Mix

(Perfect Real Time)

说明书

v201605Da

目 录

内 容

● 制品说明

● 制品内容

● 试剂盒外必备材料

● 保 存

● 特 长

● 使用注意

● 操作方法

● Real Time PCR

● 实验例

● 附录

● 关联产品

页 码

1

1

1

1

1

2

2

2

5

5

7

● 制品说明

本制品是2 Step Real Time RT-PCR用的理想反转录反应试剂。5×PrimeScript RT Master Mix中

含有定量RT-PCR的反转录反应所需的所有试剂（PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、Random 6 mers、

Oligo dT Primer、dNTP Mixture、反应Buffer），加入模板RNA和水即可迅速进行反应。使用具有较

强延伸能力的PrimeScript RTase，与制品PrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time）（Code

No. RR037Q/A/B）相同，可以在较短时间内高效合成Real Time PCR用模板cDNA。

本制品合成的cDNA可以用于SYBR

®

Green qPCR分析法和探针分析法，可以根据实验目的与SYBR

Premix Ex Taq

™

II (Tli RNaseH Plus)（Code No. RR820Q/A/B）、SYBR Fast qPCR Mix（Code No.

RR430S/A/B）和Probe qPCR Mix（Code No. RR391S/A/B）等定量试剂配合使用，能够进行高性能

的基因表达分析。

注意：Takara Bio使用SYBR Green I作为研究试剂已得到Molecular Probes Inc.的许可。

● 制品内容

（10 μl反应×200次）

1. 5×PrimeScript RT Master Mix（for Real Time）

*1

400 μl

2. RNase Free dH

2

O

3. EASY Dilution（for Real Time PCR）

*2

Mixture、反应Buffer（含有Mg

2+

）。

*2：制作标准曲线时梯度稀释cDNA或RNA标准品的稀释液。模板DNA或RNA如果用水或TE

Buffer稀释时，由于受Microtube吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验

结果精度降低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围

内获得准确定量的标准曲线。本制品不影响反转录和PCR反应，用其稀释后的样品可直接使

用。EASY Dilution（for Real Time PCR）也可以单独购买（Code No. 9160/9160Q）。

注意：EASY Dilution请与本公司Real Time PCR试剂组合使用，对于其他公司的同类制品

的适用性本公司尚未进行确认。

1 ml×2支

1 ml

*1：含有PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、Random 6 mers、Oligo dT Primer、dNTP

● 试剂盒外必备材料

热循环仪（或37℃水浴和85℃加热块）

反转录反应所用0.2 ml和1.5 ml的微量反应管

微量移液器和枪头（高压灭菌）

● 保 存：

-20℃。

● 特 长

1． 制品为预先混好的Premix形式，只需加入模板RNA和水便可以开始反应。

2． 可以在较短时间内高效合成Real Time PCR用cDNA，是进行2 Step Real Time RT-PCR反应的

理想试剂。

3． 使用了Random 6 mers和Oligo dT Primer 2种反转录引物，可以合成适合Real Time PCR用cDNA。

4． Real-time RT PCR定量需要建立标准曲线，建立标准曲线的条件就是需要将总RNA和反转录cDNA

稀释到较低的浓度。如果用水或TE Buffer稀释时，由于模板浓度低不稳定，因而会缩小曲线范围，结

果精度降低。本制品中附加了标准曲线制作用稀释液EASY Dilution（for Real Time PCR），将Total

RNA或cDNA稀释至低浓度时也能够进行准确稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。

- 1 -

● 使用注意

以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。

1． 5×PrimeScript RT Master Mix在使用前要小心地离心收集到反应管底部。由于5×PrimeScript RT

Master Mix粘度高，用移液枪慢慢反复吸打充分混匀后使用。

2． 分装试剂时务必使用新的枪头（Tip），以防止样品间污染。

3． 本制品中已经加入了反转录Primer（Oligo dT Primer 和Random 6 mers），如果要使用Gene Specific

Primer进行反转录反应，则不能使用本制品。

● 操作方法

反转录反应

RNA的制备方法参见“附录”。

1. 按下列组份配制RT反应液（反应液配制请在冰上进行）。

试剂

5×PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time）

Total RNA

RNase Free dH

2

O

2. 轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下:

37℃ 15 min（反转录反应）

85℃ 5 sec（反转录酶的失活反应）

4℃

注意：得到的RT反应液加入到下一步的Real Time PCR反应体系中，其加入量不要超过Real

Time PCR反应体积的1/10（V/V）量。

使用量

2 μl

*

终浓度

1×

up to 10 μl

* 反应体系可按需求相应放大，10 μl反应体系可最大使用500 ng的Total RNA。

● Real Time PCR

以下是使用本制品进行反转录反应后，选择SYBR

Premix Ex Taq

II（Tli RNaseH Plus）（Code No.

RR820A）进行Real Time PCR反应的操作方法。

◆ 应用Applied Biosystems 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System和StepOnePlus Real-Time

PCR System的操作方法

*请按照仪器使用说明书要求进行实验操作。

1. 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

试剂

SYBR

Premix Ex Taq

II(Tli RNaseH Plus)（2×）

PCR Forward Primer（10 μM）

PCR Reverse Primer（10 μM）

ROX Reference Dye or Dye II（50×）

*2

RT反应液（cDNA溶液）

*3

dH

2

O（灭菌蒸馏水）

Total

整引物浓度。

- 2 -

使用量

10 μl

0.8 μl

0.8 μl

0.4 μl

2 μl

6 μl

20 μl

*4

使用量

25 μl

2 μl

2 μl

1

4 μl

16 μl

50 μl

*4

终浓度

1×

0.4 μM

*1

0.4 μM

*1

1×

*1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～1.0 μM范围内调

*2 ROX Reference Dye II（50×）比ROX Reference Dye（50×）浓度低，使用7500 Real-Time

PCR System 和7500 Fast Real-Time PCR System时，请使用ROX Reference Dye II（50×）。

使用StepOnePlus Real-Time PCR System和7300 Real-Time PCR System时，请使用ROX

Reference Dye（50×）。

*3 建议在20 μl反应液中使用相当于10 pg～100 ng Total RNA量的cDNA为模板。反转录反应

液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%。

2. 进行Real Time PCR反应

建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR

条件的优化。当使用Tm值较低的引物或两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR

扩增反应。

< Applied Biosystems 7300/7500 Real-Time PCR System , StepOnePlus>

< Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System >

两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

◆特别提示：

本制品中使用的

TaKaRa Ex Taq

®

HS是利用抗

Taq

抗体的Hot Start用DNA聚合酶，在PCR

*4 按不同仪器的要求确定反应液的体积。

两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

Reps：1

95℃ 30秒

Stage 2：PCR反应

Reps：40

95℃ 5秒

60℃ 30～34秒

*

Dissociation Stage

* 使用StepOnePlus时请设定在30秒。

使用7300时请设定在31秒。

使用7500时请设定在34秒。

Reps：1

95℃ 30秒

Reps：40

95℃ 3秒

60℃ 30秒

Stage 2：PCR反应

Dissociation Stage

反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，

其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。

- 3 -

3. 实验结果分析

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方

法参见仪器的操作手册。

◆ 应用Thermal Cycler Dice™Real Time System

II

扩增仪的操作方法

1. 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

试剂

SYBR

Premix Ex Taq

II(Tli RNaseH Plus)（2×）

使用量

12.5 μl

1.0 μl

1.0 μl

2 μl

*2

8.5 μl

25 μl

终浓度

1×

0.4 μM

*1

0.4 μM

*1

PCR Forward Primer（10 μM）

PCR Reverse Primer（10 μM）

RT反应液（cDNA溶液）

dH

2

O（灭菌蒸馏水）

Total

μM范围内调整引物浓度。

*1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～1.0

*2 建议在25 μl反应液中使用相当于10 pg～100 ng Total RNA量的cDNA为模

板。反转录反应液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%。

2. 进行Real Time PCR反应。

建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序。如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR

条件的优化。当使用Tm值较低的引物或两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR

扩增反应。

◆特别提示：

本制品中使用的

TaKaRa Ex Taq

HS是利用抗

Taq

抗体的Hot Start用DNA聚合酶，在PCR反应

两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

Repeat：1

95℃ 30秒

Stage 2：PCR反应

95℃ 5秒

60℃ 30秒

Stage 3：Dissociation

Repeat：40

前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR

的扩增效率、定量精度等都会受到影响。

3. 实验结果分析。

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方法

参见仪器的操作手册。

- 4 -

● 实验例

反转录反应时间和cDNA合成量的研讨实验

[方法]

1. 反转录反应

试 剂：

模 板：

PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time）

Human Placenta Total RNA 2 pg～2 μg

20 μl 反应体积：

反应条件： 37℃ 15、30、60 min反应后85℃ 5 sec热变性，4℃保存

2. Real Time PCR反应

试 剂：

模 板：

反应体积：

反应条件：

[结果]

Real Time PCR扩增曲线图及标准曲线图如下：

标准曲线图

15 min（紫色） Rsq: 0.999 Eff＝99％ Y＝-3.346LOG（X）+34.52

30 min（红色） Rsq: 1.000 Eff＝98.9％ Y＝-3.349LOG（X）+34.46

60 min（黄色） Rsq: 0.999 Eff＝100.9％ Y＝-3.301LOG（X）+34.24

以上Real Time RT-PCR扩增结果显示，不同反转录反应时间（15、30、60 min）在宽广模板浓度

范围内都可以得到同等的扩增效率。

扩增曲线图

15 min（紫色）

30 min（红色）

60 min（黄色）

SYBR

Premix Ex Taq

II（Perfect Real Time）

上述反转录反应液2 μl

25 μl

Thermal Cycler Dice Real Time System 标准反应条件

Target Gene：

ACTB

● 附 录

RNA样品制备

本制品是将RNA反转录成cDNA的专用试剂。RNA的纯度会影响cDNA的合成量，而制备RNA的关键

是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采

取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办

法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。

- 5 -

【使用器具】

尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列（1）或者（2）方法进行处理。

(1) 干热灭菌（180℃，60 min）

(2) 用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。然后在120℃下高压灭菌30分钟除

去残留的DEPC。

RNA实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其它实验。

【试剂配制】

用于RNA实验的试剂，需使用干热灭菌（180℃，60 min）或用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻

璃容器盛装（也可使用RNA实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水需用0.1%的DEPC处理后进行高

温高压灭菌。

RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。

【制备方法】

使用简单的RNA纯化方法即可获得满足于RT-PCR反应的RNA（只需少量的RNA便可进行RT-PCR

反应）。但为了保证实验的成功率，建议使用GTC法（异硫氰酸胍法）制备的高纯度RNA。

从培养细胞、组织中提取时，使用RNAiso Plus（Code No. 9108/9109）。纯化的RNA用灭菌蒸馏水或

灭菌的TE缓冲液溶解。

【Total RNA中混有基因组DNA的对策】

提取的Total RNA中常常混有基因组DNA，而基因组DNA可以直接作为PCR模板进行扩增，造成解析

结果不准确。为了避免这种情况发生，我们必须采取如下两种措施：1、引物设计时避免基因组DNA扩

增；2、使用DNase I处理除去基因组DNA。

1、引物设计时避免基因组DNA扩增

我们可以利用基因组DNA具有外显子和内含子的结构，在引物设计上下工夫，使PCR反应时不能扩增

基因组DNA。此时我们首先应确认目的基因的基因组结构，选择较长的内含子。然后，在这个内含子两

侧的外显子上分别设计上、下游引物。Real Time PCR反应时通常扩增的目的DNA片段长度都比较短，

设置的条件也是适合短片段DNA的扩增。所以，当内含子足够长时，基因组DNA来源的扩增就不能发

生；当内含子较短时，基因组DNA来源的扩增可能发生，但基因组DNA来源的扩增产物比mRNA来源

的扩增产物长，可通过分析融解曲线的方法加以区分。但是，此种方法不适合具有单个外显子的基因、或

者不具有内含子的生物种以及基因组情报没被解析的生物种等，此时必须采取2、的方法解决。

2、使用DNase I处理除去基因组DNA

使用常规方法提取Total RNA后，再使用DNase I(RNase-free)(Code No. 2270A)分解混入的基因组

DNA，最后进行苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀等纯化Total RNA。

◆ 操作流程

① 按下列组份配制反应液。

试剂

Total RNA

10×DNase I Buffer

RNase Inhibitor

DNase I（RNase-free）

DEPC处理水

② 37℃ 20 min。

③ 使用以下两种方法使DNase I失活。

A．热处理

（1）加入2.5 μl 0.5 M EDTA 80℃ 2 min。

（2）用DEPC处理水定容至100 μl。

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使用量

20～50 μg

5 μl

20 U

2 μl（10 U）

up to 50 μl

B．苯酚/氯仿抽提

（1）用50 μl DEPC处理水定容至100 μl后加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）混匀。

（2）室温，15,000 rpm 5 min离心，取上清。

（3）加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）混匀。

（4）室温，15,000 rpm 5 min离心，取上清。

④ 加入10 μl 3 M醋酸钠，250 μl冷乙醇，冰上放置10 min。

⑤ 4℃，15,000 rpm 15 min离心，弃上清。

⑥ 加入70%冷乙醇洗净，4℃，15,000 rpm 5 min离心，弃上清。

⑦ 沉淀干燥。

⑧ 加入适量DEPC处理水溶解。

【基因组DNA确认方法】

不进行反转录反应，通过Real Time PCR确认基因组DNA混入量。此实验使用从基因组DNA和mRNA

中都能进行扩增的Primer。DNase I处理后的基因组DNA处理情况也可以通过此方法进行确认。另外，

使用跨内含子对基因组DNA不能进行扩增的Primer也有扩增产物时，怀疑有伪基因存在，这种情况也

● 关联产品

可以用此方法进行确认。

SYBR

®

Premix Ex Taq

™ II (Tli RNaseH Plus) (Code No. RR820Q/A/B)

SYBR

®

Fast qPCR Mix (Code No. RR430S/A/B)

SYBR

®

Premix Ex Taq

™ (Tli RNaseH Plus) (Code No. RR420Q/A/B)

Probe qPCR Mix (Code No. RR391S/A/B)

EASY Dilution (for Real Time PCR) (Code No. 9160/9160Q)

Thermal Cycler Dice™ Real Time System III (Code No. TP950/TP970/TP980/TP990)

Thermal Cycler Dice™ Real Time System

II

(Code No. TP900/TP960)

Thermal Cycler Dice™ Real Time System

Lite

(Code No. TP700/TP760)

PrimeScript™ RT Reagent Kit (Perfect Real Time) (Code No. RR037Q/A/B)

PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (Code No. RR047Q/A/B)

RNAiso Plus (Code No. 9108/9109)

TaKaRa Ex Taq

is a registered trademarks of TAKARA BIO INC.

SYBR is a registered trademark of Molecular Probes,Inc.

PrimeScript、Thermal Cycler Dice 、

Premix Ex Taq

are trademarks of TAKARA BIO INC.

注意

本产品仅供科学研究使用，不能用于人、动物的医疗或诊断程序，不能使用本产品作为食品、化妆品或

家庭用品等。

TAKARA BIO INC.书面许可授权或批准，不得制造、许诺销售、销售、进口Takara产品，或者使未经

用

Takara产品所有的相关专利及相关商标。

如果您需要其他用途的许可授权，请联络我们，或访问我们网站。

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是您的责任。

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