2024年5月16日发(作者：漆雕书易)
作物学报
ACTA
AGRONOMICA
SINICA 2019, 45(6): 872878
ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9
/
E-mail: zwxb301@
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2019.83067
基于高通量测序开发玉米高效KASP分子标记
陆海燕
1
周 玲
1
林 峰
1
王 蕊
2
王凤格
2
赵 涵
1,*
12
江苏省农业科学院 / 江苏省农业生物学重点实验室, 江苏南京 210014; 北京市农林科学院玉米研究中心, 北京 100097
摘 要: SNP (Single Nucleotide Polymorphism)在基因组中数量多、分布广, 适用于大规模、自动化基因型检测。本研
究利用205份不同来源的玉米自交系全基因组重测序数据鉴定出一系列多态性高的二态性SNP位点并开发出700个
KASP分子标记。其中, 202个在46个玉米代表系中得到验证的KASP标记进一步用于系统进化树构建及群体结构分
析。结果显示, 开发成功的KASP标记在染色体上分布均匀, 平均PIC为0.463, 平均MAF为0.451。基于KASP标
记位点和总SNP位点的聚类分析结果高度吻合。KASP标记位点与总SNP位点的遗传距离相似性系数高达89.5%, 能
成功区分玉米的杂种优势群。该KASP标记可在玉米种质资源分析、连锁群构建以及杂种优势群划分等方面发挥重
要作用。
关键词: 玉米; 重测序; KASP标记; 种质资源
Development of efficient KASP molecular markers based on high throughput
sequencing in maize
LU Hai-Yan
1
, ZHOU Ling
1
, LIN Feng
1
, WANG Rui
2
, WANG Feng-Ge
2
, and ZHAO Han
1,*
1
Provincial Key Laboratory of Agrobiology / Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, Jiangsu, China;
2
Maize Research Center,
Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, China
Abstract: SNP (Single Nucleotide Polymorphism) which is abundant and dispersed widely in the genome is suitable for
large-scale and automated genotyping. In this study, highly polymorphic bi-allelic SNP loci were screened and 700 KASP (Kom-
petitive Allele Specific PCR) molecular markers were developed based on resequencing data of 205 diverse maize inbred lines.
Among them, 202 KASP markers validated by 46 representative lines were further used for phylogenetic tree construction and
genetic structure analysis. The validated KASP markers distributed evenly on 10 chromosomes in maize with an average PIC of
0.463 and an average MAF of 0.451. The phylogenetic tree constructed by KASP markers is highly consistent with that by
re-sequencing data. In addition, the genetic similarity coefficient evaluated between KASP loci and the total SNP loci achieved
89.5% which demonstrated the availability of KASP in heterotic group division. These findings suggest that 202 KASP markers
play an important role in analysis of germplasm resource, construction of genetic map, and division of heterotic group in maize.
Keywords: maize; resequencing; KASP markers; germplasm
玉米是重要的粮食及饲料作物, 由于具有较高
的遗传多样性已成为重要模式作物
[1]
。其核苷酸多
态性变化是所有作物中较高的, 不同材料基因组之
间的差异达到1.42%, 大于人类与黑猩猩之间的差
异(1.34%)
[2]
。丰富的基因组变异为开发具有高多态
性分子标记提供了可能。根据变异序列的长短将基
因组变异分为单核苷酸变异(SNP)及插入缺失(Indel
2~50 bp)和>50 bp的序列重排(SV)
[2]
3种类型。基于
Indel和SV开发的标记不仅检测通量低, 而且成本
相对较高
[3]
。SNP标记具有分布广泛、遗传稳定性
好且易于实现自动化等优点, 目前已迅速取代传统
的分子标记
[4-5]
。
本研究由国家重点研发计划项目(2017YFD0101205, 2017YFD0102005)和江苏省农业科技自主创新项目[CX(18)1001]资助。
This study was supported by the National Key Research and Development Program (2017YFD0101205, 2017YFD0102005) and the Jiangsu
Agricultural Science and Technology Innovation Fund [CX(18)1001].
*
通信作者(Corresponding author): 赵涵, E-mail: zhaohan@, Tel:
第一作者联系方式: E-mail: luhaiyan@, Tel:
Received(收稿日期): 2018-10-07; Accepted(接受日期): 2019-01-19; Published online(网络出版日期): 2019-03-01.
URL: /kcms/detail/
第
6
期
陆海燕等: 基于高通量测序开发玉米高效KASP分子标记
873
高通量测序技术的快速发展, 有效推动玉米基
因组结构变异的研究。Jiao等
[6]
利用重测序技术对6
个玉米自交系进行DNA结构变异分析, 发现中国玉
米自交系中存在大量SNP位点的变异, 报道揭示了
玉米基因组中超过100万个SNP。2018年, Sun等
[7]
报道了Mo17的从头基因组装配, 提供了又一个重
要的玉米参考基因组序列。这一个参考基因组的产
生为广泛比较玉米中种内基因组多样性提供了前所
未有的机会, 通过比对B73和Mo17基因组, 发现了
980多万个SNP位点、140多万的插入/缺失, 该研
究为开发基于SNP位点的分子标记提供了理论依据
和数据支撑。SNP是单核苷酸变异产生的多态性, 无
法通过常规的PCR技术与凝胶电泳技术利用长度的
差异来区分其多态性
[8]
。目前尽管开发了多种SNP
基因分型方法, 包括定点测序技术、等位基因特异性
PCR (AS-PCR)、裂解扩增多态性序列(CAPS)、温度
开关PC (TS-PCR)和基因重测序
[9-11]
, 但这些方法都
存在低通量或高成本等局限性
[12]
。近些年, 高通量的
SNP位点检测几乎都采用芯片技术。赵久然等
[13]
利
用基于SNP位点的芯片技术揭示中国玉米育种种质
的遗传多样性与群体遗传结构。王文斌等
[14]
利用含有
2846个高质量SNP位点的芯片进行了31份骨干自交
系群体遗传结构、遗传多样性分析。基于芯片技术的
SNP基因分型平台的通量较高, 每张芯片包含几百到
数百万的SNP位点
[15]
, 但大多数基于芯片的基因分型
平台用于样本量较多的全基因组扫描时成本较高
[16]
。
KASP (Kompetitive Allele Specific PCR), 即竞
争性等位基因特异性PCR技术, 以其高度稳定性、
准确性和低成本的特点, 已经被广泛应用于高通量
SNP分型, 尤其在样本量大, SNP位点少时, KASP
的应用特点最为显著
[17]
。Rasheed等
[12]
开发70个小
麦KASP分子标记, 并成功验证了这些标记与品种
亲本和双亲本群体的表型相关, 揭示了KASP分子
标记在小麦育种中的潜在应用。国际玉米和小麦改
良中心使用KASP, 每年产生超过一百万个数据点
用于作物改良
[18]
。KASP在小到中等数量的标记应
用中显示出了成本效益和可扩展的灵活性, 如在双
亲本群体的质量控制分析、标记辅助的轮回选择、
辅助回交和QTL精细定位等方面发挥重要作用
[17]
。
KASP分子标记的开发需要综合考虑目的区段DNA
的唯一变异, 多态性以及位点特异性等因素, 基于
重测序数据可以筛选出目的区段100 bp内只有一个
SNP位点的变异, 而通过高密度芯片筛选的位点无
法保证唯一性。
本研究利用遗传来源不同的205份玉米自交系
的全基因组重测序信息, 筛选出多态性高的二态性
SNP位点, 基于这些位点以及侧翼序列信息开发
KASP分子标记, 并利用其中46个代表玉米自交系
进行验证, 获得了一套在染色体上均匀分布且多态
性高的KASP分子标记。这些标记可以为玉米SNP
基因分型研究提供重要的基础和分析方法, 同时为
种质改良及杂交种组配提供DNA水平上的信息。
1 材料与方法
1.1 材料及全基因组测序数据
选用来自7个不同类群的205份玉米自交系,
其二代原始序列下载于NCBI (.
/)的3个SRA (Sequence Read Archive)数据库
(PRJNA82843、SRP011907和PRJNA260788)。删除
其中低测序深度的材料。利用生物信息学分析技术
比对这些材料的序列, 选择最小等位基因频率
(MAF)大于0.05的位点, 删除基因型缺失率超过
20%的位点, 以哈迪温伯格平衡显著性阈值(HWE)
P<0.001为标准再次过滤, 最终保留多态信息含量
(PIC)>0.4并且是二态性的目的SNP位点
[19-20]
。
从7个类群中, 分别抽出一定数量的代表自交
系(详细信息见表1)为实验材料, 用于KASP验证。
1.2 标记开发和筛选
根据SNP位点和侧翼序列设计PCR扩增引物,
开发KASP分子标记。每个标记设计2条SNP特异
性引物(F
1
/F
2
)和一条通用引物(R), F
1
尾部添加能够与
FAM荧光结合的特异性序列, F
2
尾部添加能够与
HEX荧光结合的特异性序列。KASP引物设计由
mIndel软件包
[21]
完成, 引物由生工生物工程(上海)股
份有限公司合成。
对46份代表自交系的叶片进行取样, 按照上海
浦迪植物基因组提取试剂盒操作步骤提取基因组
DNA。KASP反应总体系为5 μL, 包含2×KASP
Master Mix 2.5 μL、KASP Assay Mix (引物混合工作
液) 0.07 μL、浓度为20 ng μL
–1
的模板DNA 2.43 μL。
KASP反应程序为, 第一步: 94℃, 15 min; 第二步:
94℃, 20 s, 61~55℃, 1 min, 每个循环降低0.6℃, 共
进行10个循环; 第三步: 94℃, 20 s, 55℃, 1 min, 共
进行26个循环, PCR在购买自LGC公司型号为
Hydrocycler 16的水浴PCR仪中进行。通过KASP
荧光分析仪(LGC公司型号为PHERAstar plus)扫描
分析PCR结果。根据基因型分型效果和在玉米基因
组染色体上的分布等信息, 挑选有效的KASP标记。
2024年5月16日发(作者：漆雕书易)
作物学报
ACTA
AGRONOMICA
SINICA 2019, 45(6): 872878
ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9
/
E-mail: zwxb301@
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2019.83067
基于高通量测序开发玉米高效KASP分子标记
陆海燕
1
周 玲
1
林 峰
1
王 蕊
2
王凤格
2
赵 涵
1,*
12
江苏省农业科学院 / 江苏省农业生物学重点实验室, 江苏南京 210014; 北京市农林科学院玉米研究中心, 北京 100097
摘 要: SNP (Single Nucleotide Polymorphism)在基因组中数量多、分布广, 适用于大规模、自动化基因型检测。本研
究利用205份不同来源的玉米自交系全基因组重测序数据鉴定出一系列多态性高的二态性SNP位点并开发出700个
KASP分子标记。其中, 202个在46个玉米代表系中得到验证的KASP标记进一步用于系统进化树构建及群体结构分
析。结果显示, 开发成功的KASP标记在染色体上分布均匀, 平均PIC为0.463, 平均MAF为0.451。基于KASP标
记位点和总SNP位点的聚类分析结果高度吻合。KASP标记位点与总SNP位点的遗传距离相似性系数高达89.5%, 能
成功区分玉米的杂种优势群。该KASP标记可在玉米种质资源分析、连锁群构建以及杂种优势群划分等方面发挥重
要作用。
关键词: 玉米; 重测序; KASP标记; 种质资源
Development of efficient KASP molecular markers based on high throughput
sequencing in maize
LU Hai-Yan
1
, ZHOU Ling
1
, LIN Feng
1
, WANG Rui
2
, WANG Feng-Ge
2
, and ZHAO Han
1,*
1
Provincial Key Laboratory of Agrobiology / Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, Jiangsu, China;
2
Maize Research Center,
Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, China
Abstract: SNP (Single Nucleotide Polymorphism) which is abundant and dispersed widely in the genome is suitable for
large-scale and automated genotyping. In this study, highly polymorphic bi-allelic SNP loci were screened and 700 KASP (Kom-
petitive Allele Specific PCR) molecular markers were developed based on resequencing data of 205 diverse maize inbred lines.
Among them, 202 KASP markers validated by 46 representative lines were further used for phylogenetic tree construction and
genetic structure analysis. The validated KASP markers distributed evenly on 10 chromosomes in maize with an average PIC of
0.463 and an average MAF of 0.451. The phylogenetic tree constructed by KASP markers is highly consistent with that by
re-sequencing data. In addition, the genetic similarity coefficient evaluated between KASP loci and the total SNP loci achieved
89.5% which demonstrated the availability of KASP in heterotic group division. These findings suggest that 202 KASP markers
play an important role in analysis of germplasm resource, construction of genetic map, and division of heterotic group in maize.
Keywords: maize; resequencing; KASP markers; germplasm
玉米是重要的粮食及饲料作物, 由于具有较高
的遗传多样性已成为重要模式作物
[1]
。其核苷酸多
态性变化是所有作物中较高的, 不同材料基因组之
间的差异达到1.42%, 大于人类与黑猩猩之间的差
异(1.34%)
[2]
。丰富的基因组变异为开发具有高多态
性分子标记提供了可能。根据变异序列的长短将基
因组变异分为单核苷酸变异(SNP)及插入缺失(Indel
2~50 bp)和>50 bp的序列重排(SV)
[2]
3种类型。基于
Indel和SV开发的标记不仅检测通量低, 而且成本
相对较高
[3]
。SNP标记具有分布广泛、遗传稳定性
好且易于实现自动化等优点, 目前已迅速取代传统
的分子标记
[4-5]
。
本研究由国家重点研发计划项目(2017YFD0101205, 2017YFD0102005)和江苏省农业科技自主创新项目[CX(18)1001]资助。
This study was supported by the National Key Research and Development Program (2017YFD0101205, 2017YFD0102005) and the Jiangsu
Agricultural Science and Technology Innovation Fund [CX(18)1001].
*
通信作者(Corresponding author): 赵涵, E-mail: zhaohan@, Tel:
第一作者联系方式: E-mail: luhaiyan@, Tel:
Received(收稿日期): 2018-10-07; Accepted(接受日期): 2019-01-19; Published online(网络出版日期): 2019-03-01.
URL: /kcms/detail/
第
6
期
陆海燕等: 基于高通量测序开发玉米高效KASP分子标记
873
高通量测序技术的快速发展, 有效推动玉米基
因组结构变异的研究。Jiao等
[6]
利用重测序技术对6
个玉米自交系进行DNA结构变异分析, 发现中国玉
米自交系中存在大量SNP位点的变异, 报道揭示了
玉米基因组中超过100万个SNP。2018年, Sun等
[7]
报道了Mo17的从头基因组装配, 提供了又一个重
要的玉米参考基因组序列。这一个参考基因组的产
生为广泛比较玉米中种内基因组多样性提供了前所
未有的机会, 通过比对B73和Mo17基因组, 发现了
980多万个SNP位点、140多万的插入/缺失, 该研
究为开发基于SNP位点的分子标记提供了理论依据
和数据支撑。SNP是单核苷酸变异产生的多态性, 无
法通过常规的PCR技术与凝胶电泳技术利用长度的
差异来区分其多态性
[8]
。目前尽管开发了多种SNP
基因分型方法, 包括定点测序技术、等位基因特异性
PCR (AS-PCR)、裂解扩增多态性序列(CAPS)、温度
开关PC (TS-PCR)和基因重测序
[9-11]
, 但这些方法都
存在低通量或高成本等局限性
[12]
。近些年, 高通量的
SNP位点检测几乎都采用芯片技术。赵久然等
[13]
利
用基于SNP位点的芯片技术揭示中国玉米育种种质
的遗传多样性与群体遗传结构。王文斌等
[14]
利用含有
2846个高质量SNP位点的芯片进行了31份骨干自交
系群体遗传结构、遗传多样性分析。基于芯片技术的
SNP基因分型平台的通量较高, 每张芯片包含几百到
数百万的SNP位点
[15]
, 但大多数基于芯片的基因分型
平台用于样本量较多的全基因组扫描时成本较高
[16]
。
KASP (Kompetitive Allele Specific PCR), 即竞
争性等位基因特异性PCR技术, 以其高度稳定性、
准确性和低成本的特点, 已经被广泛应用于高通量
SNP分型, 尤其在样本量大, SNP位点少时, KASP
的应用特点最为显著
[17]
。Rasheed等
[12]
开发70个小
麦KASP分子标记, 并成功验证了这些标记与品种
亲本和双亲本群体的表型相关, 揭示了KASP分子
标记在小麦育种中的潜在应用。国际玉米和小麦改
良中心使用KASP, 每年产生超过一百万个数据点
用于作物改良
[18]
。KASP在小到中等数量的标记应
用中显示出了成本效益和可扩展的灵活性, 如在双
亲本群体的质量控制分析、标记辅助的轮回选择、
辅助回交和QTL精细定位等方面发挥重要作用
[17]
。
KASP分子标记的开发需要综合考虑目的区段DNA
的唯一变异, 多态性以及位点特异性等因素, 基于
重测序数据可以筛选出目的区段100 bp内只有一个
SNP位点的变异, 而通过高密度芯片筛选的位点无
法保证唯一性。
本研究利用遗传来源不同的205份玉米自交系
的全基因组重测序信息, 筛选出多态性高的二态性
SNP位点, 基于这些位点以及侧翼序列信息开发
KASP分子标记, 并利用其中46个代表玉米自交系
进行验证, 获得了一套在染色体上均匀分布且多态
性高的KASP分子标记。这些标记可以为玉米SNP
基因分型研究提供重要的基础和分析方法, 同时为
种质改良及杂交种组配提供DNA水平上的信息。
1 材料与方法
1.1 材料及全基因组测序数据
选用来自7个不同类群的205份玉米自交系,
其二代原始序列下载于NCBI (.
/)的3个SRA (Sequence Read Archive)数据库
(PRJNA82843、SRP011907和PRJNA260788)。删除
其中低测序深度的材料。利用生物信息学分析技术
比对这些材料的序列, 选择最小等位基因频率
(MAF)大于0.05的位点, 删除基因型缺失率超过
20%的位点, 以哈迪温伯格平衡显著性阈值(HWE)
P<0.001为标准再次过滤, 最终保留多态信息含量
(PIC)>0.4并且是二态性的目的SNP位点
[19-20]
。
从7个类群中, 分别抽出一定数量的代表自交
系(详细信息见表1)为实验材料, 用于KASP验证。
1.2 标记开发和筛选
根据SNP位点和侧翼序列设计PCR扩增引物,
开发KASP分子标记。每个标记设计2条SNP特异
性引物(F
1
/F
2
)和一条通用引物(R), F
1
尾部添加能够与
FAM荧光结合的特异性序列, F
2
尾部添加能够与
HEX荧光结合的特异性序列。KASP引物设计由
mIndel软件包
[21]
完成, 引物由生工生物工程(上海)股
份有限公司合成。
对46份代表自交系的叶片进行取样, 按照上海
浦迪植物基因组提取试剂盒操作步骤提取基因组
DNA。KASP反应总体系为5 μL, 包含2×KASP
Master Mix 2.5 μL、KASP Assay Mix (引物混合工作
液) 0.07 μL、浓度为20 ng μL
–1
的模板DNA 2.43 μL。
KASP反应程序为, 第一步: 94℃, 15 min; 第二步:
94℃, 20 s, 61~55℃, 1 min, 每个循环降低0.6℃, 共
进行10个循环; 第三步: 94℃, 20 s, 55℃, 1 min, 共
进行26个循环, PCR在购买自LGC公司型号为
Hydrocycler 16的水浴PCR仪中进行。通过KASP
荧光分析仪(LGC公司型号为PHERAstar plus)扫描
分析PCR结果。根据基因型分型效果和在玉米基因
组染色体上的分布等信息, 挑选有效的KASP标记。