2024年5月7日发(作者：李衍)
毕赤酵母的摇瓶发酵方法：
一、 摇瓶发酵方法
:
毕赤酵母摇瓶发酵方法分为两个阶段，
1
、酵母菌株生长阶段；
2
、 脂肪酶 诱导表达阶段。
1
、 酵母生长阶段。
准备试剂：
1000ml BMGY
培养基，
1000ml BMM
培养基，
10X
的甲醇，摇瓶
1L
（灭
菌），温控摇床，
50ml
离心管（灭菌）。紫外分光光度计，石英比色皿。 以下所有
操作均在超净台内或者无菌条件下完成。
（
1
） 往灭好菌的
IL
摇瓶中加入
100mlBMG
培养基，然后加入约
1ml
脂肪酶菌 株
（培养基：菌液
=100
：
1
），用透气膜封口（透气，但是细菌不能透过） 。
0
置于温控摇床上，温度调至
30C
，转速为
250-300rpm/min
，使酵母生长，
OD
600
=2.0-6.0
，时间约为
15-24
小时。
（
2
） 将发酵液转入
50ml
离心管，
1500g-3000g
离心
5min
。去掉上清，用
BMMY
培
养基将菌体浓度稀释至
OD
0°
=1.0
，约有
500ml
左右。将稀释后的发酵液 分别
加入到
1L
的药瓶中，每个摇瓶
150ml
发酵液（绝不能超过
200ml
）。
0
（
3
） 将摇瓶置于温控摇床上，温度调至
30C
，转速为
250-300rpm/min
，使酵 母
表达脂肪酶，每
24
小时加入一次
5%
的甲醇，使甲醇的终浓度为
0.5%
。 连续
诱导表达
48
小时。
（
4
） 将发酵液进行
12000rpm/min
离心
5min
，取上清（若上清仍混浊，可反复 离
心）；进行酶活分析和蛋白含量分析。
BMG
培养基的配制（
1000ml
）:
20g
蛋白胨（
peptone
）
,10g
酵母提取物（
Yeast
Extract
）
,
加水至
700ml
;
121
°
C
高温灭菌
20min
。然后分别在无菌条件下加入
10X
YNB 100ml, 10X
磷酸钾缓冲液（
PH6.0
）
100ml
，
10X
甘油
100ml
。
BMM
培养基的配制方法（
1000ml
）：
20g
蛋白胨（
peptone
）
,10g
酵母提取物
，
加 水
0
至
700ml
；
121C
高温灭菌
20min
。然后分别在无菌条件下加入
10XYNB100ml
,
10X
磷
酸钾缓冲液（
PH6.0
）
100ml
，
10X
甲醇
100ml
。
10X
的甲醇的配制：取甲醇（
AR
上海医药集团有限公司）
5ml
，加入无菌水
95ml
， 配
置成
5%
勺甲醇溶液，用
0.22
卩
M
的微孔滤膜（
millipore
公司）过滤除菌，该 溶液
在常温下的保质期为两个月。
10X
的
YNE
配制方法
（1000ml）
:称取
YNB（
生化试剂，上海生物工程公司，不含
硫酸铵）
34g，
加入
100g
硫酸铵，待完全溶解后，用
0.22
卩
M
的微孔滤膜
（
millipore
公司）过滤除菌。该溶液在常温下的保质期可以达
1
年。
10X
的磷酸缓冲液的配制方法：分别配制
1M
的
&HPO
和
KHPQ
,然后将
132ml
0
的
K
2
HPQ
和
868ml
的
KHPQ
混合，调节
PH
至
6.0
;调
PH
用磷酸或者
KQH
然后
121C
高
温灭菌
20min
。该溶液在常温下的保质期可以达
1
年以上。
0
10X
的甘油的配制方法（
1000ml
）：取
100ml
的甘油加水至
1000ml
，然后
121C
高温
灭菌
20min
。该溶液在常温下的保质期可以达
1
年以上。
5
．问：在下是初学者，关于毕赤酵母的诱导表达有些问题：
每
24h
向培养基中添加
100
%甲醇至终浓度为
制？
还有，关于
BMMY
的甲醇浓度有些材料里的是
0.5%
，有的是
1 .0%
，应该是哪个？ “每
0.5
〜
1.0%”
这里的甲醇浓度如何控
24h
向培养基中添加
100
%甲醇至终浓度为
0.5
〜
1.0%
”这里的甲醇浓度和
BMMY
中的甲 醇浓度是
要一致的吗？
另外一个小问题，配
参考见解
1
：
10%
甘油时，移入量筒的
1 00%
甘油一部分会粘在管壁上，难免
最后配成的
10%
甘油会有所偏差，这样要不要紧？操作上是否有问题？
k4N*vx1 ~
“每
24h
向培养基中添加
100
%甲醇至终浓度为
0.5
〜
1.0%
” 我可以给你解释一下：
#qbk! 40Vh5o*UF
1
、它的意思是每隔
24
小时，不断的添加 纯甲醇（指的是甲醇试剂含有
100
%甲醇，
不含有其他的成分） 至终浓度为
0.5
〜
1.0%
，指的是添加的甲醇占总体积的
0.5
〜
1.0%
（即
每
100
升培养基含有甲醇
0.5
〜
1.0
升，如果是质量体积比则是每
100
毫升培养基含有甲醇
0.5
〜
1.0
克）
2
、只要你添加的量在以上的这个范围就可以，
当然可以根据实验的实际情况进行调整，
但是一般要在此范围内。
&m9~5k&&b@* 8w
3
、 配
10%
甘油时，注意先加入部分水后在称取甘油加入，然后在定容到所需要的体 积，这样
就可以避免甘油粘在管壁上， 甘油易溶于水， 配好后， 再粘在管壁上就不会影响了。
4
、 建议你对实验的基础知识多多学习，你会又很大进步的！
参考见解
2
：
5 44LbP9
！
&Gh*1AM8
1
、如何确保加入后甲醇浓度在此范围内？你可以进行检测啊！ 只要检测你的培养基中 剩余的
甲醇含量即可，可以计算出你应该加多少甲醇，
24
小时可以检测一次。
wM7Eq&W&6RM7 0Q8M
2
、至于为什么
24
小时加一次，具体原因我不是很清楚，但是我觉得应该是发酵中
（
尤 其是
发酵瓶）培养基的体积太小，不能太多的取样，取样太多会影响体积、蒸发量、无菌等 指标的。而且
在这个时间内酵母在甲醇终浓度为
0.5
〜
1.0%
中生长在其许可范围内，其甲 醇消耗不会超过这个范
围的，时间安排也比较合理，所以可能是个经验值吧！ ！其实不需要
考虑甲醇的消耗， 只要检测它的剩余即可， 根据剩余可以计算出你需要加入的甲醇体积或者
3
、 另外你不一定一次就加入，可以连续的在
发酵罐还可以，摇瓶怎么办呢！ ！
2w“
24
小时加入，不过操作就非常麻烦了，
4
、 至于一定时间从中取出
1ml
,这个变化应该不需要要计算进去的吧，你取样的浓度 和你培
养基里面的是一样的， 如果这考虑进去的话， 那么蒸发量、 两种液体混合的体积变化、 湿度等等你
也要考虑，就太繁了，他们的影响很小的，没有必要计算在内。
2024年5月7日发(作者：李衍)
毕赤酵母的摇瓶发酵方法：
一、 摇瓶发酵方法
:
毕赤酵母摇瓶发酵方法分为两个阶段，
1
、酵母菌株生长阶段；
2
、 脂肪酶 诱导表达阶段。
1
、 酵母生长阶段。
准备试剂：
1000ml BMGY
培养基，
1000ml BMM
培养基，
10X
的甲醇，摇瓶
1L
（灭
菌），温控摇床，
50ml
离心管（灭菌）。紫外分光光度计，石英比色皿。 以下所有
操作均在超净台内或者无菌条件下完成。
（
1
） 往灭好菌的
IL
摇瓶中加入
100mlBMG
培养基，然后加入约
1ml
脂肪酶菌 株
（培养基：菌液
=100
：
1
），用透气膜封口（透气，但是细菌不能透过） 。
0
置于温控摇床上，温度调至
30C
，转速为
250-300rpm/min
，使酵母生长，
OD
600
=2.0-6.0
，时间约为
15-24
小时。
（
2
） 将发酵液转入
50ml
离心管，
1500g-3000g
离心
5min
。去掉上清，用
BMMY
培
养基将菌体浓度稀释至
OD
0°
=1.0
，约有
500ml
左右。将稀释后的发酵液 分别
加入到
1L
的药瓶中，每个摇瓶
150ml
发酵液（绝不能超过
200ml
）。
0
（
3
） 将摇瓶置于温控摇床上，温度调至
30C
，转速为
250-300rpm/min
，使酵 母
表达脂肪酶，每
24
小时加入一次
5%
的甲醇，使甲醇的终浓度为
0.5%
。 连续
诱导表达
48
小时。
（
4
） 将发酵液进行
12000rpm/min
离心
5min
，取上清（若上清仍混浊，可反复 离
心）；进行酶活分析和蛋白含量分析。
BMG
培养基的配制（
1000ml
）:
20g
蛋白胨（
peptone
）
,10g
酵母提取物（
Yeast
Extract
）
,
加水至
700ml
;
121
°
C
高温灭菌
20min
。然后分别在无菌条件下加入
10X
YNB 100ml, 10X
磷酸钾缓冲液（
PH6.0
）
100ml
，
10X
甘油
100ml
。
BMM
培养基的配制方法（
1000ml
）：
20g
蛋白胨（
peptone
）
,10g
酵母提取物
，
加 水
0
至
700ml
；
121C
高温灭菌
20min
。然后分别在无菌条件下加入
10XYNB100ml
,
10X
磷
酸钾缓冲液（
PH6.0
）
100ml
，
10X
甲醇
100ml
。
10X
的甲醇的配制：取甲醇（
AR
上海医药集团有限公司）
5ml
，加入无菌水
95ml
， 配
置成
5%
勺甲醇溶液，用
0.22
卩
M
的微孔滤膜（
millipore
公司）过滤除菌，该 溶液
在常温下的保质期为两个月。
10X
的
YNE
配制方法
（1000ml）
:称取
YNB（
生化试剂，上海生物工程公司，不含
硫酸铵）
34g，
加入
100g
硫酸铵，待完全溶解后，用
0.22
卩
M
的微孔滤膜
（
millipore
公司）过滤除菌。该溶液在常温下的保质期可以达
1
年。
10X
的磷酸缓冲液的配制方法：分别配制
1M
的
&HPO
和
KHPQ
,然后将
132ml
0
的
K
2
HPQ
和
868ml
的
KHPQ
混合，调节
PH
至
6.0
;调
PH
用磷酸或者
KQH
然后
121C
高
温灭菌
20min
。该溶液在常温下的保质期可以达
1
年以上。
0
10X
的甘油的配制方法（
1000ml
）：取
100ml
的甘油加水至
1000ml
，然后
121C
高温
灭菌
20min
。该溶液在常温下的保质期可以达
1
年以上。
5
．问：在下是初学者，关于毕赤酵母的诱导表达有些问题：
每
24h
向培养基中添加
100
%甲醇至终浓度为
制？
还有，关于
BMMY
的甲醇浓度有些材料里的是
0.5%
，有的是
1 .0%
，应该是哪个？ “每
0.5
〜
1.0%”
这里的甲醇浓度如何控
24h
向培养基中添加
100
%甲醇至终浓度为
0.5
〜
1.0%
”这里的甲醇浓度和
BMMY
中的甲 醇浓度是
要一致的吗？
另外一个小问题，配
参考见解
1
：
10%
甘油时，移入量筒的
1 00%
甘油一部分会粘在管壁上，难免
最后配成的
10%
甘油会有所偏差，这样要不要紧？操作上是否有问题？
k4N*vx1 ~
“每
24h
向培养基中添加
100
%甲醇至终浓度为
0.5
〜
1.0%
” 我可以给你解释一下：
#qbk! 40Vh5o*UF
1
、它的意思是每隔
24
小时，不断的添加 纯甲醇（指的是甲醇试剂含有
100
%甲醇，
不含有其他的成分） 至终浓度为
0.5
〜
1.0%
，指的是添加的甲醇占总体积的
0.5
〜
1.0%
（即
每
100
升培养基含有甲醇
0.5
〜
1.0
升，如果是质量体积比则是每
100
毫升培养基含有甲醇
0.5
〜
1.0
克）
2
、只要你添加的量在以上的这个范围就可以，
当然可以根据实验的实际情况进行调整，
但是一般要在此范围内。
&m9~5k&&b@* 8w
3
、 配
10%
甘油时，注意先加入部分水后在称取甘油加入，然后在定容到所需要的体 积，这样
就可以避免甘油粘在管壁上， 甘油易溶于水， 配好后， 再粘在管壁上就不会影响了。
4
、 建议你对实验的基础知识多多学习，你会又很大进步的！
参考见解
2
：
5 44LbP9
！
&Gh*1AM8
1
、如何确保加入后甲醇浓度在此范围内？你可以进行检测啊！ 只要检测你的培养基中 剩余的
甲醇含量即可，可以计算出你应该加多少甲醇，
24
小时可以检测一次。
wM7Eq&W&6RM7 0Q8M
2
、至于为什么
24
小时加一次，具体原因我不是很清楚，但是我觉得应该是发酵中
（
尤 其是
发酵瓶）培养基的体积太小，不能太多的取样，取样太多会影响体积、蒸发量、无菌等 指标的。而且
在这个时间内酵母在甲醇终浓度为
0.5
〜
1.0%
中生长在其许可范围内，其甲 醇消耗不会超过这个范
围的，时间安排也比较合理，所以可能是个经验值吧！ ！其实不需要
考虑甲醇的消耗， 只要检测它的剩余即可， 根据剩余可以计算出你需要加入的甲醇体积或者
3
、 另外你不一定一次就加入，可以连续的在
发酵罐还可以，摇瓶怎么办呢！ ！
2w“
24
小时加入，不过操作就非常麻烦了，
4
、 至于一定时间从中取出
1ml
,这个变化应该不需要要计算进去的吧，你取样的浓度 和你培
养基里面的是一样的， 如果这考虑进去的话， 那么蒸发量、 两种液体混合的体积变化、 湿度等等你
也要考虑，就太繁了，他们的影响很小的，没有必要计算在内。