2024年5月12日发(作者：聂弘文)
黄璃莘，等．莪术对局灶性脑缺血模型大鼠的神经保护作用
学评分，莪术高、中剂量组大鼠神经行为学评分较模型对照
组大鼠有显著的降低，说明莪术在一定程度上能缓解ＭＣＡＯ
・ ８８７ ・
脑梗死和脑水肿程度、降低ＬＤＨ、ＣＫ和Ｇｌｕ含量，其作用机
制可能与保护缺血区脑组织、减轻脑水肿、抗氧自由基、减少
ＥＡＡ毒性有关。对于具体的脑缺血再灌注损伤保护机制有
大鼠因脑缺血所引起的神经损伤。
大量的文献证实Ｅ５，６３，脑水肿在缺血性脑卒中的早期就
会出现，并且会随着脑缺血时间的延长而逐渐加重，在２～４ ｄ
内就会达到峰值。同时脑缺血初期也会伴随着脑梗死，其主
待进一步研究。
参考文献：
Ｐｅｎｄｌｅｂｕｒｙ ＳＴ，Ｒｏｔｈｗｅｌｌ ＰＭ．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ，ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ
ａｎｄｆａｃｔｏｒｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｒｅ—．ｓｔｒｏｋｅ ａｎｄ ｐｏｓｔ—，ｓｔｒｏｋｅ
要的发病机制是脑部供血不足甚至血流中断，引起神经细胞
的损伤。本研究结果表明，与模型对照组相比，莪术能减少
ＭＣＡＯ大鼠大脑脑梗死体积百分比和脑含水量，即可减轻脑
水肿和脑梗死程度，提示莪术对ＭＣＡＯ模型大鼠具有一定
ｄｅｍｅｎｔｉａ：ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｍｅｔａ—ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．
Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ，２００９，８：１００６—１０１８．
的保护作用。
Ｎｉｌｓｓｏｎ等ｌ７ 发现，ＬＤＨ是标志脑组织损害最敏感的酶，
高浓度乳酸与严重脑缺血有很好的相关性，故检测ＬＤＨ含
量不失为一种方法简单、又可初步判断病情和脑梗死面积及
预后的参考方法。有文献报道＿８］，当机体发生缺血性脑卒中
时，脑神经细胞由于长时间缺血缺氧而遭到破坏释放出大量
口
一］ ］ ］
张均田．现代药理试验方法［Ｍ］．北京：北京医科大学、
中国协和医科大学联合出版社，１９９７：１２４１．
Ｚｅａ Ｌｏｎｇａ ＥＬ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ＰＲ，Ｃａｒｌｓｏｎ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｖｅｒｓｉ—
ｂｌｅ ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｒａｎｉｅｃｔｏ—
ｍｙ ｉｎ ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｓｔｒｏｋｅ，１９８９，２０：８１—８４．
Ｆｉｓｈｅｒ Ｍ，Ｆｅｕｅｒｓｔｅｉｎ Ｇ，Ｈｏｗｅｌｌｓ ＤＷ，ｅｔ ａ１．Ｕｐｄａｔｅ ｏｆ
］ ］ ］ ］
的ＣＫ，ＣＫ透过血脑屏障而进入血液，因此ＣＫ可以作为缺
血性脑卒中的特异性诊断指标。兴奋性氨基酸（ＥＡＡ）主要
ｔｈｅ ｓｔｒｏｋｅ ｔｈｅｒａｐｙ ａｃａｄｅｍｉｃ ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｒｏｕｎｄｔａｂｌｅ ｐｒｅ—
ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ［Ｊ￣．Ｓｔｒｏｋｅ，２００９，４０（６）：２２４４—
２２５Ｏ．
为天冬氨酸（Ａｓｐ）和Ｇｌｕ，是机体内含量较高的一种氨基酸，
尤其在脑内的含量较高，是机体中枢神经系统中主要的兴奋
性递质。正常情况下，机体内存在着少量的ＥＡＡ，维持着机
体的兴奋性；一旦细胞外的ＥＡＡ浓度过高，将会导致神经元
的损伤，引起脑组织的病理损害。本研究发现，大鼠ＭＣＡＯ
李燕华，张国威．影响缺血性脑水肿产生的相关因素
ＥＪ］．中国急救医学，２００６，２６（１１）：８４６—８４８．
李 强，陆兵勋．脑水肿的治疗研究进展Ｉ－Ｊ］．实用医药
杂志，２ＯＯ５，２２（１）：７９ ８１．
Ｎｉｌｓｓｏｎ ＯＧ，Ｂｒａｎｄｔ Ｌ，Ｕｎｇｅｒｓｔｅｄｔ Ｕ，ｅｔ ａ１．Ｂｅｄｓｉｄｅ ｄｅ—
后，血清中ＬＤＨ、ＣＫ和Ｇｌｕ水平升高，其升高水平与脑组织
损伤程度基本一致，这与以往研究报道一致。莪术在一定剂
量下能有效地降低ＭＣＡＯ大鼠血清中ＬＤＨ、ＣＫ和Ｇｌｕ含
量，进一步表明莪术对于ＭＣＡＯ模型大鼠有一定的保护作
用。
ｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｕｓｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙ—
ｓｉｓ ｓｕｂａｒａｃｈｎｏｉｄ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ ａｎｄ ｄｅｌａｙｅｄ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｄｅｔｅ—
ｒｉｏｒａｔｉｏｎ［１］．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，１９９９，（５）：１１７６—１１８５．
方芒，王婉灵，余术宜，等．后适应对大鼠实验性局灶
性脑缺血、再灌注损伤的保护作用［Ｊ］．中国药理学通
报，２００７，２３（４）：４７６－４７９．
综合上述研究结果表明，莪术对ＭＣＡＯ模型大鼠具有
一
定的神经保护作用，表现在其能改善神经行为损伤、减轻
２０１５ Ｄｅｃ；３２（６） 广西医科大学学报
比较Ｔ７Ｅ１和Ｓｕｒｖｅｙｏｒ核酸内切酶对于点突变的检测效率
兰博谢秋巧 明建军黄仁彬张士军△
（广西医科大学药学院药理学教研室南宁 ５３００２１）
摘要 目的：比较Ｔ７Ｅ１和Ｓｕｒｖｅｙｏｒ核酸内切酶对于ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９引起的点突变的错配剪切活性。方法：利用野生型和点突
变的基因组ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增出突变位置的基因片段，用不同比例的野生型和点突变的ＰＣＲ产物进行ＤＮＡ杂交，分别
用Ｔ７Ｅ１和Ｓｕｒｖｅｙｏｒ核酸内切酶对杂交后的产物进行切割，琼脂糖凝胶电泳分析结果。结果：当５ 点突变ＤＮＡ与９５ 野生
型ＤＮＡ杂交时，Ｔ７Ｅ１核酸内切酶剪切杂交产物的比例为９．５ ，Ｓｕｒｖｅｙｏｒ核酸内切酶为３．２ ；当点突变ＤＮＡ与野生型
ＤＮＡ等比例杂交时，Ｔ７Ｅ１核酸内切酶剪切杂交产物的比例为４５．６％，Ｓｕｒｖｅｙｏｒ核酸内切酶为２６．４ ；且Ｔ７Ｅ１和Ｓｕｒｖｅｙｏｒ
核酸内切酶均能检测５ 的突变ＤＮＡ。结论：Ｔ７Ｅ１核酸内切
＊基金项目：２０１１年度留学人员科技活动择优资助项目
（Ｎｏ．人社厅函［２０１１］５０８号）
△通信作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｇｘｙｋｄｘｚｓｌ＠１６３．ｃｏｒｎ
收稿日期：２０１５—０７—３０
酶检测点突变的效率高于Ｓｕｒｖｅｙｏｒ。
关键词ＴＴＥ１；Ｓｕｒｖｅｙｏｒ；点突变；杂交；错配剪切活性
文献标志码：Ａ 文章编号： 中图分类号：Ｒ一３３
１００５—９３０Ｘ（２０１５）０６—０８８７—０４
・
８８８ ・ 广西医科大学学报２０１５ Ｄｅｃ；３２（６）
ＣｏＭＰＡＲＩＳｏＮ ＢＥＴＷＥＥＮ ＰｏＩＮＴ ＭＵＴＡＴＩｏＮ ＤＥＴＥＣＴＩｏＮ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ ｏＦ Ｔ７Ｅ１ ＡＮＤ
ＳＵＲＶＥＹｏＲ ＥＮＤＯＮＵＣＬＥＡＳＥ
Ｌａｎ Ｂｏ，Ｘｉｅ Ｑｉｕｑｉａｏ，Ｍｉｎｇ Ｊｉａｎｊｕｎ，Ｈｕａｎｇ Ｒｅｎｂｉｎ，Ｚｈａｎｇ Ｓｈｉｊｕｎ．（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｇｕａｎｇｘｉ Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｎｉｎｇ ５３００２ １，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｂｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｂｙ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ Ｔ７Ｅ１ ａｎｄ
Ｓｕｒｖｅｙｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｓｓａｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｕｓｅｄ ｗｉｄｅ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ａｓ ｔｅｍ—
ｐｌａｔｅ，ｗｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ５００ ｂｐ ｌｅｎｇｔｈ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｇｉｏｍｏｔｉｎ ｇｅｎｅ．Ａｆｔｅｒ ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ ｗｉｄｅ ｔｙｐｅ ＰＣＲ
ｐｒｏｄｕｃｔ ｗｉｔｈ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ａｔ ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒａｔｉｏｓ，ｔｈｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ ＤＮＡ ｗｅｒｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ
ｂｙ Ｔ７ＥＩ ａｎｄ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｅｎｚｙｍｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ ｗｅｒｅ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｒａｔｉｏｓ ｏｆ ｃｕｔ
ｂａｎｄ ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ ｔｏ ｏｖｅｒａｌｌ ｂａｎｄ ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ ｏｎ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅ１．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｗｈｅｎ ５
ａｎｄ ９５ ｗｉｄｅ ｔｙｐｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗｅｒｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ，９．５
ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ
ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗｅｒｅ ｃｕｔ ｂｙ Ｔ７Ｅ１ ｅｎｄｏｎｕ
ｃｌｅａｓｅ，ａｎｄ ３．２ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗｅｒｅ ｃｕｔ ｂｙ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｗｈｅｎ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ＰＣＲ
ｐｒｏｄｕｃｔ ａｎｄ ｗｉｄｅ ｔｙｐｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗｅｒｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｒａｔｉｏ，４５．６
ｃｕｔ ｂｙ Ｔ７Ｅ１ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｓｅ，２６．４
ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗｅｒｅ
ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗｅｒｅ ｃｕｔ ｂｙ ｓｕｒｖｅｙｏｒ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｂｏｔｈ Ｔ７Ｅ１
ｍｕｔａｎｔ ＤＮＡ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔ７Ｅ１ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｓ ｍｏｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｃａｎ ｄｅｔｅｃｔ ５
ｔｈａｎ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ ｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｏｕｒ ａｓｓａｙｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｔ７Ｅ１；Ｓｕｒｖｅｙｏｒ；ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ；ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ｍｉｓｍａｔｃｈ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｓｓａｙ
基因编辑在近十几年成为一项新兴且热门的技术，
ＧＴＴＴＣＣＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＴＣ ３ （Ｓｉｇｍａ），（一）５ ＧＡＣＧＴＣ
ＺＦＮｓ，ＴＡＩ ＥＮＳ，ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９技术都是利用核酸酶特异性
切割目的基因序列ｌ 。被切开的ＤＮＡ序列引发基因的损伤
（ ＣＴＣＧＧＴＴＣＴＣＡＴＣ一３’（Ｓｉｇｍａ），琼脂糖凝胶（ＳｅａＫｅｍ，批
号：５０００４），１０×ＴＢＥ，ｐＨ一８．３（Ｖｉｖａｎｔｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，批
号：ＰＢ１０４０ １Ｉ ），１ ＫＢ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，批号：Ｇ５７１１），
核酸染料（ＲｅｄＳａｆｅ ＩＮｔＲＯＭ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，批号：２１ １４１），
修复机制，非同源修复多为碱基的丢失、插入，同源修复需要
特定的ＤＮＡ模版，最终导敛基因突变［。 ］。随着基因编辑技
术的发展，快速、高效、经济的检测突变的方法显得尤为重
要，传统的基凶测序技术昂贵且费时，往往不能满足高通量
检测突变的需求。近期发现的高分辨率熔融曲线被证实可
以检测突变【 ，但是这种方法对于小片段ＰＣＲ产物需要有
特殊的定量方法 。另一种检测突变的有效方法是利用突
ＤＮＡ测序仪（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ），
ＰＣＲ仪（ＴＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ Ｂｉｏｍｅｔｒａ），电泳槽
（ＢＩＯ ＲＡＤ ＰｏｗｅｒＰａｃ Ｂａｓｉｃ），微量离心机（ＣＡＰＳＵＩ ＥＦ—
ＵＧＥ ＴＯＭＹ ＰＭＣ ８６０），紫外影像仪（ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｔｏｕｃｈ
Ｇｅｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ １７０８３７０ ＢＩ（）ＲＡＤ），分光光度计（Ｎａｎｏ
ＤｒｏｐＴＭ ２０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒｓ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ），恒温水
变的ＤＮＡ序列与未突变的ＤＮＡ序列进行杂交使其形成异
源双链，特异件核酸内切酶能够检测并切开错配的ＤＮＡ序
浴锅（ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅ ＷＢ２０Ａ１１Ｂ）。
列 。常用的检测基因突变的特异型核酸内切酶为Ｔ７ＥＩ
１．２ ＰＣＲ突变基因片段：分别用野生型和点突变型的大鼠
基因组ＤＮＡ，ＰＣＲ扩增出突变位置的基因片段。ＰＣＲ反应
体系：Ｎｕｃｌｅａｓｅ—Ｆｒｅｅ Ｈ ２ Ｏ １ ２．４“Ｉ ；５×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｒｅａｃｔｉｏｎ
Ｂｕｆｆｅｒ ４“Ｌ；ｄＮＴＰ（２ ｍｍｏｌ／Ｌ）０．４“Ｌ；Ｐｒｉｍｅｒ（＋）
和Ｓｕｒｖｅｙｏｒ。ＴＴＥ１核酸内切酶能够识别并切割不完全配对
ＤＮＡ、十字型结构ＤＮＡ、Ｈｏｌｌｉｄａｙ结构或交叉ＤＮＡ、异源双
链ＤＮＡ或者以更慢的速度切割双链ＤＮＡ。Ｓｕｒｖｅｙｏｒ核酸
内切酶是ＣＥＩ Ｉ错配特异性核酸酶中的一种。ＣＥＬＩ是从芹
菜中分离出来的一种单链特异性核酸酶，能准确切割异源双
链ＤＮＡ错配位点。本文的主要目的在于比较Ｔ７Ｅ１和Ｓｕｒ—
ｖｅｙｏｒ核酸内切酶对于由ＣＲＩＳＰＲ～Ｃａｓ９引发的点突变的检测
活性的区别。
（１０／，ｍｏｌ／Ｉ ）１ Ｉ ；Ｐｒｉｍｅｒ（ ）（１０ ｔＬｍｏｌ／Ｌ）１ Ｌ；Ｔｅｍｐｌａｔｅ
（１００ ｎｇ／ｔ＊Ｌ）１ Ｌ；Ｐｈｕｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．２ Ｌ。ＰＣＲ反应
条件：９８℃，３０ ｓ；９８℃，１０ ８；６４℃，３Ｏ ｓ；７２℃，１５ ｓ；７２℃，
５ ｍｉｎ；４℃， ；３５ ｃｙｃｌｅｓ。
１．３ ＤＮＡ杂交：ＰＣＲ反应结束后，琼脂糖凝胶电泳确认有
条带后，ＰＣＲ试剂盒纯化，对未突变和点突变的ＰＣＲ产物分
１材料和方法
１．１ 主要试剂和仪器：Ｔ７Ｅ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，批号：
ＭＯ３Ｏ２Ｓ），Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，批号：
别进行定量并调至同一浓度。分别用０ Ｍｕｔ（１０“Ｌ ｗＴ）、
５ Ｍｕｔ（０．５／，Ｌ Ｍｕｔ＋９．５ Ｌ ｗＴ）、１０ （１ Ｌ Ｍｕｔ＋９“Ｌ
ＷＴ）、２０ Ｍｕｔ（２ Ｌ Ｍｕｔ＋８ Ｌ ＷＴ）、３０ Ｍｕｔ（３ Ｌ Ｍｕｔ
Ｍｕｔ
７０６０２５），ＰＣＲ纯化试剂盒（ＱＩＡＧＥＮ，批号：２８１０６），Ｎｕｃｌｅ—
ａｓｅ—Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，批号：Ｐ１１９３），５×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｒｅ
ａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，批号：Ｆ ５３８Ｌ），ｄＮＴＰ（Ａｐ—
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，批号：Ｎ８０８０２６１），ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，批号：Ｆ一５３０Ｌ），Ｐｒｉｍｅｒ：（４－）５’一ＣＴ—
＋７ Ｌ ＷＴ）、４０ Ｍｕｔ（４ Ｉ Ｍｕｔ＋６ Ｌ ＷＴ）、５０
（５ Ｌ Ｍｕｔ＋５ Ｌ ＷＴ）、６０
７Ｏ
Ｍｕｔ（６ Ｌ Ｍｕｔ＋４“Ｌ ＷＴ）、
Ｍｕｔ（８ ｕＬ Ｍｕｔ＋
Ｍｕｔ
Ｍｕｔ（７ Ｌ Ｍｕｔ＋３“Ｌ ｗＴ）、８０
２ Ｌ ｗＴ）、９０ Ｍｕｔ（９／，Ｌ Ｍｕｔ＋ｌ Ｌ ｗＴ）、９５
（９．５ Ｌ Ｍｕｔ＋０．５ Ｌ ＷＴ）、１００ Ｍｕｔ（１０ Ｌ Ｍｕｔ）进行
・
８９０ ・ 广西医科大学学报２０１５ Ｄｅｃ；３２（６）
６０
５Ｏ
，、
４０
３Ｏ
￥
善２０
１０
０
０ １０ ２０ ３０ ４０ ５０ ６０ ７０ ８０ ９０ １００
突变ＤＮＡ的百分量（％）
图３ Ｔ７Ｅ１和Ｓｕｒｖｅｙｏｒ酶切效率的定量分析
ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｄｉｔｉｎｇ ｔｏｏｌ ｋｉｔ：ＺＦＮｓ，ＴＡＬＥＮｓ，ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ—
３ 讨 论
在ＤＮＡ测序之前，任何的分子生物学实验室可以利用
文中设计方法检测突变ＤＮＡ，从基因组ＤＮＡ到检测是否发
生基因突变的整个过程仅需一天，大大的节省了时间及开
支，是高通量检测基因突变的绝佳方法。研究结果表明，
Ｃａｓ９［Ｊ］．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２０１４，
１２４（１Ｏ）：４１５４—４１６１．
Ｇａ Ｊ。Ｇｅｒｓｂａｃｈ ＣＡ，Ｂａｒｂａｓ ＣＦ．ＺＦＮ，ＴＡＬＥＮ，ａｎｄ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１３，３１（７）：３９７—４０５．
Ｌ。Ｊ
Ｔｅｒｎｓ ＲＭ，Ｔｅｒｎｓ ＭＰ．ＣＲＩＳＰＲ ｂａｓｅｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：
Ｔ７Ｅ１和Ｓｕｒｖｅｙｏｒ核酸内切酶均具备检测点突变的能力，且
均能检测５ 的突变ＤＮＡ，可见核酸内切酶检测基因突变的
ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｄｅｆｅｎｓｅ ｗｅａｐｏｎｓ ｒｅｐｕｒｐｏｓｅｄ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ
Ｇｅｎｅｔ，２０１４，３０（３）：１１１ １１８．
灵敏度很高，在突变型和野生型ＤＮＡ等比例混合杂交时，酶
切效率达到最高，且在检测点突变的效率上，Ｔ７Ｅ１核酸内切
酶的效率要高于Ｓｕｒｖｅｙｏｒ，其检测突变的机制有待进一步研
究。
Ｌ Ｊ
Ｓｕｔｔｅｒ ＡＧ，Ｐａｌａｎｉｓａｍｙ ＡＰ，Ｋｕｒｔｚ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ
ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｂ／ｏｂ ｍｉｃｅ ｕｓｉｎｇ ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ
ｍｅｌｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．ＰＩ ｏＳ Ｏｎｅ，２０１３，８（１１）：ｅ７８８４０．
Ｌ０ Ｊ
Ｄａｈｌｅｍ ＴＪ，Ｈｏｓｈｉｊｉｍａ Ｋ，Ｊｕｒｙｎｅｃ ＭＪ，ｅｔ ａ１．Ｓｉｍｐｌｅ
ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｌｏｃｕｓ——ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕ——
ｔａｔｉｏｎｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ＴＡＬＥＮｓ ｉｎ ｔｈｅ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｇｅｎｏｍｅ
核酸内切酶错配剪切法检测突变基因也存在一个关键
的控制因素，就是ＰＣＲ扩增模版ＤＮＡ的过程，如果ＤＮＡ聚
合酶的保真度有限，那么扩增出来的ＤＮＡ片段就可能引入
突变，特别是对于ＰＣＲ扩增末端的循环，会导致重组ＰＣＲ产
物的形成 ］，从而导致后续的实验结果受到影响，对于该问 Ｌ０
［Ｊ］．ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ，２０１２，８（８）：ｅｌ００２８６１．
Ｖｏｕｉｌｌｏｔ Ｌ，Ｔｈｆｌｉｅ Ａ，Ｐｏｌｌｅｔ Ｎ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｔ７Ｅ１ ａｎｄ
ｓｕｒｖｅｙｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｓｓａｙｓ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ
题的解决方案是必须使用高保真度的ＤＮＡ聚合酶来扩增
ＤＮＡ片段，保证扩增片段的特异性，减少因ＤＮＡ聚合酶嵌
合错误导致出现的无关背景。
ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｂｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ［Ｊ］．Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ），
２０１５，５（３）：４０７—４１５．
对于该实验，本课题组只比较两种常用的检测突变的核 Ｌ，＿
Ｑｉｕ Ｐ，Ｓｈａｎｄｉｌｙａ Ｈ，１３＂Ａｌｅｓｓｉｏ Ｊ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃ
酸内切酶对于点突变基因检测活性的区别，后续的验证性实
验应在片段丢失以及随机插入缺失突变基因中得到全面的
ｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２００４，
３６（４）：７０２—７０７．
验证，探索两种核酸内切酶对于不同类型突变的检测原理及 Ｌ Ｊ
Ｊｕｄｏ ＭＳ，Ｗｅｄｅ１ ＡＢ，Ｗｉｌｓ。ｎ Ｃ．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｐ
效率分析，完善核酸内切酶检测基因突变的方法，为高通量
检测基因突变技术提供理论依据。
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９９８，２６（７）：１８１９—１８２５．
参考文献：
［１］ Ｒａｊ ａｔ Ｍ．Ｇｕｐｔａ ａｎｄ Ｋｉｒａｎ Ｍｕｓｕｎｕｒｕ．Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ
2024年5月12日发(作者：聂弘文)
黄璃莘，等．莪术对局灶性脑缺血模型大鼠的神经保护作用
学评分，莪术高、中剂量组大鼠神经行为学评分较模型对照
组大鼠有显著的降低，说明莪术在一定程度上能缓解ＭＣＡＯ
・ ８８７ ・
脑梗死和脑水肿程度、降低ＬＤＨ、ＣＫ和Ｇｌｕ含量，其作用机
制可能与保护缺血区脑组织、减轻脑水肿、抗氧自由基、减少
ＥＡＡ毒性有关。对于具体的脑缺血再灌注损伤保护机制有
大鼠因脑缺血所引起的神经损伤。
大量的文献证实Ｅ５，６３，脑水肿在缺血性脑卒中的早期就
会出现，并且会随着脑缺血时间的延长而逐渐加重，在２～４ ｄ
内就会达到峰值。同时脑缺血初期也会伴随着脑梗死，其主
待进一步研究。
参考文献：
Ｐｅｎｄｌｅｂｕｒｙ ＳＴ，Ｒｏｔｈｗｅｌｌ ＰＭ．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ，ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ
ａｎｄｆａｃｔｏｒｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｒｅ—．ｓｔｒｏｋｅ ａｎｄ ｐｏｓｔ—，ｓｔｒｏｋｅ
要的发病机制是脑部供血不足甚至血流中断，引起神经细胞
的损伤。本研究结果表明，与模型对照组相比，莪术能减少
ＭＣＡＯ大鼠大脑脑梗死体积百分比和脑含水量，即可减轻脑
水肿和脑梗死程度，提示莪术对ＭＣＡＯ模型大鼠具有一定
ｄｅｍｅｎｔｉａ：ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｍｅｔａ—ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．
Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ，２００９，８：１００６—１０１８．
的保护作用。
Ｎｉｌｓｓｏｎ等ｌ７ 发现，ＬＤＨ是标志脑组织损害最敏感的酶，
高浓度乳酸与严重脑缺血有很好的相关性，故检测ＬＤＨ含
量不失为一种方法简单、又可初步判断病情和脑梗死面积及
预后的参考方法。有文献报道＿８］，当机体发生缺血性脑卒中
时，脑神经细胞由于长时间缺血缺氧而遭到破坏释放出大量
口
一］ ］ ］
张均田．现代药理试验方法［Ｍ］．北京：北京医科大学、
中国协和医科大学联合出版社，１９９７：１２４１．
Ｚｅａ Ｌｏｎｇａ ＥＬ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ＰＲ，Ｃａｒｌｓｏｎ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｖｅｒｓｉ—
ｂｌｅ ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｒａｎｉｅｃｔｏ—
ｍｙ ｉｎ ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｓｔｒｏｋｅ，１９８９，２０：８１—８４．
Ｆｉｓｈｅｒ Ｍ，Ｆｅｕｅｒｓｔｅｉｎ Ｇ，Ｈｏｗｅｌｌｓ ＤＷ，ｅｔ ａ１．Ｕｐｄａｔｅ ｏｆ
］ ］ ］ ］
的ＣＫ，ＣＫ透过血脑屏障而进入血液，因此ＣＫ可以作为缺
血性脑卒中的特异性诊断指标。兴奋性氨基酸（ＥＡＡ）主要
ｔｈｅ ｓｔｒｏｋｅ ｔｈｅｒａｐｙ ａｃａｄｅｍｉｃ ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｒｏｕｎｄｔａｂｌｅ ｐｒｅ—
ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ［Ｊ￣．Ｓｔｒｏｋｅ，２００９，４０（６）：２２４４—
２２５Ｏ．
为天冬氨酸（Ａｓｐ）和Ｇｌｕ，是机体内含量较高的一种氨基酸，
尤其在脑内的含量较高，是机体中枢神经系统中主要的兴奋
性递质。正常情况下，机体内存在着少量的ＥＡＡ，维持着机
体的兴奋性；一旦细胞外的ＥＡＡ浓度过高，将会导致神经元
的损伤，引起脑组织的病理损害。本研究发现，大鼠ＭＣＡＯ
李燕华，张国威．影响缺血性脑水肿产生的相关因素
ＥＪ］．中国急救医学，２００６，２６（１１）：８４６—８４８．
李 强，陆兵勋．脑水肿的治疗研究进展Ｉ－Ｊ］．实用医药
杂志，２ＯＯ５，２２（１）：７９ ８１．
Ｎｉｌｓｓｏｎ ＯＧ，Ｂｒａｎｄｔ Ｌ，Ｕｎｇｅｒｓｔｅｄｔ Ｕ，ｅｔ ａ１．Ｂｅｄｓｉｄｅ ｄｅ—
后，血清中ＬＤＨ、ＣＫ和Ｇｌｕ水平升高，其升高水平与脑组织
损伤程度基本一致，这与以往研究报道一致。莪术在一定剂
量下能有效地降低ＭＣＡＯ大鼠血清中ＬＤＨ、ＣＫ和Ｇｌｕ含
量，进一步表明莪术对于ＭＣＡＯ模型大鼠有一定的保护作
用。
ｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｕｓｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙ—
ｓｉｓ ｓｕｂａｒａｃｈｎｏｉｄ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ ａｎｄ ｄｅｌａｙｅｄ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｄｅｔｅ—
ｒｉｏｒａｔｉｏｎ［１］．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，１９９９，（５）：１１７６—１１８５．
方芒，王婉灵，余术宜，等．后适应对大鼠实验性局灶
性脑缺血、再灌注损伤的保护作用［Ｊ］．中国药理学通
报，２００７，２３（４）：４７６－４７９．
综合上述研究结果表明，莪术对ＭＣＡＯ模型大鼠具有
一
定的神经保护作用，表现在其能改善神经行为损伤、减轻
２０１５ Ｄｅｃ；３２（６） 广西医科大学学报
比较Ｔ７Ｅ１和Ｓｕｒｖｅｙｏｒ核酸内切酶对于点突变的检测效率
兰博谢秋巧 明建军黄仁彬张士军△
（广西医科大学药学院药理学教研室南宁 ５３００２１）
摘要 目的：比较Ｔ７Ｅ１和Ｓｕｒｖｅｙｏｒ核酸内切酶对于ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９引起的点突变的错配剪切活性。方法：利用野生型和点突
变的基因组ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增出突变位置的基因片段，用不同比例的野生型和点突变的ＰＣＲ产物进行ＤＮＡ杂交，分别
用Ｔ７Ｅ１和Ｓｕｒｖｅｙｏｒ核酸内切酶对杂交后的产物进行切割，琼脂糖凝胶电泳分析结果。结果：当５ 点突变ＤＮＡ与９５ 野生
型ＤＮＡ杂交时，Ｔ７Ｅ１核酸内切酶剪切杂交产物的比例为９．５ ，Ｓｕｒｖｅｙｏｒ核酸内切酶为３．２ ；当点突变ＤＮＡ与野生型
ＤＮＡ等比例杂交时，Ｔ７Ｅ１核酸内切酶剪切杂交产物的比例为４５．６％，Ｓｕｒｖｅｙｏｒ核酸内切酶为２６．４ ；且Ｔ７Ｅ１和Ｓｕｒｖｅｙｏｒ
核酸内切酶均能检测５ 的突变ＤＮＡ。结论：Ｔ７Ｅ１核酸内切
＊基金项目：２０１１年度留学人员科技活动择优资助项目
（Ｎｏ．人社厅函［２０１１］５０８号）
△通信作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｇｘｙｋｄｘｚｓｌ＠１６３．ｃｏｒｎ
收稿日期：２０１５—０７—３０
酶检测点突变的效率高于Ｓｕｒｖｅｙｏｒ。
关键词ＴＴＥ１；Ｓｕｒｖｅｙｏｒ；点突变；杂交；错配剪切活性
文献标志码：Ａ 文章编号： 中图分类号：Ｒ一３３
１００５—９３０Ｘ（２０１５）０６—０８８７—０４
・
８８８ ・ 广西医科大学学报２０１５ Ｄｅｃ；３２（６）
ＣｏＭＰＡＲＩＳｏＮ ＢＥＴＷＥＥＮ ＰｏＩＮＴ ＭＵＴＡＴＩｏＮ ＤＥＴＥＣＴＩｏＮ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ ｏＦ Ｔ７Ｅ１ ＡＮＤ
ＳＵＲＶＥＹｏＲ ＥＮＤＯＮＵＣＬＥＡＳＥ
Ｌａｎ Ｂｏ，Ｘｉｅ Ｑｉｕｑｉａｏ，Ｍｉｎｇ Ｊｉａｎｊｕｎ，Ｈｕａｎｇ Ｒｅｎｂｉｎ，Ｚｈａｎｇ Ｓｈｉｊｕｎ．（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｇｕａｎｇｘｉ Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｎｉｎｇ ５３００２ １，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｂｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｂｙ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ Ｔ７Ｅ１ ａｎｄ
Ｓｕｒｖｅｙｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｓｓａｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｕｓｅｄ ｗｉｄｅ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ａｓ ｔｅｍ—
ｐｌａｔｅ，ｗｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ５００ ｂｐ ｌｅｎｇｔｈ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｇｉｏｍｏｔｉｎ ｇｅｎｅ．Ａｆｔｅｒ ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ ｗｉｄｅ ｔｙｐｅ ＰＣＲ
ｐｒｏｄｕｃｔ ｗｉｔｈ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ａｔ ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒａｔｉｏｓ，ｔｈｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ ＤＮＡ ｗｅｒｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ
ｂｙ Ｔ７ＥＩ ａｎｄ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｅｎｚｙｍｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ ｗｅｒｅ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｒａｔｉｏｓ ｏｆ ｃｕｔ
ｂａｎｄ ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ ｔｏ ｏｖｅｒａｌｌ ｂａｎｄ ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ ｏｎ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅ１．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｗｈｅｎ ５
ａｎｄ ９５ ｗｉｄｅ ｔｙｐｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗｅｒｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ，９．５
ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ
ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗｅｒｅ ｃｕｔ ｂｙ Ｔ７Ｅ１ ｅｎｄｏｎｕ
ｃｌｅａｓｅ，ａｎｄ ３．２ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗｅｒｅ ｃｕｔ ｂｙ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｗｈｅｎ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ＰＣＲ
ｐｒｏｄｕｃｔ ａｎｄ ｗｉｄｅ ｔｙｐｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗｅｒｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｒａｔｉｏ，４５．６
ｃｕｔ ｂｙ Ｔ７Ｅ１ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｓｅ，２６．４
ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗｅｒｅ
ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗｅｒｅ ｃｕｔ ｂｙ ｓｕｒｖｅｙｏｒ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｂｏｔｈ Ｔ７Ｅ１
ｍｕｔａｎｔ ＤＮＡ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔ７Ｅ１ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｓ ｍｏｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｃａｎ ｄｅｔｅｃｔ ５
ｔｈａｎ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ ｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｏｕｒ ａｓｓａｙｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｔ７Ｅ１；Ｓｕｒｖｅｙｏｒ；ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ；ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ｍｉｓｍａｔｃｈ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｓｓａｙ
基因编辑在近十几年成为一项新兴且热门的技术，
ＧＴＴＴＣＣＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＴＣ ３ （Ｓｉｇｍａ），（一）５ ＧＡＣＧＴＣ
ＺＦＮｓ，ＴＡＩ ＥＮＳ，ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９技术都是利用核酸酶特异性
切割目的基因序列ｌ 。被切开的ＤＮＡ序列引发基因的损伤
（ ＣＴＣＧＧＴＴＣＴＣＡＴＣ一３’（Ｓｉｇｍａ），琼脂糖凝胶（ＳｅａＫｅｍ，批
号：５０００４），１０×ＴＢＥ，ｐＨ一８．３（Ｖｉｖａｎｔｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，批
号：ＰＢ１０４０ １Ｉ ），１ ＫＢ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，批号：Ｇ５７１１），
核酸染料（ＲｅｄＳａｆｅ ＩＮｔＲＯＭ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，批号：２１ １４１），
修复机制，非同源修复多为碱基的丢失、插入，同源修复需要
特定的ＤＮＡ模版，最终导敛基因突变［。 ］。随着基因编辑技
术的发展，快速、高效、经济的检测突变的方法显得尤为重
要，传统的基凶测序技术昂贵且费时，往往不能满足高通量
检测突变的需求。近期发现的高分辨率熔融曲线被证实可
以检测突变【 ，但是这种方法对于小片段ＰＣＲ产物需要有
特殊的定量方法 。另一种检测突变的有效方法是利用突
ＤＮＡ测序仪（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ），
ＰＣＲ仪（ＴＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ Ｂｉｏｍｅｔｒａ），电泳槽
（ＢＩＯ ＲＡＤ ＰｏｗｅｒＰａｃ Ｂａｓｉｃ），微量离心机（ＣＡＰＳＵＩ ＥＦ—
ＵＧＥ ＴＯＭＹ ＰＭＣ ８６０），紫外影像仪（ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｔｏｕｃｈ
Ｇｅｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ １７０８３７０ ＢＩ（）ＲＡＤ），分光光度计（Ｎａｎｏ
ＤｒｏｐＴＭ ２０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒｓ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ），恒温水
变的ＤＮＡ序列与未突变的ＤＮＡ序列进行杂交使其形成异
源双链，特异件核酸内切酶能够检测并切开错配的ＤＮＡ序
浴锅（ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅ ＷＢ２０Ａ１１Ｂ）。
列 。常用的检测基因突变的特异型核酸内切酶为Ｔ７ＥＩ
１．２ ＰＣＲ突变基因片段：分别用野生型和点突变型的大鼠
基因组ＤＮＡ，ＰＣＲ扩增出突变位置的基因片段。ＰＣＲ反应
体系：Ｎｕｃｌｅａｓｅ—Ｆｒｅｅ Ｈ ２ Ｏ １ ２．４“Ｉ ；５×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｒｅａｃｔｉｏｎ
Ｂｕｆｆｅｒ ４“Ｌ；ｄＮＴＰ（２ ｍｍｏｌ／Ｌ）０．４“Ｌ；Ｐｒｉｍｅｒ（＋）
和Ｓｕｒｖｅｙｏｒ。ＴＴＥ１核酸内切酶能够识别并切割不完全配对
ＤＮＡ、十字型结构ＤＮＡ、Ｈｏｌｌｉｄａｙ结构或交叉ＤＮＡ、异源双
链ＤＮＡ或者以更慢的速度切割双链ＤＮＡ。Ｓｕｒｖｅｙｏｒ核酸
内切酶是ＣＥＩ Ｉ错配特异性核酸酶中的一种。ＣＥＬＩ是从芹
菜中分离出来的一种单链特异性核酸酶，能准确切割异源双
链ＤＮＡ错配位点。本文的主要目的在于比较Ｔ７Ｅ１和Ｓｕｒ—
ｖｅｙｏｒ核酸内切酶对于由ＣＲＩＳＰＲ～Ｃａｓ９引发的点突变的检测
活性的区别。
（１０／，ｍｏｌ／Ｉ ）１ Ｉ ；Ｐｒｉｍｅｒ（ ）（１０ ｔＬｍｏｌ／Ｌ）１ Ｌ；Ｔｅｍｐｌａｔｅ
（１００ ｎｇ／ｔ＊Ｌ）１ Ｌ；Ｐｈｕｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．２ Ｌ。ＰＣＲ反应
条件：９８℃，３０ ｓ；９８℃，１０ ８；６４℃，３Ｏ ｓ；７２℃，１５ ｓ；７２℃，
５ ｍｉｎ；４℃， ；３５ ｃｙｃｌｅｓ。
１．３ ＤＮＡ杂交：ＰＣＲ反应结束后，琼脂糖凝胶电泳确认有
条带后，ＰＣＲ试剂盒纯化，对未突变和点突变的ＰＣＲ产物分
１材料和方法
１．１ 主要试剂和仪器：Ｔ７Ｅ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，批号：
ＭＯ３Ｏ２Ｓ），Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，批号：
别进行定量并调至同一浓度。分别用０ Ｍｕｔ（１０“Ｌ ｗＴ）、
５ Ｍｕｔ（０．５／，Ｌ Ｍｕｔ＋９．５ Ｌ ｗＴ）、１０ （１ Ｌ Ｍｕｔ＋９“Ｌ
ＷＴ）、２０ Ｍｕｔ（２ Ｌ Ｍｕｔ＋８ Ｌ ＷＴ）、３０ Ｍｕｔ（３ Ｌ Ｍｕｔ
Ｍｕｔ
７０６０２５），ＰＣＲ纯化试剂盒（ＱＩＡＧＥＮ，批号：２８１０６），Ｎｕｃｌｅ—
ａｓｅ—Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，批号：Ｐ１１９３），５×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｒｅ
ａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，批号：Ｆ ５３８Ｌ），ｄＮＴＰ（Ａｐ—
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，批号：Ｎ８０８０２６１），ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，批号：Ｆ一５３０Ｌ），Ｐｒｉｍｅｒ：（４－）５’一ＣＴ—
＋７ Ｌ ＷＴ）、４０ Ｍｕｔ（４ Ｉ Ｍｕｔ＋６ Ｌ ＷＴ）、５０
（５ Ｌ Ｍｕｔ＋５ Ｌ ＷＴ）、６０
７Ｏ
Ｍｕｔ（６ Ｌ Ｍｕｔ＋４“Ｌ ＷＴ）、
Ｍｕｔ（８ ｕＬ Ｍｕｔ＋
Ｍｕｔ
Ｍｕｔ（７ Ｌ Ｍｕｔ＋３“Ｌ ｗＴ）、８０
２ Ｌ ｗＴ）、９０ Ｍｕｔ（９／，Ｌ Ｍｕｔ＋ｌ Ｌ ｗＴ）、９５
（９．５ Ｌ Ｍｕｔ＋０．５ Ｌ ＷＴ）、１００ Ｍｕｔ（１０ Ｌ Ｍｕｔ）进行
・
８９０ ・ 广西医科大学学报２０１５ Ｄｅｃ；３２（６）
６０
５Ｏ
，、
４０
３Ｏ
￥
善２０
１０
０
０ １０ ２０ ３０ ４０ ５０ ６０ ７０ ８０ ９０ １００
突变ＤＮＡ的百分量（％）
图３ Ｔ７Ｅ１和Ｓｕｒｖｅｙｏｒ酶切效率的定量分析
ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｄｉｔｉｎｇ ｔｏｏｌ ｋｉｔ：ＺＦＮｓ，ＴＡＬＥＮｓ，ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ—
３ 讨 论
在ＤＮＡ测序之前，任何的分子生物学实验室可以利用
文中设计方法检测突变ＤＮＡ，从基因组ＤＮＡ到检测是否发
生基因突变的整个过程仅需一天，大大的节省了时间及开
支，是高通量检测基因突变的绝佳方法。研究结果表明，
Ｃａｓ９［Ｊ］．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２０１４，
１２４（１Ｏ）：４１５４—４１６１．
Ｇａ Ｊ。Ｇｅｒｓｂａｃｈ ＣＡ，Ｂａｒｂａｓ ＣＦ．ＺＦＮ，ＴＡＬＥＮ，ａｎｄ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１３，３１（７）：３９７—４０５．
Ｌ。Ｊ
Ｔｅｒｎｓ ＲＭ，Ｔｅｒｎｓ ＭＰ．ＣＲＩＳＰＲ ｂａｓｅｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：
Ｔ７Ｅ１和Ｓｕｒｖｅｙｏｒ核酸内切酶均具备检测点突变的能力，且
均能检测５ 的突变ＤＮＡ，可见核酸内切酶检测基因突变的
ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｄｅｆｅｎｓｅ ｗｅａｐｏｎｓ ｒｅｐｕｒｐｏｓｅｄ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ
Ｇｅｎｅｔ，２０１４，３０（３）：１１１ １１８．
灵敏度很高，在突变型和野生型ＤＮＡ等比例混合杂交时，酶
切效率达到最高，且在检测点突变的效率上，Ｔ７Ｅ１核酸内切
酶的效率要高于Ｓｕｒｖｅｙｏｒ，其检测突变的机制有待进一步研
究。
Ｌ Ｊ
Ｓｕｔｔｅｒ ＡＧ，Ｐａｌａｎｉｓａｍｙ ＡＰ，Ｋｕｒｔｚ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ
ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｂ／ｏｂ ｍｉｃｅ ｕｓｉｎｇ ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ
ｍｅｌｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．ＰＩ ｏＳ Ｏｎｅ，２０１３，８（１１）：ｅ７８８４０．
Ｌ０ Ｊ
Ｄａｈｌｅｍ ＴＪ，Ｈｏｓｈｉｊｉｍａ Ｋ，Ｊｕｒｙｎｅｃ ＭＪ，ｅｔ ａ１．Ｓｉｍｐｌｅ
ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｌｏｃｕｓ——ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕ——
ｔａｔｉｏｎｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ＴＡＬＥＮｓ ｉｎ ｔｈｅ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｇｅｎｏｍｅ
核酸内切酶错配剪切法检测突变基因也存在一个关键
的控制因素，就是ＰＣＲ扩增模版ＤＮＡ的过程，如果ＤＮＡ聚
合酶的保真度有限，那么扩增出来的ＤＮＡ片段就可能引入
突变，特别是对于ＰＣＲ扩增末端的循环，会导致重组ＰＣＲ产
物的形成 ］，从而导致后续的实验结果受到影响，对于该问 Ｌ０
［Ｊ］．ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ，２０１２，８（８）：ｅｌ００２８６１．
Ｖｏｕｉｌｌｏｔ Ｌ，Ｔｈｆｌｉｅ Ａ，Ｐｏｌｌｅｔ Ｎ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｔ７Ｅ１ ａｎｄ
ｓｕｒｖｅｙｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｓｓａｙｓ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ
题的解决方案是必须使用高保真度的ＤＮＡ聚合酶来扩增
ＤＮＡ片段，保证扩增片段的特异性，减少因ＤＮＡ聚合酶嵌
合错误导致出现的无关背景。
ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｂｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ［Ｊ］．Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ），
２０１５，５（３）：４０７—４１５．
对于该实验，本课题组只比较两种常用的检测突变的核 Ｌ，＿
Ｑｉｕ Ｐ，Ｓｈａｎｄｉｌｙａ Ｈ，１３＂Ａｌｅｓｓｉｏ Ｊ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃ
酸内切酶对于点突变基因检测活性的区别，后续的验证性实
验应在片段丢失以及随机插入缺失突变基因中得到全面的
ｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２００４，
３６（４）：７０２—７０７．
验证，探索两种核酸内切酶对于不同类型突变的检测原理及 Ｌ Ｊ
Ｊｕｄｏ ＭＳ，Ｗｅｄｅ１ ＡＢ，Ｗｉｌｓ。ｎ Ｃ．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｐ
效率分析，完善核酸内切酶检测基因突变的方法，为高通量
检测基因突变技术提供理论依据。
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９９８，２６（７）：１８１９—１８２５．
参考文献：
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