2024年5月23日发(作者：羿暄和)
逆转录酶活性检测荧光定量 PCR 方法
孔艳 吴小红 杨立宏 安祺 董关木 俞永新
【摘要】
目的 在我们传统 PERT 方法的基础上建立荧光实时定量逆转录 PCR
（ Real-time Quantitive Reverse Transcription Polymerase Chain
Reaction）检测方法，使得检测灵敏度进一步增强。
方法 以噬菌体 MS2 RNA 为模板，应用标准 AMV 逆转录酶催化体外
逆转录反应合成相应 cDNA.实时荧光定量 PCR 法检测底物 cDNA 模
板量,进而得出逆转录酶的相对活性。
结果 将 AMV 逆转录酶标准 10 倍倍比连续稀释后催化逆转录反应,
实时荧光定量 PCR 分析所得的逆转录产物 cDNA, 得到标准荧光值
曲线，从而间接推测样品中有无逆转录病毒污染。
结论 成功建立了基于实时荧光定量 PCR 检测逆转录酶活性的新型
方法,为生物制品外来污染尤其是逆转录病毒的污染的检测提供了参
考指标。
【关键词】荧光定量 PCR 检测法；逆转录酶; 逆转录酶是所有逆转录
病毒的一个重要标志，目前逆转录病毒的
检测方法被普遍应用的是以 PCR 为基本方法的逆转录酶活性检测法
Ulyra Sensitive Product Enhanced Reverse Transcriptase(PERT)，我们曾
经在国内首次报道了逆转录酶的 PERT 检测方法，但传统 PERT 方
作者单位：100050 北京 中国药品生物制品检定所 通讯作者：孔艳，
Email:*****************.cn
法的实验过程容易造成污染和假阳性，并且无法做到实时监控。本次
报导是在原有方法的基础上
( 1 )
，以噬菌体 MS2 RNA 为模板合成引物
和探针，建立检测逆转录酶活性的实时荧光定量 PCR 方法
( 2 )
。
荧光实时定量 PCR 技术是由美国 Applied Biosysems 公司推出，
20 世纪 90 年代发展起来
( 3 )
。在 PCR 反应系统中加入荧光基因利用
荧光信号积累实时检测整个 PCR 过程，最后通过标准曲线对未知模
板进行定量分析的方法。由于引入了荧光标记探针提高了方法的高灵
敏性，可直接监测扩增中的荧光信号变化获得定量结果，定量和扩增
同步进行，克服了 PCR 的平台效应的特点，使方法具有高精确性，
能实现多重反应、无污染性、因此方法具有高特异性、实时性和可靠
性等特点。目前已被应用于病原体测定、肿瘤基因检测、免疫分析、 基
因表达、突变和多态性研究等多个领域
( 4 )
。
我们所建立的检测逆转录酶活性的荧光实时定量 PCR 方法与普
通 PERT 方法相比，实验操作过程减少，所使用的起始模版量仅为传
统 PERT 法的 1/50，降低气溶胶等外来核酸造成的污染，同时通过样
品的 PCR 扩增产物变化曲线对感染病毒的数量达到精确定量。
1 材料与方法：
1.1 材料
1.1.1 引物的设计：在我们以往设计的引物基础上，再合成一条探针
并分别在 5`端加上 FAM 荧光素, 3`端加上 TAMRA 荧光素。即以噬菌
体 MS2 RNA 为模板设计引物：RT-1: (5`-d(GCC TTA GCA GTG CCC
TGT CT)-3`) ，RT-2: (5`-d(AAC ATG CTC GAG GGC CTTA)-3`)，
2024年5月23日发(作者：羿暄和)
逆转录酶活性检测荧光定量 PCR 方法
孔艳 吴小红 杨立宏 安祺 董关木 俞永新
【摘要】
目的 在我们传统 PERT 方法的基础上建立荧光实时定量逆转录 PCR
（ Real-time Quantitive Reverse Transcription Polymerase Chain
Reaction）检测方法，使得检测灵敏度进一步增强。
方法 以噬菌体 MS2 RNA 为模板，应用标准 AMV 逆转录酶催化体外
逆转录反应合成相应 cDNA.实时荧光定量 PCR 法检测底物 cDNA 模
板量,进而得出逆转录酶的相对活性。
结果 将 AMV 逆转录酶标准 10 倍倍比连续稀释后催化逆转录反应,
实时荧光定量 PCR 分析所得的逆转录产物 cDNA, 得到标准荧光值
曲线，从而间接推测样品中有无逆转录病毒污染。
结论 成功建立了基于实时荧光定量 PCR 检测逆转录酶活性的新型
方法,为生物制品外来污染尤其是逆转录病毒的污染的检测提供了参
考指标。
【关键词】荧光定量 PCR 检测法；逆转录酶; 逆转录酶是所有逆转录
病毒的一个重要标志，目前逆转录病毒的
检测方法被普遍应用的是以 PCR 为基本方法的逆转录酶活性检测法
Ulyra Sensitive Product Enhanced Reverse Transcriptase(PERT)，我们曾
经在国内首次报道了逆转录酶的 PERT 检测方法，但传统 PERT 方
作者单位：100050 北京 中国药品生物制品检定所 通讯作者：孔艳，
Email:*****************.cn
法的实验过程容易造成污染和假阳性，并且无法做到实时监控。本次
报导是在原有方法的基础上
( 1 )
，以噬菌体 MS2 RNA 为模板合成引物
和探针，建立检测逆转录酶活性的实时荧光定量 PCR 方法
( 2 )
。
荧光实时定量 PCR 技术是由美国 Applied Biosysems 公司推出，
20 世纪 90 年代发展起来
( 3 )
。在 PCR 反应系统中加入荧光基因利用
荧光信号积累实时检测整个 PCR 过程，最后通过标准曲线对未知模
板进行定量分析的方法。由于引入了荧光标记探针提高了方法的高灵
敏性，可直接监测扩增中的荧光信号变化获得定量结果，定量和扩增
同步进行，克服了 PCR 的平台效应的特点，使方法具有高精确性，
能实现多重反应、无污染性、因此方法具有高特异性、实时性和可靠
性等特点。目前已被应用于病原体测定、肿瘤基因检测、免疫分析、 基
因表达、突变和多态性研究等多个领域
( 4 )
。
我们所建立的检测逆转录酶活性的荧光实时定量 PCR 方法与普
通 PERT 方法相比，实验操作过程减少，所使用的起始模版量仅为传
统 PERT 法的 1/50，降低气溶胶等外来核酸造成的污染，同时通过样
品的 PCR 扩增产物变化曲线对感染病毒的数量达到精确定量。
1 材料与方法：
1.1 材料
1.1.1 引物的设计：在我们以往设计的引物基础上，再合成一条探针
并分别在 5`端加上 FAM 荧光素, 3`端加上 TAMRA 荧光素。即以噬菌
体 MS2 RNA 为模板设计引物：RT-1: (5`-d(GCC TTA GCA GTG CCC
TGT CT)-3`) ，RT-2: (5`-d(AAC ATG CTC GAG GGC CTTA)-3`)，