2024年4月26日发(作者：佛妮子)
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(21)申请号 CN2.9
(22)申请日 2012.05.21
(71)申请人 上海医药工业研究院;中国医药工业研究总院
地址 200040 上海市静安区北京西路1320号
(72)发明人 陈代杰 李继安 邵雷 黄娟娟 陈舟舟
(74)专利代理机构 北京市金杜律师事务所
代理人 陈长会
(51)
C07D501/57
C07D501/12
(10)申请公布号 CN 103421025 A
(43)申请公布日 2013.12.04
权利要求说明书 说明书 幅图
(54)发明名称
制备7α-甲氧基头孢菌素C的方法
(57)摘要
本发明公开一种制备7α-甲氧基头
孢菌素C的方法，其特征在于所述方法包
括通过转化液前处理、吸附树脂层析处理
和反相硅胶柱层析处理，从将头孢菌素C
底物转化为7α-甲氧基头孢菌素C的转化
液中制备7α-甲氧基头孢菌素C的步骤。
所述方法不仅工艺简单，能够很好的去除
结构十分类似的转化底物、中间产物等杂
质，且获得甲氧基头孢菌素C的收率和纯
度都很高。
法律状态
法律状态公告日
2022-05-06
法律状态信息
未缴年费专利权终止IPC(主分
类):C07D 501/57专利
号:ZL2申请
日:20120521授权公告
日:20160511
法律状态
专利权的终止
权 利 要 求 说 明 书
1.制备7α-甲氧基头孢菌素C的方法，其特征在于所述方法包括通
过转化液前处理、吸附树脂层析处理和反相硅胶柱层析处理，从将头孢
菌素C底物转化为7α-甲氧基头孢菌素C的转化液中制备7α-甲氧基
菌素C的步骤。 头孢
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述转化液前处理包括如
下步骤：
在每毫升转化液中加入30-70μl的冰醋酸混匀，抽滤取澄清的滤液，
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述吸附树脂层析处
将所述上柱母液通过大孔吸附树脂层析柱，获得浓缩液；用pH为
理包括如下步骤：
用酸调pH值为3.0-5.0，获得上柱母液。
2.5-4.5的酸水洗涤柱子2-6CV；然后用含10％-40％的低脂肪醇水溶液，
2-5CV洗脱柱子，分步收集并HPLC检测流出液；将7α-甲氧基头孢
C HPLC纯度大于15％的收集瓶合并，调pH3.0-5.0，减压真
获得浓缩液。
菌素
空旋蒸浓缩
4.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于所述反相硅胶柱层析
处理包括如下步骤：
用pH值为3.0-5.0的酸水预处理十八烷基键合硅胶层析柱，并将所
述浓缩液缓慢通过上述C18反相硅胶柱；然后用pH值为3.0-5.0的酸水
洗涤柱子3-4CV；再用加入含1％-3％甲醇或乙醇的水溶液，2-4CV
柱子，分步收集并HPLC检测流出液，然后用含4％-8％甲醇
溶液，3-8CV洗脱柱子，分步收集并HPLC检测；将纯
集瓶合并，减压真空旋蒸浓缩后冻干，制得7α-
型粉末。
洗脱
或乙醇的水
度大于85％的收
甲氧基头孢菌素C无定
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述酸为盐酸或硫酸。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述pH值调为3.0-4.5。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述低脂肪醇为甲醇、乙
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述大孔吸附树脂为聚苯
醇、丙酮或异丙醇。
乙烯-二乙烯苯型大网格中等极性树脂，其比表面积≥300m2/g，
为，调和粒径250-840μm。 特征孔径
9.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述酸水为pH为
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述酸水的pH值为
11.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述10％-40％低级脂肪
12.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述十八烷基键合硅胶
13.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述含1％-3％甲醇或乙
14.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述层析柱高径比
醇的水溶液中，醇浓度为1％-2％乙醇或2％-3％甲醇；所述含4％-8％甲醇
或乙醇的水溶液中，醇浓度为4％-5％乙醇或4％-7％甲醇。
的填料为球形亲水型，特征孔径为，调和粒径为5-70μm。
醇水溶液为在蒸馏水或去离子水中加入体积为10％-40％的醇而制备。
3.0-4.0。
2.5-4.5的水溶液，所述酸为硫酸或盐酸。
大于等于3∶1。
说 明 书
技术领域
本发明属于制药工程领域，具体涉及一种制备高纯度7α-甲氧基头孢
C(7α-Methoxycephalosporin C)的方法。
背景技术
头孢菌素类抗生素是抗感染药物中发展较早，应用较广的一大类。
20世纪70年代初发展起来的7α-甲氧基头孢菌素(其化学结构式
I)，由于在β-内酰胺环上的C7位有一个反式甲氧基，阻止内酰
酶分子的接近，进而提高了药物对β-内酰胺酶的稳定性。对于这
的研究是最近发展比较迅速的一个前沿领域。
甲氧头孢菌素类抗生素已有多种产品上市，包括头孢米诺、头孢美
这类药物共同的半合成中间体为甲氧基头孢菌素。甲氧基头孢菌
成一般可以通过化学合成法和微生物转化法。化学法是目前业内
用的方法，主要研究方向都是以7-ACA为原料进行合成，例如中
CN2.6报道了以7-ACA为原料，和甲巯四氮唑反应
7-TMCA，7-TMCA和甲基硫溴进行亚胺化反应，然后与二苯重氮
应得到中间体，中间体和甲基化试剂甲基化反应，得到可以用于
氧头孢类药物的中间体7-MAC。另外，中国专利CN101210019A
唑等。
素的合
普遍采
国专利
得到
甲烷反
合成甲
其中于
如下式
胺环与
类药物
菌素
报道了以C4，7位保护、C3位卤甲基的头孢化合物为原料，
头孢菌素中间体。但这些化学合成的方法普遍存在有机溶媒使
能耗严重等问题。而用生物转化的方法可以有效的解决这些问
生物转化得到的甲氧头孢菌素C作为合成甲氧头孢菌素类抗
合成甲氧基
用量大，
题，利用
生素，对于
清洁生产，降低能耗等方面都有显著优势。
文献(The Conversion of Cephalosporins to 7α-Methoxycephalosporins
by Cell-Free Extract of Streptomyces m.J， 1980，
186：613-616)报道利用棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus，
发明内容
为解决现有技术中存在的不足，本发明涉及一种制备高纯度7α-甲氧
菌素C的方法，该方法不仅工艺简单，能够很好的去除结构十分
转化底物、中间产物等杂质，且获得甲氧基头孢菌素C的收率和
很高。
因此，本发明提供一种制备7α-甲氧基头孢菌素C的方法，其特征在 于所述
基头孢
类似的
纯度都
ATCC27064)细胞破碎后的粗酶液，加入辅因子和头孢菌素C底物，转化
得到7α-甲氧基头孢菌素C，但是目前尚无报道从转化体系中将产物7α-
甲氧基头孢菌素C分离纯化的方法。另有文献(Non-radioactive assay and
HPLC analysis of cephalosporin C 7α-methocxylation by cell-free extracts of
Streptomyces Microbiol Biotechnol，1991，35：793-797)报
道化学合成7α-甲氧基头孢菌素C的方法，首先耦合α-二苯甲基-N-t-丁
酮-D-α-氨基己二酯和二苯甲基-7-氨基头孢菌酸酯，得到N-t-丁酮-bis-二
苯甲基酯的CPC，然后以甲醇锂盐作为甲基供体，进行添加甲氧基的反
应，最后脱去羟基和氨基的保护基团，得到7α-甲氧基头孢菌素C。在化
学合成过程中，使用了较多的化学试剂，反应复杂。虽然在化学合成过
程中，通过有机溶剂萃取、旋蒸等步骤可以得到纯度90％以上的7α-甲氧
基头孢菌素C，但是由于生物转化后体系与化学合成体系有很大差异，
因而报道的分离甲氧基头孢菌素C的方法并不适用于从转化产物中纯化
甲氧基头孢菌素C。
方法包括通过转化液前处理、吸附树脂层析处理和反相硅胶柱层
析处理，从将头孢菌素C底物转化为7α-甲氧基头孢菌素C的
制备7α-甲氧基头孢菌素C的步骤。 转化液中
根据本发明的一个优选的实施方式，所述方法包括下列步骤：
a)在每毫升转化液中加入30-70μl的冰醋酸混匀，使转化液中的大部
变性沉淀，抽滤取澄清的滤液，用酸调pH值为3.0-5.0，即为上
b)将获得的上柱母液缓慢通过大孔吸附树脂层析柱；用pH为2.5-4.5
洗涤柱子2-6CV(柱体积)；然后用含10％-40％(v∶v)、优选
低脂肪醇的水溶液，2-5CV洗脱柱子，分步收集并HPLC
分蛋白
柱母液；
的酸水
15-30％(v∶v)
检测流出液；
调pH3.0-5.0，将7α-甲氧基头孢菌素C HPLC纯度大于15％的收集瓶合并，
减压真空旋蒸浓缩获得浓缩液。
c)用pH值为3.0-5.0的酸水预处理十八烷基(C18)键合硅胶层析柱，
中得到的浓缩液缓慢通过上述C18反相硅胶柱；然后用pH值为
的酸水洗涤柱子3-4CV；再用加入含1％-3％(v∶v)甲醇或乙醇
液，2-4CV洗脱柱子，分步收集并HPLC检测流出液，然后用含
并将b)
3.0-5.0
的水溶
4％-8％
将纯度
基头孢
甲醇或乙醇的水溶液，3-8CV洗脱柱子，分步收集并HPLC检测；
大于85％的收集瓶合并，减压真空旋蒸浓缩后冻干，制得7α-甲氧
菌素C无定型粉末。
本发明方法a)步骤中所用的酸为盐酸或者硫酸，优选为盐酸。
本发明方法a)步骤中转化液抽滤取滤液后，优选pH值调为3.0-4.5。
本发明方法a)步骤中低脂肪醇为甲醇、乙醇、丙酮或异丙醇，优选
或乙醇。
本发明方法b)步骤中大孔吸附树脂为市售常用聚苯乙烯-二乙烯苯
为甲醇
型大网
格中等极性树脂，其比表面积≥300m2/g，特征孔径为调和粒径250-
840μm。优选上海华震科技有限公司HZ-816，HZ-803，
脂，罗门哈斯公司XAD-16N、XAD-16HP、XAD1600N、
XAD-4或者XAD-18型树脂，最优选为XAD-18树脂。
本发明中，术语“调和粒径”的定义为混合颗粒中，所有颗粒的平
本发明方法b)、c)步骤中的酸水指含有少量酸的水溶液，此酸为硫
本发明方法b)、c)步骤中所述酸水为pH为2.5-4.5、优选3.0-4.0
液。
本发明方法b)步骤中所述10％-40％低级脂肪醇水溶液为在蒸馏水或
水中加入体积为10％-40％的醇而制备；所述15％-30％低级脂肪醇
为在蒸馏水或去离子水中加入体积为15％-30％的醇而制备。
本发明方法c)步骤中十八烷基(C18)键合硅胶填料为球形亲水型，特
为调和粒径为5-70μm。优选苏州赛分科技有限公司填
上海大有色谱技术服务有限公司填料DYB7130、
本发明方法c)步骤中所述含1％-3％(v∶v)甲醇或乙醇的水溶液中 优选醇
高于之
征孔径
去离子
水溶液
的水溶
酸或盐酸，优选为盐酸。
均直径。
HZ-818型树
XAD1180、
料Bio-C8，HP-C18；
DYB7219。
浓度为1％-2％的乙醇或醇浓度为2％-3％的甲醇；所述4％-8％(略
前的浓度)甲醇或乙醇的水溶液中优选醇浓度为4％-5％的乙醇或
为4％-7％的甲醇。
本发明方法b)、c)步骤中使用的层析柱高径比大于等于3∶1。
醇浓度
本发明方法中步骤b)主要作用在于除去转化液中的蛋白质，盐类， 色素等
一些不与树脂吸附的杂质，这对于提高步骤c)的分离效果很有帮
本发明步骤c)中用低浓度的低脂肪醇来洗脱目的产物，能够很好地
他强极性杂质，且能够很好的将甲氧基头孢菌素C与转化的底物、
物进行分离，得到的目的产物纯度较高。
本发明的方法简单易行，树脂和反相硅胶填料可反复使用，再生方
用的有机溶剂量少且可循环回收，且获得的目的产物的纯度很高。
附图说明
图1为底物头孢菌素C转化为7α-甲氧基头孢菌素C的过程；
图2为实施例1获得的7α-甲氧基头孢菌素C(HPLC纯度97.6％)
液相色谱(HPLC)图谱(图中7α-甲氧基头孢菌素C出峰时间为
图3为实施例1获得的7α-甲氧基头孢菌素C(HPLC纯度97.6％)
的质谱图谱；
图4为实施例1获得的7α-甲氧基头孢菌素C(HPLC纯度97.6％)
H1谱。
助。
除去其
中间产
便，使
的高效
17.4min)；
的核磁
具体实施方式
本发明7α-甲氧基头孢菌素C HPLC检测条件如下：
色谱柱：柱Ultimate AQ-C18，5μm，250×4.6mm；
检测波长：272nm；
柱温：30℃；
流速：0.8ml/min；
流动相：A相：1L水中加入2.4ml甲酸，0.77g乙酸铵
B相：1L乙腈中加入2ml甲酸
本发明所使用的菌体生长条件如下：
菌种：Streptomyces clavuligerus ATCC27064(NRRL3585)
斜面培养
培养基(g/L)：麦芽提取物10，酵母提取物4，葡萄糖4，琼脂25，
7.4，121℃灭菌30min；
培养条件：28℃培养7-10天。
pH7.0-
种子培养
培养基(g/L)：葡萄糖10，进口蛋白胨10，进口酵母提取物5，
灭菌20min；
培养条件：28℃，250rpm，培养2天。
本发明所使用的转化条件如下：
棒状链霉菌Streptomyces clavuligerus ATCC27064在种子培养基中培
将冻存的菌体每克加入10ml磷酸盐缓冲液(pH7.4)，融后超声破
为初酶液，加入辅因子2-酮戊二酸(终浓度2mM)、L-抗坏血酸
壁，作
(终浓
121℃
养2天后抽滤收集菌体，并用去离子水洗涤后，放-20℃冻存。
度1mM)、FeSO4(终浓度1mM)、S-腺苷甲硫氨酸(SAM，
实施例1
取转化液500ml，其中7α-甲氧基头孢菌素C的含量约为0.2mg/ml，
纯度约为7％，在转化液中加入25ml冰醋酸，混匀后过滤，取滤
得pH值为3.5，无需再调节pH值。
装一根高约20cm，直径5cm的XAD-18大孔吸附树脂层析柱，将上
以7ml/min的流速过柱，用盐酸配制的pH3.5的酸水3CV洗涤柱
用20％乙醇溶液3CV洗涤柱子，每个70ml收集一瓶。用HPLC
述滤液
子；再
检测，
HPLC
液，测
终浓度1mM)以及底物头孢菌素C(终浓度500μg/ml)混匀，恒温振荡
转化(28℃，240r/min)4到6h。
将甲氧基头孢菌素C含量较高的收集瓶合并，纯度为24％。
装一根高约10cm，直径2cm的Bio-C18层析柱，用盐酸配制pH值
的酸水处理柱子。将上一步合并的部分减压真空旋蒸浓缩，调pH
为3.5
值3.5
洗涤柱
一管，
HPLC
后，上柱，流速为1ml/min。用盐酸配制的pH值为3.5的酸水3CV
子，除去杂质；然后用2％的甲醇溶液3CV洗涤，每隔15ml收集
HPLC检测；再用4％的甲醇溶液4CV洗涤，每10ml收集一管，
检测。
将纯度较高的部分合并，最后合并液的纯度为90％，收率为65％。
实施例2
取转化液500ml，其中7α-甲氧基头孢菌素C的含量约为0.2mg/ml，
纯度约为6％，在转化液中加入25ml冰醋酸，混匀后过滤，取滤
得pH值为3.6，无需再调节pH值。
装一根高约20cm，直径5cm的XAD-4大孔吸附树脂层析柱，将上
以7ml/min的流速过柱，用盐酸配制的pH3.5的酸水3CV洗涤柱
用30％乙醇溶液3CV洗涤柱子，每个70ml收集一瓶。用HPLC
装一根高约10cm，直径2cm的HP-C18层析柱，用盐酸配制pH值
的酸水处理柱子。将上一步合并的部分减压真空旋蒸浓缩，调pH
HPLC
液，测
述滤液
子；再
检测，将有较多甲氧基头孢菌素C的部分合并，纯度为23％。
为3.5
值3.5
洗涤柱
一管，
HPLC
后，上柱，流速为1ml/min。用盐酸配制的pH值为3.5的酸水3CV
子，除去杂质；然后用1％的乙醇溶液3CV洗涤，每隔15ml收集
HPLC检测；再用4％的乙醇溶液4CV洗涤，每10ml收集一管，
检测。
将纯度较高的部分合并，最后合并液的纯度为92％，收率为62％。
实施例3
取转化液500ml，其中7α-甲氧基头孢菌素C的含量约为0.15mg/ml，
装一根高约20cm，直径5cm的HZ-816大孔吸附树脂层析柱，将上
以6ml/min的流速过柱，用盐酸配制的pH3.5的酸水3CV洗涤柱
用15％乙醇溶液3CV洗涤柱子，每个70ml收集一瓶。用HPLC
将有较多甲氧基头孢菌素C的部分合并，纯度为20％。
装一根高约10cm，直径2cm的DYB7130(调和粒径5μm)层析柱，
配制pH值为3.5的酸水处理柱子。将上一步合并的部分减压真空
缩，调pH值3.5后，上柱，流速为0.8ml/min。用盐酸配制的pH
3.5的酸水3CV洗涤柱子，除去杂质；然后用3％的甲醇溶液3CV
HPLC纯度约为5％，在转化液中加入25ml冰醋酸，混匀后过滤，取滤
液，测得pH值为3.6，无需再调节pH值。
述滤液
子；再
检测，
用盐酸
旋蒸浓
值为
洗涤，
每每隔15ml收集一管，HPLC检测；再用6％的甲醇溶液4CV洗涤，
10ml收集一管，HPLC检测。
将纯度较高的部分合并，最后合并液的纯度为92％，收率为64％。
实施例4
取转化液500ml，其中7α-甲氧基头孢菌素C的含量约为0.2mg/ml，
纯度约为6％，在转化液中加入25ml冰醋酸，混匀后过滤，取滤
HPLC
液，测
得pH值为3.5，无需再调节pH值。
装一根高约20cm，直径5cm的HZ-803大孔吸附树脂层析柱，将上
述滤液以7ml/min的流速过柱，用盐酸配制的pH3.5的酸水
子；再用20％乙醇溶液3CV洗涤柱子，每个70ml收集一瓶。
检测，将有较多甲氧基头孢菌素C的部分合并，纯度为22％。
3CV洗涤柱
用HPLC
装一根高约10cm，直径2cm的DYB7130(调和粒径40μm)层析柱，
配制pH值为3.5的酸水处理柱子。将上一步合并的部分减压真空
缩，调pH值3.5后，上柱，流速为0.8ml/min。用盐酸配制的pH
3.5的酸水3CV洗涤柱子，除去杂质；然后用3％的甲醇溶液3CV
用盐酸
旋蒸浓
值为
洗涤，
每个每隔15ml收集一管，HPLC检测；再用7％的甲醇溶液4CV洗涤，
10ml收集一管，HPLC检测。
将纯度较高的部分合并，最后合并液的纯度为92％，收率为62％。
实施例5
取转化液500ml，其中7α-甲氧基头孢菌素C的含量约为0.2mg/ml，
纯度约为5％，在转化液中加入25ml冰醋酸，混匀后过滤，取滤
得pH值为3.6，无需再调节pH值。
装一根高约20cm，直径5cm的HZ-818大孔吸附树脂层析柱，将上
以7ml/min的流速过柱，用盐酸配制的pH3.5的酸水3CV洗涤柱
用35％乙醇溶液3CV洗涤柱子，每个70ml收集一瓶。用HPLC
将有较多甲氧基头孢菌素C的部分合并，纯度为20％。
HPLC
液，测
述滤液
子；再
检测，
装一根高约10cm，直径2cm的DYB7130(调和粒径20μm)层析柱，
配制pH值为3.5的酸水处理柱子。将上一步合并的部分减压真空
缩，调pH值3.5后，上柱，流速为1ml/min。用盐酸配制的pH
3.5的酸水3CV洗涤柱子，除去杂质；然后用2％的乙醇溶液3CV
每隔15ml收集一管，HPLC检测；再用4％的乙醇溶液4CV洗涤，
10ml收集一管，HPLC检测。
将纯度较高的部分合并，最后合并液的纯度为90％，收率为65％。
实施例6
取转化液500ml，其中7α-甲氧基头孢菌素C的含量约为0.2mg/ml，
纯度约为5％，在转化液中加入25ml冰醋酸，混匀后过滤，取滤
液，测得pH值为3.4，无需再调节pH值。
装一根高约20cm，直径5cm的XAD-16N大孔吸附树脂层析柱，将
液以7ml/min的流速过柱，用盐酸配制的pH3.5的酸水3CV洗涤
再用30％乙醇溶液3CV洗涤柱子，每个70ml收集一瓶。用HPLC
将有较多甲氧基头孢菌素C的部分合并，纯度为19％。
装一根高约10cm，直径2cm的DYB7219(调和粒径5μm)层析柱，
配制pH值为3.5的酸水处理柱子。将上一步合并的部分减压真空
缩，调pH值3.5后，上柱，流速为1ml/min。用盐酸配制的pH
3.5的酸水3CV洗涤柱子，除去杂质；然后用2％的甲醇溶液3CV
每隔15ml收集一管，HPLC检测；再用5％的甲醇溶液4CV洗涤，
10ml收集一管，HPLC检测。
将纯度较高的部分合并，最后合并液的纯度为93％，收率为62％。
用盐酸
旋蒸浓
值为
洗涤，
每
HPLC
上述滤
柱子；
检测，
用盐酸
旋蒸浓
值为
洗涤，
每
实施例7
取转化液500ml，其中7α-甲氧基头孢菌素C的含量约为0.2mg/ml，
纯度约为4％，在转化液中加入25ml冰醋酸，混匀后过滤，取滤
得pH值为3.5，无需再调节pH值。
装一根高约20cm，直径5cm的XAD-1600N大孔吸附树脂层析柱，
滤液以7ml/min的流速过柱，用盐酸配制的pH3.5的酸水3CV洗
再用20％乙醇溶液3CV洗涤柱子，每个70ml收集一瓶。用HPLC
将有较多甲氧基头孢菌素C的部分合并，纯度为23％。
装一根高约10cm，直径2cm的DYB7219(调和粒径50μm)层析柱，
配制pH值为3.5的酸水处理柱子。将上一步合并的部分减压真空
缩，调pH值3.5后，上柱，流速为1ml/min。用盐酸配制的pH
3.5的酸水3CV洗涤柱子，除去杂质；然后用2％的乙醇溶液3CV
每隔15ml收集一管，HPLC检测；再用4％的乙醇溶液4CV洗涤，
10ml收集一管，HPLC检测。
将纯度较高的部分合并，最后合并液的纯度为91％，收率为64％。
实施例8
取转化液500ml，其中7α-甲氧基头孢菌素C的含量约为0.2mg/ml，
纯度约为7％，在转化液中加入25ml冰醋酸，混匀后过滤，取滤
得pH值为3.5，无需再调节pH值。
装一根高约20cm，直径5cm的XAD-1180N大孔吸附树脂层析柱，
HPLC
液，测
将上述
涤柱子；
检测，
用盐酸
旋蒸浓
值为
洗涤，
每
HPLC
液，测
将上述
滤液以7ml/min的流速过柱，用盐酸配制的pH3.5的酸水3CV洗
再用25％乙醇溶液3CV洗涤柱子，每个70ml收集一瓶。用HPLC
将有较多甲氧基头孢菌素C的部分合并，纯度为20％。
装一根高约10cm，直径2cm的DYB7219(调和粒径20μm)层析柱，
配制pH值为3.5的酸水处理柱子。将上一步合并的部分减压真空
缩，调pH值3.5后，上柱，流速为1ml/min。用盐酸配制的pH
3.5的酸水3CV洗涤柱子，除去杂质；然后用3％的甲醇溶液3CV
每隔15ml收集一管，HPLC检测；再用6％的甲醇溶液4CV洗涤，
10ml收集一管，HPLC检测。
将纯度较高的部分合并，最后合并液的纯度为91％，收率为64％。
涤柱子；
检测，
用盐酸
旋蒸浓
值为
洗涤，
每
2024年4月26日发(作者：佛妮子)
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(21)申请号 CN2.9
(22)申请日 2012.05.21
(71)申请人 上海医药工业研究院;中国医药工业研究总院
地址 200040 上海市静安区北京西路1320号
(72)发明人 陈代杰 李继安 邵雷 黄娟娟 陈舟舟
(74)专利代理机构 北京市金杜律师事务所
代理人 陈长会
(51)
C07D501/57
C07D501/12
(10)申请公布号 CN 103421025 A
(43)申请公布日 2013.12.04
权利要求说明书 说明书 幅图
(54)发明名称
制备7α-甲氧基头孢菌素C的方法
(57)摘要
本发明公开一种制备7α-甲氧基头
孢菌素C的方法，其特征在于所述方法包
括通过转化液前处理、吸附树脂层析处理
和反相硅胶柱层析处理，从将头孢菌素C
底物转化为7α-甲氧基头孢菌素C的转化
液中制备7α-甲氧基头孢菌素C的步骤。
所述方法不仅工艺简单，能够很好的去除
结构十分类似的转化底物、中间产物等杂
质，且获得甲氧基头孢菌素C的收率和纯
度都很高。
法律状态
法律状态公告日
2022-05-06
法律状态信息
未缴年费专利权终止IPC(主分
类):C07D 501/57专利
号:ZL2申请
日:20120521授权公告
日:20160511
法律状态
专利权的终止
权 利 要 求 说 明 书
1.制备7α-甲氧基头孢菌素C的方法，其特征在于所述方法包括通
过转化液前处理、吸附树脂层析处理和反相硅胶柱层析处理，从将头孢
菌素C底物转化为7α-甲氧基头孢菌素C的转化液中制备7α-甲氧基
菌素C的步骤。 头孢
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述转化液前处理包括如
下步骤：
在每毫升转化液中加入30-70μl的冰醋酸混匀，抽滤取澄清的滤液，
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述吸附树脂层析处
将所述上柱母液通过大孔吸附树脂层析柱，获得浓缩液；用pH为
理包括如下步骤：
用酸调pH值为3.0-5.0，获得上柱母液。
2.5-4.5的酸水洗涤柱子2-6CV；然后用含10％-40％的低脂肪醇水溶液，
2-5CV洗脱柱子，分步收集并HPLC检测流出液；将7α-甲氧基头孢
C HPLC纯度大于15％的收集瓶合并，调pH3.0-5.0，减压真
获得浓缩液。
菌素
空旋蒸浓缩
4.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于所述反相硅胶柱层析
处理包括如下步骤：
用pH值为3.0-5.0的酸水预处理十八烷基键合硅胶层析柱，并将所
述浓缩液缓慢通过上述C18反相硅胶柱；然后用pH值为3.0-5.0的酸水
洗涤柱子3-4CV；再用加入含1％-3％甲醇或乙醇的水溶液，2-4CV
柱子，分步收集并HPLC检测流出液，然后用含4％-8％甲醇
溶液，3-8CV洗脱柱子，分步收集并HPLC检测；将纯
集瓶合并，减压真空旋蒸浓缩后冻干，制得7α-
型粉末。
洗脱
或乙醇的水
度大于85％的收
甲氧基头孢菌素C无定
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述酸为盐酸或硫酸。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述pH值调为3.0-4.5。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述低脂肪醇为甲醇、乙
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述大孔吸附树脂为聚苯
醇、丙酮或异丙醇。
乙烯-二乙烯苯型大网格中等极性树脂，其比表面积≥300m2/g，
为，调和粒径250-840μm。 特征孔径
9.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述酸水为pH为
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述酸水的pH值为
11.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述10％-40％低级脂肪
12.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述十八烷基键合硅胶
13.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述含1％-3％甲醇或乙
14.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述层析柱高径比
醇的水溶液中，醇浓度为1％-2％乙醇或2％-3％甲醇；所述含4％-8％甲醇
或乙醇的水溶液中，醇浓度为4％-5％乙醇或4％-7％甲醇。
的填料为球形亲水型，特征孔径为，调和粒径为5-70μm。
醇水溶液为在蒸馏水或去离子水中加入体积为10％-40％的醇而制备。
3.0-4.0。
2.5-4.5的水溶液，所述酸为硫酸或盐酸。
大于等于3∶1。
说 明 书
技术领域
本发明属于制药工程领域，具体涉及一种制备高纯度7α-甲氧基头孢
C(7α-Methoxycephalosporin C)的方法。
背景技术
头孢菌素类抗生素是抗感染药物中发展较早，应用较广的一大类。
20世纪70年代初发展起来的7α-甲氧基头孢菌素(其化学结构式
I)，由于在β-内酰胺环上的C7位有一个反式甲氧基，阻止内酰
酶分子的接近，进而提高了药物对β-内酰胺酶的稳定性。对于这
的研究是最近发展比较迅速的一个前沿领域。
甲氧头孢菌素类抗生素已有多种产品上市，包括头孢米诺、头孢美
这类药物共同的半合成中间体为甲氧基头孢菌素。甲氧基头孢菌
成一般可以通过化学合成法和微生物转化法。化学法是目前业内
用的方法，主要研究方向都是以7-ACA为原料进行合成，例如中
CN2.6报道了以7-ACA为原料，和甲巯四氮唑反应
7-TMCA，7-TMCA和甲基硫溴进行亚胺化反应，然后与二苯重氮
应得到中间体，中间体和甲基化试剂甲基化反应，得到可以用于
氧头孢类药物的中间体7-MAC。另外，中国专利CN101210019A
唑等。
素的合
普遍采
国专利
得到
甲烷反
合成甲
其中于
如下式
胺环与
类药物
菌素
报道了以C4，7位保护、C3位卤甲基的头孢化合物为原料，
头孢菌素中间体。但这些化学合成的方法普遍存在有机溶媒使
能耗严重等问题。而用生物转化的方法可以有效的解决这些问
生物转化得到的甲氧头孢菌素C作为合成甲氧头孢菌素类抗
合成甲氧基
用量大，
题，利用
生素，对于
清洁生产，降低能耗等方面都有显著优势。
文献(The Conversion of Cephalosporins to 7α-Methoxycephalosporins
by Cell-Free Extract of Streptomyces m.J， 1980，
186：613-616)报道利用棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus，
发明内容
为解决现有技术中存在的不足，本发明涉及一种制备高纯度7α-甲氧
菌素C的方法，该方法不仅工艺简单，能够很好的去除结构十分
转化底物、中间产物等杂质，且获得甲氧基头孢菌素C的收率和
很高。
因此，本发明提供一种制备7α-甲氧基头孢菌素C的方法，其特征在 于所述
基头孢
类似的
纯度都
ATCC27064)细胞破碎后的粗酶液，加入辅因子和头孢菌素C底物，转化
得到7α-甲氧基头孢菌素C，但是目前尚无报道从转化体系中将产物7α-
甲氧基头孢菌素C分离纯化的方法。另有文献(Non-radioactive assay and
HPLC analysis of cephalosporin C 7α-methocxylation by cell-free extracts of
Streptomyces Microbiol Biotechnol，1991，35：793-797)报
道化学合成7α-甲氧基头孢菌素C的方法，首先耦合α-二苯甲基-N-t-丁
酮-D-α-氨基己二酯和二苯甲基-7-氨基头孢菌酸酯，得到N-t-丁酮-bis-二
苯甲基酯的CPC，然后以甲醇锂盐作为甲基供体，进行添加甲氧基的反
应，最后脱去羟基和氨基的保护基团，得到7α-甲氧基头孢菌素C。在化
学合成过程中，使用了较多的化学试剂，反应复杂。虽然在化学合成过
程中，通过有机溶剂萃取、旋蒸等步骤可以得到纯度90％以上的7α-甲氧
基头孢菌素C，但是由于生物转化后体系与化学合成体系有很大差异，
因而报道的分离甲氧基头孢菌素C的方法并不适用于从转化产物中纯化
甲氧基头孢菌素C。
方法包括通过转化液前处理、吸附树脂层析处理和反相硅胶柱层
析处理，从将头孢菌素C底物转化为7α-甲氧基头孢菌素C的
制备7α-甲氧基头孢菌素C的步骤。 转化液中
根据本发明的一个优选的实施方式，所述方法包括下列步骤：
a)在每毫升转化液中加入30-70μl的冰醋酸混匀，使转化液中的大部
变性沉淀，抽滤取澄清的滤液，用酸调pH值为3.0-5.0，即为上
b)将获得的上柱母液缓慢通过大孔吸附树脂层析柱；用pH为2.5-4.5
洗涤柱子2-6CV(柱体积)；然后用含10％-40％(v∶v)、优选
低脂肪醇的水溶液，2-5CV洗脱柱子，分步收集并HPLC
分蛋白
柱母液；
的酸水
15-30％(v∶v)
检测流出液；
调pH3.0-5.0，将7α-甲氧基头孢菌素C HPLC纯度大于15％的收集瓶合并，
减压真空旋蒸浓缩获得浓缩液。
c)用pH值为3.0-5.0的酸水预处理十八烷基(C18)键合硅胶层析柱，
中得到的浓缩液缓慢通过上述C18反相硅胶柱；然后用pH值为
的酸水洗涤柱子3-4CV；再用加入含1％-3％(v∶v)甲醇或乙醇
液，2-4CV洗脱柱子，分步收集并HPLC检测流出液，然后用含
并将b)
3.0-5.0
的水溶
4％-8％
将纯度
基头孢
甲醇或乙醇的水溶液，3-8CV洗脱柱子，分步收集并HPLC检测；
大于85％的收集瓶合并，减压真空旋蒸浓缩后冻干，制得7α-甲氧
菌素C无定型粉末。
本发明方法a)步骤中所用的酸为盐酸或者硫酸，优选为盐酸。
本发明方法a)步骤中转化液抽滤取滤液后，优选pH值调为3.0-4.5。
本发明方法a)步骤中低脂肪醇为甲醇、乙醇、丙酮或异丙醇，优选
或乙醇。
本发明方法b)步骤中大孔吸附树脂为市售常用聚苯乙烯-二乙烯苯
为甲醇
型大网
格中等极性树脂，其比表面积≥300m2/g，特征孔径为调和粒径250-
840μm。优选上海华震科技有限公司HZ-816，HZ-803，
脂，罗门哈斯公司XAD-16N、XAD-16HP、XAD1600N、
XAD-4或者XAD-18型树脂，最优选为XAD-18树脂。
本发明中，术语“调和粒径”的定义为混合颗粒中，所有颗粒的平
本发明方法b)、c)步骤中的酸水指含有少量酸的水溶液，此酸为硫
本发明方法b)、c)步骤中所述酸水为pH为2.5-4.5、优选3.0-4.0
液。
本发明方法b)步骤中所述10％-40％低级脂肪醇水溶液为在蒸馏水或
水中加入体积为10％-40％的醇而制备；所述15％-30％低级脂肪醇
为在蒸馏水或去离子水中加入体积为15％-30％的醇而制备。
本发明方法c)步骤中十八烷基(C18)键合硅胶填料为球形亲水型，特
为调和粒径为5-70μm。优选苏州赛分科技有限公司填
上海大有色谱技术服务有限公司填料DYB7130、
本发明方法c)步骤中所述含1％-3％(v∶v)甲醇或乙醇的水溶液中 优选醇
高于之
征孔径
去离子
水溶液
的水溶
酸或盐酸，优选为盐酸。
均直径。
HZ-818型树
XAD1180、
料Bio-C8，HP-C18；
DYB7219。
浓度为1％-2％的乙醇或醇浓度为2％-3％的甲醇；所述4％-8％(略
前的浓度)甲醇或乙醇的水溶液中优选醇浓度为4％-5％的乙醇或
为4％-7％的甲醇。
本发明方法b)、c)步骤中使用的层析柱高径比大于等于3∶1。
醇浓度
本发明方法中步骤b)主要作用在于除去转化液中的蛋白质，盐类， 色素等
一些不与树脂吸附的杂质，这对于提高步骤c)的分离效果很有帮
本发明步骤c)中用低浓度的低脂肪醇来洗脱目的产物，能够很好地
他强极性杂质，且能够很好的将甲氧基头孢菌素C与转化的底物、
物进行分离，得到的目的产物纯度较高。
本发明的方法简单易行，树脂和反相硅胶填料可反复使用，再生方
用的有机溶剂量少且可循环回收，且获得的目的产物的纯度很高。
附图说明
图1为底物头孢菌素C转化为7α-甲氧基头孢菌素C的过程；
图2为实施例1获得的7α-甲氧基头孢菌素C(HPLC纯度97.6％)
液相色谱(HPLC)图谱(图中7α-甲氧基头孢菌素C出峰时间为
图3为实施例1获得的7α-甲氧基头孢菌素C(HPLC纯度97.6％)
的质谱图谱；
图4为实施例1获得的7α-甲氧基头孢菌素C(HPLC纯度97.6％)
H1谱。
助。
除去其
中间产
便，使
的高效
17.4min)；
的核磁
具体实施方式
本发明7α-甲氧基头孢菌素C HPLC检测条件如下：
色谱柱：柱Ultimate AQ-C18，5μm，250×4.6mm；
检测波长：272nm；
柱温：30℃；
流速：0.8ml/min；
流动相：A相：1L水中加入2.4ml甲酸，0.77g乙酸铵
B相：1L乙腈中加入2ml甲酸
本发明所使用的菌体生长条件如下：
菌种：Streptomyces clavuligerus ATCC27064(NRRL3585)
斜面培养
培养基(g/L)：麦芽提取物10，酵母提取物4，葡萄糖4，琼脂25，
7.4，121℃灭菌30min；
培养条件：28℃培养7-10天。
pH7.0-
种子培养
培养基(g/L)：葡萄糖10，进口蛋白胨10，进口酵母提取物5，
灭菌20min；
培养条件：28℃，250rpm，培养2天。
本发明所使用的转化条件如下：
棒状链霉菌Streptomyces clavuligerus ATCC27064在种子培养基中培
将冻存的菌体每克加入10ml磷酸盐缓冲液(pH7.4)，融后超声破
为初酶液，加入辅因子2-酮戊二酸(终浓度2mM)、L-抗坏血酸
壁，作
(终浓
121℃
养2天后抽滤收集菌体，并用去离子水洗涤后，放-20℃冻存。
度1mM)、FeSO4(终浓度1mM)、S-腺苷甲硫氨酸(SAM，
实施例1
取转化液500ml，其中7α-甲氧基头孢菌素C的含量约为0.2mg/ml，
纯度约为7％，在转化液中加入25ml冰醋酸，混匀后过滤，取滤
得pH值为3.5，无需再调节pH值。
装一根高约20cm，直径5cm的XAD-18大孔吸附树脂层析柱，将上
以7ml/min的流速过柱，用盐酸配制的pH3.5的酸水3CV洗涤柱
用20％乙醇溶液3CV洗涤柱子，每个70ml收集一瓶。用HPLC
述滤液
子；再
检测，
HPLC
液，测
终浓度1mM)以及底物头孢菌素C(终浓度500μg/ml)混匀，恒温振荡
转化(28℃，240r/min)4到6h。
将甲氧基头孢菌素C含量较高的收集瓶合并，纯度为24％。
装一根高约10cm，直径2cm的Bio-C18层析柱，用盐酸配制pH值
的酸水处理柱子。将上一步合并的部分减压真空旋蒸浓缩，调pH
为3.5
值3.5
洗涤柱
一管，
HPLC
后，上柱，流速为1ml/min。用盐酸配制的pH值为3.5的酸水3CV
子，除去杂质；然后用2％的甲醇溶液3CV洗涤，每隔15ml收集
HPLC检测；再用4％的甲醇溶液4CV洗涤，每10ml收集一管，
检测。
将纯度较高的部分合并，最后合并液的纯度为90％，收率为65％。
实施例2
取转化液500ml，其中7α-甲氧基头孢菌素C的含量约为0.2mg/ml，
纯度约为6％，在转化液中加入25ml冰醋酸，混匀后过滤，取滤
得pH值为3.6，无需再调节pH值。
装一根高约20cm，直径5cm的XAD-4大孔吸附树脂层析柱，将上
以7ml/min的流速过柱，用盐酸配制的pH3.5的酸水3CV洗涤柱
用30％乙醇溶液3CV洗涤柱子，每个70ml收集一瓶。用HPLC
装一根高约10cm，直径2cm的HP-C18层析柱，用盐酸配制pH值
的酸水处理柱子。将上一步合并的部分减压真空旋蒸浓缩，调pH
HPLC
液，测
述滤液
子；再
检测，将有较多甲氧基头孢菌素C的部分合并，纯度为23％。
为3.5
值3.5
洗涤柱
一管，
HPLC
后，上柱，流速为1ml/min。用盐酸配制的pH值为3.5的酸水3CV
子，除去杂质；然后用1％的乙醇溶液3CV洗涤，每隔15ml收集
HPLC检测；再用4％的乙醇溶液4CV洗涤，每10ml收集一管，
检测。
将纯度较高的部分合并，最后合并液的纯度为92％，收率为62％。
实施例3
取转化液500ml，其中7α-甲氧基头孢菌素C的含量约为0.15mg/ml，
装一根高约20cm，直径5cm的HZ-816大孔吸附树脂层析柱，将上
以6ml/min的流速过柱，用盐酸配制的pH3.5的酸水3CV洗涤柱
用15％乙醇溶液3CV洗涤柱子，每个70ml收集一瓶。用HPLC
将有较多甲氧基头孢菌素C的部分合并，纯度为20％。
装一根高约10cm，直径2cm的DYB7130(调和粒径5μm)层析柱，
配制pH值为3.5的酸水处理柱子。将上一步合并的部分减压真空
缩，调pH值3.5后，上柱，流速为0.8ml/min。用盐酸配制的pH
3.5的酸水3CV洗涤柱子，除去杂质；然后用3％的甲醇溶液3CV
HPLC纯度约为5％，在转化液中加入25ml冰醋酸，混匀后过滤，取滤
液，测得pH值为3.6，无需再调节pH值。
述滤液
子；再
检测，
用盐酸
旋蒸浓
值为
洗涤，
每每隔15ml收集一管，HPLC检测；再用6％的甲醇溶液4CV洗涤，
10ml收集一管，HPLC检测。
将纯度较高的部分合并，最后合并液的纯度为92％，收率为64％。
实施例4
取转化液500ml，其中7α-甲氧基头孢菌素C的含量约为0.2mg/ml，
纯度约为6％，在转化液中加入25ml冰醋酸，混匀后过滤，取滤
HPLC
液，测
得pH值为3.5，无需再调节pH值。
装一根高约20cm，直径5cm的HZ-803大孔吸附树脂层析柱，将上
述滤液以7ml/min的流速过柱，用盐酸配制的pH3.5的酸水
子；再用20％乙醇溶液3CV洗涤柱子，每个70ml收集一瓶。
检测，将有较多甲氧基头孢菌素C的部分合并，纯度为22％。
3CV洗涤柱
用HPLC
装一根高约10cm，直径2cm的DYB7130(调和粒径40μm)层析柱，
配制pH值为3.5的酸水处理柱子。将上一步合并的部分减压真空
缩，调pH值3.5后，上柱，流速为0.8ml/min。用盐酸配制的pH
3.5的酸水3CV洗涤柱子，除去杂质；然后用3％的甲醇溶液3CV
用盐酸
旋蒸浓
值为
洗涤，
每个每隔15ml收集一管，HPLC检测；再用7％的甲醇溶液4CV洗涤，
10ml收集一管，HPLC检测。
将纯度较高的部分合并，最后合并液的纯度为92％，收率为62％。
实施例5
取转化液500ml，其中7α-甲氧基头孢菌素C的含量约为0.2mg/ml，
纯度约为5％，在转化液中加入25ml冰醋酸，混匀后过滤，取滤
得pH值为3.6，无需再调节pH值。
装一根高约20cm，直径5cm的HZ-818大孔吸附树脂层析柱，将上
以7ml/min的流速过柱，用盐酸配制的pH3.5的酸水3CV洗涤柱
用35％乙醇溶液3CV洗涤柱子，每个70ml收集一瓶。用HPLC
将有较多甲氧基头孢菌素C的部分合并，纯度为20％。
HPLC
液，测
述滤液
子；再
检测，
装一根高约10cm，直径2cm的DYB7130(调和粒径20μm)层析柱，
配制pH值为3.5的酸水处理柱子。将上一步合并的部分减压真空
缩，调pH值3.5后，上柱，流速为1ml/min。用盐酸配制的pH
3.5的酸水3CV洗涤柱子，除去杂质；然后用2％的乙醇溶液3CV
每隔15ml收集一管，HPLC检测；再用4％的乙醇溶液4CV洗涤，
10ml收集一管，HPLC检测。
将纯度较高的部分合并，最后合并液的纯度为90％，收率为65％。
实施例6
取转化液500ml，其中7α-甲氧基头孢菌素C的含量约为0.2mg/ml，
纯度约为5％，在转化液中加入25ml冰醋酸，混匀后过滤，取滤
液，测得pH值为3.4，无需再调节pH值。
装一根高约20cm，直径5cm的XAD-16N大孔吸附树脂层析柱，将
液以7ml/min的流速过柱，用盐酸配制的pH3.5的酸水3CV洗涤
再用30％乙醇溶液3CV洗涤柱子，每个70ml收集一瓶。用HPLC
将有较多甲氧基头孢菌素C的部分合并，纯度为19％。
装一根高约10cm，直径2cm的DYB7219(调和粒径5μm)层析柱，
配制pH值为3.5的酸水处理柱子。将上一步合并的部分减压真空
缩，调pH值3.5后，上柱，流速为1ml/min。用盐酸配制的pH
3.5的酸水3CV洗涤柱子，除去杂质；然后用2％的甲醇溶液3CV
每隔15ml收集一管，HPLC检测；再用5％的甲醇溶液4CV洗涤，
10ml收集一管，HPLC检测。
将纯度较高的部分合并，最后合并液的纯度为93％，收率为62％。
用盐酸
旋蒸浓
值为
洗涤，
每
HPLC
上述滤
柱子；
检测，
用盐酸
旋蒸浓
值为
洗涤，
每
实施例7
取转化液500ml，其中7α-甲氧基头孢菌素C的含量约为0.2mg/ml，
纯度约为4％，在转化液中加入25ml冰醋酸，混匀后过滤，取滤
得pH值为3.5，无需再调节pH值。
装一根高约20cm，直径5cm的XAD-1600N大孔吸附树脂层析柱，
滤液以7ml/min的流速过柱，用盐酸配制的pH3.5的酸水3CV洗
再用20％乙醇溶液3CV洗涤柱子，每个70ml收集一瓶。用HPLC
将有较多甲氧基头孢菌素C的部分合并，纯度为23％。
装一根高约10cm，直径2cm的DYB7219(调和粒径50μm)层析柱，
配制pH值为3.5的酸水处理柱子。将上一步合并的部分减压真空
缩，调pH值3.5后，上柱，流速为1ml/min。用盐酸配制的pH
3.5的酸水3CV洗涤柱子，除去杂质；然后用2％的乙醇溶液3CV
每隔15ml收集一管，HPLC检测；再用4％的乙醇溶液4CV洗涤，
10ml收集一管，HPLC检测。
将纯度较高的部分合并，最后合并液的纯度为91％，收率为64％。
实施例8
取转化液500ml，其中7α-甲氧基头孢菌素C的含量约为0.2mg/ml，
纯度约为7％，在转化液中加入25ml冰醋酸，混匀后过滤，取滤
得pH值为3.5，无需再调节pH值。
装一根高约20cm，直径5cm的XAD-1180N大孔吸附树脂层析柱，
HPLC
液，测
将上述
涤柱子；
检测，
用盐酸
旋蒸浓
值为
洗涤，
每
HPLC
液，测
将上述
滤液以7ml/min的流速过柱，用盐酸配制的pH3.5的酸水3CV洗
再用25％乙醇溶液3CV洗涤柱子，每个70ml收集一瓶。用HPLC
将有较多甲氧基头孢菌素C的部分合并，纯度为20％。
装一根高约10cm，直径2cm的DYB7219(调和粒径20μm)层析柱，
配制pH值为3.5的酸水处理柱子。将上一步合并的部分减压真空
缩，调pH值3.5后，上柱，流速为1ml/min。用盐酸配制的pH
3.5的酸水3CV洗涤柱子，除去杂质；然后用3％的甲醇溶液3CV
每隔15ml收集一管，HPLC检测；再用6％的甲醇溶液4CV洗涤，
10ml收集一管，HPLC检测。
将纯度较高的部分合并，最后合并液的纯度为91％，收率为64％。
涤柱子；
检测，
用盐酸
旋蒸浓
值为
洗涤，
每