2024年5月26日发(作者：宝豫)
普朗尼克P85修饰的苯妥英钠纳米粒对颞叶内侧癫痫大鼠模
型的脑靶向作用
方子妍;郭彩凤;吴逢春;秦家明;宁玉萍;周列民
【摘 要】Objective In order to evaluate that whether Pluronic P85 coated
poly(butylcyanoacrylate) nanoparti-cles was able to deliver antiepileptic
drug phenytoin into the brain va bypassing mesial temporal lobe epilepsy
(MTLE)-induced Pgp in a rat model of MTLE. Methods The rat model of
MTLE, induced by li-pilocarpine, was divided in-to two groups (6 for
nanoparticle drug group and 7 for PHT drug group).
Immunohistochemistry assay was performed to detect Pgp expression at
the hippocampus. Nanoparticles were prepared by interfacial
polymerization method. Dialysate samples of brain were collected at 30, 60,
120, 180, 240 and 300 min after drug administration by microdialysis tech-
nology. Samples were analyzed by high performance liquid
chromatography (HPLC). Results The area under the curve (AUC) ratio of
brain/plasma in Nanoparticle drug group was 0.370.10 which was
significantly higher compared with 0.190.06 in conventional PHT drug
group (P<0.05). The Pgp immunopositive area, as assessed by analysis of
labeled surface area, was higher in the DG, CA3 and CA1 sector in the
hippocampus of MTLE rats when compared to the normal rats. Conclusions
Pluronic P85 coated PBCA nanoparticles can significantly deliver PHT into
brain via bypassing MTLE-induced Pgp in a rat model of MTLE.%目的 观察
普朗尼克P85修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯构建的苯妥英钠纳米粒能否避开颞叶内
侧癫痫大鼠模型脑中P糖蛋白(P-glycoprotein,Pgp)的外排作用将苯妥英钠靶向
输送到脑组织中.方法 锂-匹罗卡品诱导大鼠形成慢性颞叶内侧癫痫模型.免疫组化
检测脑组织中Pgp的表达水平.界面聚合法制备苯妥英钠纳米粒,与普通苯妥英钠比
较,观察两组不同给药的模型鼠(苯妥英钠纳米粒组6只,普通苯妥英钠组7只)在给
药后30、60、120、180、240、300 min时其脑组织中苯妥英钠的药物分布情况.
采用立体定向活体微透析技术采集脑微透析液,高效液相色谱法检测待测标本中苯
妥英钠的药物浓度.结果 两组不同给药的模型鼠的脑/血浆的时间药物浓度曲线的曲
线下面积比值差异有统计学意义[即苯妥英钠纳米粒组(0.37±0.10,n=6)明显高于普
通苯妥英钠组(0.19±0.06,n=7),P<0.05].与正常大鼠相比,模型鼠海马CA1、CA3
及DG区Pgp表达上调.结论 普朗尼克P85修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒可
显著地提高抗癫痫药物苯妥英钠靶向进入Pgp高表达的颞叶内侧癫痫模型鼠脑中
的浓度.
【期刊名称】《中国神经精神疾病杂志》
【年(卷),期】2017(043)006
【总页数】6页(P356-361)
【关键词】纳米粒;颞叶癫痫;P糖蛋白;苯妥英钠;靶向
【作 者】方子妍;郭彩凤;吴逢春;秦家明;宁玉萍;周列民
【作者单位】广州医科大学附属脑科医院(广州市惠爱医院) 广州 510370;广州医
科大学附属脑科医院(广州市惠爱医院) 广州 510370;广州医科大学附属脑科医院
(广州市惠爱医院) 广州 510370;中山大学附属第一医院 广州 510080;广州医科大
学附属脑科医院(广州市惠爱医院) 广州 510370;中山大学附属第一医院 广州
510080
【正文语种】中 文
【中图分类】R742.1
癫痫是中枢神经系统的第二大常见病。尽管近年来癫痫在治疗方法上已取得了长足
的进步，但合理、规则地服用抗癫痫药物（antiepileptic drugs，AEDs）仍是治
疗癫痫的主要手段。虽经正规的AEDs治疗，仍有约30%的癫痫患者其发作无法
控制，即耐药性癫痫[1-3]。而临床上耐药性癫痫以颞叶内侧癫痫 （mesial
temporal lobe epilepsy，MTLE）为多见。虽耐药性癫痫的病理生理机制存在多
种假说，但一个非常重要的特性就是该类癫痫对多种AEDs产生耐药，尽管这些
AEDs具有不同的作用机制[4]。因此更多的指向于多药转运体过度表达学说。研究
发现耐药性癫痫患者手术切除的脑组织中Pgp（多药转运体之一）过度表达，而
几乎所有的AEDs都是Pgp的底物。动物实验也进一步证实脑中Pgp过度表达导
致了药物耐受[5]。因此如何规避Pgp过度表达导致的耐药，保证AEDs靶向进入
癫痫灶是耐药性癫痫治疗领域的研究热点。近年来，纳米及相关材料技术飞速发展，
在生物医学领域得到了广泛的研究与应用。有研究发现聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒
是目前少数可通过血脑屏障的纳米微粒之一[6]。而普朗尼克P85是一种具有药理
活性的多功能药用辅料，在药物穿越血脑屏障的过程中起着重要作用，此外，普朗
尼克P85还具有Pgp抑制作用[7-9]。因此，本研究采用聚氰基丙烯酸正丁酯作为
苯妥英钠的载药材料，添加普朗尼克P85作为纳米粒的表面修饰，制作成苯妥英
钠纳米粒，以考察其在MTLE大鼠模型中的脑靶向输送苯妥英钠的效用。
1.1 实验动物32只雌性6～8周SD大鼠，体重160～180 g，由广东省实验动物
研究所提供。
1.2 MTLE模型的构建
1.2.1匹罗卡品诱导大鼠出现MTLE 32只大鼠腹腔注射氯化锂 （127.2 mg/kg）
（Sigma L9650-100G）；18～24 h后腹腔注射东莨菪碱 （1 mg/kg）（Sigma
S8502-1G）；之后30 min，腹腔注射匹罗卡品 （30 mg/kg）（Sigma P6503-
10G）；当大鼠出现RacineⅣ/Ⅴ发作后开始计时，等待发作持续90 min后再腹
腔注射地西泮注射液 （10 mg/kg）终止发作；存活的大鼠饲养出现慢性反复自发
性发作（即MTLE）。并记录相关视频脑电资料。
1.2.2大鼠癫痫发作评估按Racine标准[10]进行分级 Ⅰ级：面部阵挛；Ⅱ级：面
部阵挛+节律点头；Ⅲ级：面部阵挛+节律点头+前肢阵挛；Ⅳ级：面部阵挛+节律
点头+前肢阵挛+后肢站立；Ⅴ级：面部阵挛+节律点头+前肢阵挛+后肢站立+跌
倒+竖尾。
1.2.3脑电图描记 大鼠用10%水合氯醛麻醉后固定。电极插入大鼠头顶部双侧外
耳门连线内外1/3位点处头皮下固定于颅骨内，对照电极插入后颈部皮下，描记
脑电活动。
1.3 Pgp表达水平检测脑组织切片以非免疫性动物血清封闭，采用单克隆小鼠抗大
鼠Mdr C-19抗体（sc-1517，Santa Cruz Biotechnology，USA）混合稀释孵
育，最后免疫组化试剂盒 Dako K5007（DAB＋CHROMOGEN×50，5 mL）染
色[11]。
1.4 苯妥英钠纳米粒的制备及检测
1.4.1纳米粒的制备 将α-BCA（1%，v/v）（氰基丙烯酸正丁酯单体，1 mL，广
州白云医用胶公司）溶于 15 mL丙酮，Dextran-70（1%，w/v）（Sigma-
Aldrich，，Missouri，USA）及125 mg苯妥英钠溶于15 mL超纯
水，将有机相缓慢滴加入水相，800 rpm搅拌3 h，减压蒸馏去除丙酮，添加1%
普朗尼克P85[12]，0.45 μm膜过滤后4℃保存。
1.4.2物理性征检测 利用投射电镜、粒度仪（英国马尔文）、zeta电位仪检测纳
米粒的粒径、粒径分布及zeta电位。
1.4.3载药量和包封率的测定 采用SephadexG75凝胶柱纯化苯妥英钠纳米粒，
HPLC测定苯妥英钠浓度。计算载药量和包封率。
1.4.4纳米粒的体外释放 苯妥英钠纳米粒0.5 mL于透析袋中 （截留分子量
7000），40 mL生理盐水为释放介质，置于37℃恒温摇床中70 rpm旋转，于
15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、12 h、36 h、48 h取
样 1 mL，HPLC测定苯妥英钠浓度，计算各时间点累积释放度。
1.5 苯妥英钠纳米粒在MTLE模型鼠上的应用
1.5.1微透析探针局部立体定位[12]13只MTLE模型鼠颈静脉置管后固定在立体定
位仪上。坐标位置为：前囟后5.2 mm，左侧5.0 mm，探针置入前囟下7.5 mm。
1.5.2微透析步骤 微透析探针 （CMA/12，3-mm polycarbonate membrane，
cut off 20 kD，Carnegie Medicine，Sweden）置入后稳定2 h，普通苯妥英钠
组（n＝7）及苯妥英钠纳米粒组（n＝6）分别一次性静脉予苯妥英钠及苯妥英钠
纳米粒 （35 mg/kg）。于 30 min、60 min、120 min、180 min、240 min和
300 min取全血300 μL，12000 rpm离心4 min取上清，-20℃保存。同时收集
0～30 min、30～60 min、60～120 min、120～180 min、180～240 min和
240～300 min的微透析液，-20℃保存。微透析实验后取脑做切片验证探针针道
位置。
1.5.3HPLC检测苯妥英钠浓度[12]取待测样品90μL，加入内标卡马西平标准工作
液10 μL，乙酸乙酯萃取。真空干燥箱挥干后流动相复溶。HPLC色谱柱为
Waters XTerra MS C18 column（5 μm，4.6×150 mm，Waters，Milford，
USA），流动相为10 mmol/L磷酸盐缓冲液/乙腈 （65/35，V/V，pH 5.0），
流速1.0 mL/min，检测波长UV 205 nm，进样体积10 μL，分析时间7 min。
1.6 统计学方法采用 SPSS 20.0 （SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）进行统计学分
析。数据资料以（±s）表示，比较采用t检验 （或Wilcoxon秩和检验）。检验
水准α＝0.05，双侧检验。
2.1 锂-匹罗卡品诱导的MTLE大鼠模型的构建
2.1.1MTLE大鼠模型构建 锂-匹罗卡品化学诱导大鼠急性期出现持续状态的成功率
为93.75%（30/32），大鼠持续状态死亡率为10.0%（3/30）。MTLE建模成功
率为48.14%（13/27）。
2.1.2免疫组化检测脑中Pgp表达 模型鼠在海马CA1、CA3及DG区上Pgp的表
达较正常大鼠增高（图1）。
2.2 苯妥英钠纳米粒的物理特性
2.2.1苯妥英钠纳米粒的性征 电镜下，纳米药物为200 nm左右的圆形粒子，大小
均一，分散均匀。粒径为（268.00±2.54）nm，分散系数为0.19±0.01。zeta电
位为（-36.60±0.45）mv。包封率为96.63%± 5.53%。载药量为
22.00%±3.95%。
2.2.2苯妥英钠纳米粒的体外缓释能力 本研究制备的苯妥英钠纳米粒在1 h内具有
突释现象，之后开始缓慢释放，经60 h累积释放度超过80%，具有缓释效果。
2.3 苯妥英钠纳米粒应用于MTLE模型鼠的药代动力学结果
2.3.1脑微透析液中药物浓度 （如图2）两组模型鼠于一次给药后60 min普通苯
妥英钠组脑微透析液中药物浓度为最高，之后逐渐下降。而苯妥英钠纳米粒组脑微
透析液中药物浓度于120 min时为最高，之后逐渐下降，并且下降较前者稍迅速。
两组在每个时间点，其脑微透析液中药物浓度差异均有统计学意义（P＜0.05），
即苯妥英钠纳米粒组显著高于普通苯妥英钠组 （30 min：4.97±0.94与
2.14±0.16；60 min：5.14±0.95与2.93±0.58；120 min：5.32±1.42与
2.52±0.71；180 min：4.48±1.00与2.19±0.74；240 min：3.36±1.06与
1.90±0.71；300 min：3.20±0.49与1.83±0.65）。
2.3.2血浆中药物浓度 如图3，两组模型鼠于一次给药后30 min均为最高，之后
逐渐下降，而苯妥英钠纳米粒组药物浓度下降速度较快。两组在60 min、120
min、180 min、240 min及300 min其外周血中药物浓度差异均无统计学意义
（P＞0.05）（60 min：19.15±5.07 与 14.67±2.54；120 min：12.71±3.51与
12.46±3.22；180 min：9.12±2.86与 9.50±3.26；240 min：6.46±2.53与
9.50±3.26；300 min：4.96±2.57与 8.60±3.04），而在 30 min，苯妥英钠纳
米粒组药物浓度高于普通苯妥英钠组，具有统计学差异 （P＜0.05）（30 min：
21.51±1.55与18.82±2.00）。
2.3.3脑中药物分布 如图4，两组模型鼠的脑/血浆的时间药物浓度曲线的AUC比
值之间差异有统计学意义（P＜0.05），即药物在脑中的分布情况为苯妥英钠纳米
粒组显著高于普通苯妥英钠组）（0.37±0.10与0.1±0.06）。
本研究证实在海马锥体细胞层的神经元上可见免疫组化阳性染色表达，这种棕褐色
阳性染色在MTLE模型鼠海马的CA1、CA3、DG区更多，即Pgp蛋白表达增高。
近来研究证实，在杏仁核电刺激点燃模型鼠中，特别是在苯妥英钠耐药模型鼠的杏
仁核点燃同侧脑组织，相对于苯妥英钠药物反应模型鼠，其脑组织中Pgp的表达
存在着显著性的差异，Pgp阳性..表达的标记区域也增高将近2倍[13]。除此之外，
LöO SCHER等[5]提出杏仁核电点燃模型鼠中，苯巴比妥耐药模型鼠的脑中Pgp
表达水平也高于苯巴比妥反应组。这些研究结果均表明耐药模型鼠脑中Pgp表达
增高，给多药转运体与癫痫耐药的假说提供了支持理论[13]。由此推测在MTLE模
型中由于痫性发作诱导了Pgp过度表达，而Pgp的过度表达将使其作用即药物主
动外向转运增强，使到达药物作用靶点即致痫灶的药物浓度下降，导致癫痫发作不
能控制，最终耐药性癫痫形成。
研究发现，P85修饰的氰基丙烯酸正丁酯合成的纳米药物能显著地增加苯妥英钠
在脑组织中的分布，使脑/血的时间药物浓度曲线下AUC的比增高至正常药物的
近两倍水平。一次性静脉给药后，普通苯妥英钠给药的模型鼠的海马组织ECF的
药物浓度于60 min时为最高，之后随着时间下降，而给予苯妥英钠纳米粒的模型
组的药物浓度则于120 min时为最高，之后再随着时间下降。而药物浓度在达到
最高值后，苯妥英钠纳米粒组的海马组织ECF及血浆中的苯妥英钠浓度的下降速
度均快于普通苯妥英钠给药的模型组。在血浆中，从给药后120 min开始，苯妥
英钠浓度逐渐明显的低于普通苯妥英钠组，但在相同时间点，苯妥英钠纳米粒组的
海马组织ECF的药物浓度却仍显著地高于普通苯妥英钠组的水平。由此可见，本
课题构建的载药纳米粒具有较明显的脑靶向作用。虽然结果中已经证明苯妥英钠纳
米粒具有较好的体外缓释效果，但是相比于传统苯妥英钠，在血循环中其药物浓度
下降更为迅速，可能与循环中单核吞噬细胞系统清除纳米粒有关[14]，鉴于此，可
以进一步优化苯妥英钠纳米粒物理性征来减少其清除率。
纳米载体介导药物通过血脑屏障的机制目前尚未完全阐述清楚。近年来一些新的机
制陆续被提出并证实[15]。据研究，经过聚山梨醇酯80修饰的聚氰基丙烯酸正丁
酯载药纳米粒在进入外周血循环后吸附血液中的载脂蛋白ApoE和ApoB，而聚山
梨醇酯80做为结合脂蛋白和纳米粒的链接点[16]。其中，ApoE在低密度脂蛋白
的脑转运中有重要作用[17-19]。而普朗尼克P85是否起到与聚山梨醇酯80类似
作用，使苯妥英钠纳米粒模仿低密度脂蛋白与脑中毛细血管内皮细胞相互作用，最
终将药物通过受体介导的细胞内吞方式而进入脑组织中。进一步的研究提出，通过
抗生物素蛋白的方式将载脂蛋白ApoE与包裹人类血清蛋白的纳米粒相连接，再
包裹左旋多巴，能证明载脂蛋白ApoE在脑给药转运中具有呈剂量依赖性的作用。
近来也有研究其它载脂蛋白ApoE3、B-100和A-I在脑靶向给药系统中所起的作
用[20-21]。但关于该研究中的聚氰基丙烯酸正丁酯包裹的苯妥英钠纳米粒的脑靶
向的作用机制尚需进一步的研究证实，并且在本研究的基础上将苯妥英钠纳米粒进
一步优化，为耐药性癫痫寻找一个切实有效的治疗方法。
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2024年5月26日发(作者：宝豫)
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【摘 要】Objective In order to evaluate that whether Pluronic P85 coated
poly(butylcyanoacrylate) nanoparti-cles was able to deliver antiepileptic
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(MTLE)-induced Pgp in a rat model of MTLE. Methods The rat model of
MTLE, induced by li-pilocarpine, was divided in-to two groups (6 for
nanoparticle drug group and 7 for PHT drug group).
Immunohistochemistry assay was performed to detect Pgp expression at
the hippocampus. Nanoparticles were prepared by interfacial
polymerization method. Dialysate samples of brain were collected at 30, 60,
120, 180, 240 and 300 min after drug administration by microdialysis tech-
nology. Samples were analyzed by high performance liquid
chromatography (HPLC). Results The area under the curve (AUC) ratio of
brain/plasma in Nanoparticle drug group was 0.370.10 which was
significantly higher compared with 0.190.06 in conventional PHT drug
group (P<0.05). The Pgp immunopositive area, as assessed by analysis of
labeled surface area, was higher in the DG, CA3 and CA1 sector in the
hippocampus of MTLE rats when compared to the normal rats. Conclusions
Pluronic P85 coated PBCA nanoparticles can significantly deliver PHT into
brain via bypassing MTLE-induced Pgp in a rat model of MTLE.%目的 观察
普朗尼克P85修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯构建的苯妥英钠纳米粒能否避开颞叶内
侧癫痫大鼠模型脑中P糖蛋白(P-glycoprotein,Pgp)的外排作用将苯妥英钠靶向
输送到脑组织中.方法 锂-匹罗卡品诱导大鼠形成慢性颞叶内侧癫痫模型.免疫组化
检测脑组织中Pgp的表达水平.界面聚合法制备苯妥英钠纳米粒,与普通苯妥英钠比
较,观察两组不同给药的模型鼠(苯妥英钠纳米粒组6只,普通苯妥英钠组7只)在给
药后30、60、120、180、240、300 min时其脑组织中苯妥英钠的药物分布情况.
采用立体定向活体微透析技术采集脑微透析液,高效液相色谱法检测待测标本中苯
妥英钠的药物浓度.结果 两组不同给药的模型鼠的脑/血浆的时间药物浓度曲线的曲
线下面积比值差异有统计学意义[即苯妥英钠纳米粒组(0.37±0.10,n=6)明显高于普
通苯妥英钠组(0.19±0.06,n=7),P<0.05].与正常大鼠相比,模型鼠海马CA1、CA3
及DG区Pgp表达上调.结论 普朗尼克P85修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒可
显著地提高抗癫痫药物苯妥英钠靶向进入Pgp高表达的颞叶内侧癫痫模型鼠脑中
的浓度.
【期刊名称】《中国神经精神疾病杂志》
【年(卷),期】2017(043)006
【总页数】6页(P356-361)
【关键词】纳米粒;颞叶癫痫;P糖蛋白;苯妥英钠;靶向
【作 者】方子妍;郭彩凤;吴逢春;秦家明;宁玉萍;周列民
【作者单位】广州医科大学附属脑科医院(广州市惠爱医院) 广州 510370;广州医
科大学附属脑科医院(广州市惠爱医院) 广州 510370;广州医科大学附属脑科医院
(广州市惠爱医院) 广州 510370;中山大学附属第一医院 广州 510080;广州医科大
学附属脑科医院(广州市惠爱医院) 广州 510370;中山大学附属第一医院 广州
510080
【正文语种】中 文
【中图分类】R742.1
癫痫是中枢神经系统的第二大常见病。尽管近年来癫痫在治疗方法上已取得了长足
的进步，但合理、规则地服用抗癫痫药物（antiepileptic drugs，AEDs）仍是治
疗癫痫的主要手段。虽经正规的AEDs治疗，仍有约30%的癫痫患者其发作无法
控制，即耐药性癫痫[1-3]。而临床上耐药性癫痫以颞叶内侧癫痫 （mesial
temporal lobe epilepsy，MTLE）为多见。虽耐药性癫痫的病理生理机制存在多
种假说，但一个非常重要的特性就是该类癫痫对多种AEDs产生耐药，尽管这些
AEDs具有不同的作用机制[4]。因此更多的指向于多药转运体过度表达学说。研究
发现耐药性癫痫患者手术切除的脑组织中Pgp（多药转运体之一）过度表达，而
几乎所有的AEDs都是Pgp的底物。动物实验也进一步证实脑中Pgp过度表达导
致了药物耐受[5]。因此如何规避Pgp过度表达导致的耐药，保证AEDs靶向进入
癫痫灶是耐药性癫痫治疗领域的研究热点。近年来，纳米及相关材料技术飞速发展，
在生物医学领域得到了广泛的研究与应用。有研究发现聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒
是目前少数可通过血脑屏障的纳米微粒之一[6]。而普朗尼克P85是一种具有药理
活性的多功能药用辅料，在药物穿越血脑屏障的过程中起着重要作用，此外，普朗
尼克P85还具有Pgp抑制作用[7-9]。因此，本研究采用聚氰基丙烯酸正丁酯作为
苯妥英钠的载药材料，添加普朗尼克P85作为纳米粒的表面修饰，制作成苯妥英
钠纳米粒，以考察其在MTLE大鼠模型中的脑靶向输送苯妥英钠的效用。
1.1 实验动物32只雌性6～8周SD大鼠，体重160～180 g，由广东省实验动物
研究所提供。
1.2 MTLE模型的构建
1.2.1匹罗卡品诱导大鼠出现MTLE 32只大鼠腹腔注射氯化锂 （127.2 mg/kg）
（Sigma L9650-100G）；18～24 h后腹腔注射东莨菪碱 （1 mg/kg）（Sigma
S8502-1G）；之后30 min，腹腔注射匹罗卡品 （30 mg/kg）（Sigma P6503-
10G）；当大鼠出现RacineⅣ/Ⅴ发作后开始计时，等待发作持续90 min后再腹
腔注射地西泮注射液 （10 mg/kg）终止发作；存活的大鼠饲养出现慢性反复自发
性发作（即MTLE）。并记录相关视频脑电资料。
1.2.2大鼠癫痫发作评估按Racine标准[10]进行分级 Ⅰ级：面部阵挛；Ⅱ级：面
部阵挛+节律点头；Ⅲ级：面部阵挛+节律点头+前肢阵挛；Ⅳ级：面部阵挛+节律
点头+前肢阵挛+后肢站立；Ⅴ级：面部阵挛+节律点头+前肢阵挛+后肢站立+跌
倒+竖尾。
1.2.3脑电图描记 大鼠用10%水合氯醛麻醉后固定。电极插入大鼠头顶部双侧外
耳门连线内外1/3位点处头皮下固定于颅骨内，对照电极插入后颈部皮下，描记
脑电活动。
1.3 Pgp表达水平检测脑组织切片以非免疫性动物血清封闭，采用单克隆小鼠抗大
鼠Mdr C-19抗体（sc-1517，Santa Cruz Biotechnology，USA）混合稀释孵
育，最后免疫组化试剂盒 Dako K5007（DAB＋CHROMOGEN×50，5 mL）染
色[11]。
1.4 苯妥英钠纳米粒的制备及检测
1.4.1纳米粒的制备 将α-BCA（1%，v/v）（氰基丙烯酸正丁酯单体，1 mL，广
州白云医用胶公司）溶于 15 mL丙酮，Dextran-70（1%，w/v）（Sigma-
Aldrich，，Missouri，USA）及125 mg苯妥英钠溶于15 mL超纯
水，将有机相缓慢滴加入水相，800 rpm搅拌3 h，减压蒸馏去除丙酮，添加1%
普朗尼克P85[12]，0.45 μm膜过滤后4℃保存。
1.4.2物理性征检测 利用投射电镜、粒度仪（英国马尔文）、zeta电位仪检测纳
米粒的粒径、粒径分布及zeta电位。
1.4.3载药量和包封率的测定 采用SephadexG75凝胶柱纯化苯妥英钠纳米粒，
HPLC测定苯妥英钠浓度。计算载药量和包封率。
1.4.4纳米粒的体外释放 苯妥英钠纳米粒0.5 mL于透析袋中 （截留分子量
7000），40 mL生理盐水为释放介质，置于37℃恒温摇床中70 rpm旋转，于
15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、12 h、36 h、48 h取
样 1 mL，HPLC测定苯妥英钠浓度，计算各时间点累积释放度。
1.5 苯妥英钠纳米粒在MTLE模型鼠上的应用
1.5.1微透析探针局部立体定位[12]13只MTLE模型鼠颈静脉置管后固定在立体定
位仪上。坐标位置为：前囟后5.2 mm，左侧5.0 mm，探针置入前囟下7.5 mm。
1.5.2微透析步骤 微透析探针 （CMA/12，3-mm polycarbonate membrane，
cut off 20 kD，Carnegie Medicine，Sweden）置入后稳定2 h，普通苯妥英钠
组（n＝7）及苯妥英钠纳米粒组（n＝6）分别一次性静脉予苯妥英钠及苯妥英钠
纳米粒 （35 mg/kg）。于 30 min、60 min、120 min、180 min、240 min和
300 min取全血300 μL，12000 rpm离心4 min取上清，-20℃保存。同时收集
0～30 min、30～60 min、60～120 min、120～180 min、180～240 min和
240～300 min的微透析液，-20℃保存。微透析实验后取脑做切片验证探针针道
位置。
1.5.3HPLC检测苯妥英钠浓度[12]取待测样品90μL，加入内标卡马西平标准工作
液10 μL，乙酸乙酯萃取。真空干燥箱挥干后流动相复溶。HPLC色谱柱为
Waters XTerra MS C18 column（5 μm，4.6×150 mm，Waters，Milford，
USA），流动相为10 mmol/L磷酸盐缓冲液/乙腈 （65/35，V/V，pH 5.0），
流速1.0 mL/min，检测波长UV 205 nm，进样体积10 μL，分析时间7 min。
1.6 统计学方法采用 SPSS 20.0 （SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）进行统计学分
析。数据资料以（±s）表示，比较采用t检验 （或Wilcoxon秩和检验）。检验
水准α＝0.05，双侧检验。
2.1 锂-匹罗卡品诱导的MTLE大鼠模型的构建
2.1.1MTLE大鼠模型构建 锂-匹罗卡品化学诱导大鼠急性期出现持续状态的成功率
为93.75%（30/32），大鼠持续状态死亡率为10.0%（3/30）。MTLE建模成功
率为48.14%（13/27）。
2.1.2免疫组化检测脑中Pgp表达 模型鼠在海马CA1、CA3及DG区上Pgp的表
达较正常大鼠增高（图1）。
2.2 苯妥英钠纳米粒的物理特性
2.2.1苯妥英钠纳米粒的性征 电镜下，纳米药物为200 nm左右的圆形粒子，大小
均一，分散均匀。粒径为（268.00±2.54）nm，分散系数为0.19±0.01。zeta电
位为（-36.60±0.45）mv。包封率为96.63%± 5.53%。载药量为
22.00%±3.95%。
2.2.2苯妥英钠纳米粒的体外缓释能力 本研究制备的苯妥英钠纳米粒在1 h内具有
突释现象，之后开始缓慢释放，经60 h累积释放度超过80%，具有缓释效果。
2.3 苯妥英钠纳米粒应用于MTLE模型鼠的药代动力学结果
2.3.1脑微透析液中药物浓度 （如图2）两组模型鼠于一次给药后60 min普通苯
妥英钠组脑微透析液中药物浓度为最高，之后逐渐下降。而苯妥英钠纳米粒组脑微
透析液中药物浓度于120 min时为最高，之后逐渐下降，并且下降较前者稍迅速。
两组在每个时间点，其脑微透析液中药物浓度差异均有统计学意义（P＜0.05），
即苯妥英钠纳米粒组显著高于普通苯妥英钠组 （30 min：4.97±0.94与
2.14±0.16；60 min：5.14±0.95与2.93±0.58；120 min：5.32±1.42与
2.52±0.71；180 min：4.48±1.00与2.19±0.74；240 min：3.36±1.06与
1.90±0.71；300 min：3.20±0.49与1.83±0.65）。
2.3.2血浆中药物浓度 如图3，两组模型鼠于一次给药后30 min均为最高，之后
逐渐下降，而苯妥英钠纳米粒组药物浓度下降速度较快。两组在60 min、120
min、180 min、240 min及300 min其外周血中药物浓度差异均无统计学意义
（P＞0.05）（60 min：19.15±5.07 与 14.67±2.54；120 min：12.71±3.51与
12.46±3.22；180 min：9.12±2.86与 9.50±3.26；240 min：6.46±2.53与
9.50±3.26；300 min：4.96±2.57与 8.60±3.04），而在 30 min，苯妥英钠纳
米粒组药物浓度高于普通苯妥英钠组，具有统计学差异 （P＜0.05）（30 min：
21.51±1.55与18.82±2.00）。
2.3.3脑中药物分布 如图4，两组模型鼠的脑/血浆的时间药物浓度曲线的AUC比
值之间差异有统计学意义（P＜0.05），即药物在脑中的分布情况为苯妥英钠纳米
粒组显著高于普通苯妥英钠组）（0.37±0.10与0.1±0.06）。
本研究证实在海马锥体细胞层的神经元上可见免疫组化阳性染色表达，这种棕褐色
阳性染色在MTLE模型鼠海马的CA1、CA3、DG区更多，即Pgp蛋白表达增高。
近来研究证实，在杏仁核电刺激点燃模型鼠中，特别是在苯妥英钠耐药模型鼠的杏
仁核点燃同侧脑组织，相对于苯妥英钠药物反应模型鼠，其脑组织中Pgp的表达
存在着显著性的差异，Pgp阳性..表达的标记区域也增高将近2倍[13]。除此之外，
LöO SCHER等[5]提出杏仁核电点燃模型鼠中，苯巴比妥耐药模型鼠的脑中Pgp
表达水平也高于苯巴比妥反应组。这些研究结果均表明耐药模型鼠脑中Pgp表达
增高，给多药转运体与癫痫耐药的假说提供了支持理论[13]。由此推测在MTLE模
型中由于痫性发作诱导了Pgp过度表达，而Pgp的过度表达将使其作用即药物主
动外向转运增强，使到达药物作用靶点即致痫灶的药物浓度下降，导致癫痫发作不
能控制，最终耐药性癫痫形成。
研究发现，P85修饰的氰基丙烯酸正丁酯合成的纳米药物能显著地增加苯妥英钠
在脑组织中的分布，使脑/血的时间药物浓度曲线下AUC的比增高至正常药物的
近两倍水平。一次性静脉给药后，普通苯妥英钠给药的模型鼠的海马组织ECF的
药物浓度于60 min时为最高，之后随着时间下降，而给予苯妥英钠纳米粒的模型
组的药物浓度则于120 min时为最高，之后再随着时间下降。而药物浓度在达到
最高值后，苯妥英钠纳米粒组的海马组织ECF及血浆中的苯妥英钠浓度的下降速
度均快于普通苯妥英钠给药的模型组。在血浆中，从给药后120 min开始，苯妥
英钠浓度逐渐明显的低于普通苯妥英钠组，但在相同时间点，苯妥英钠纳米粒组的
海马组织ECF的药物浓度却仍显著地高于普通苯妥英钠组的水平。由此可见，本
课题构建的载药纳米粒具有较明显的脑靶向作用。虽然结果中已经证明苯妥英钠纳
米粒具有较好的体外缓释效果，但是相比于传统苯妥英钠，在血循环中其药物浓度
下降更为迅速，可能与循环中单核吞噬细胞系统清除纳米粒有关[14]，鉴于此，可
以进一步优化苯妥英钠纳米粒物理性征来减少其清除率。
纳米载体介导药物通过血脑屏障的机制目前尚未完全阐述清楚。近年来一些新的机
制陆续被提出并证实[15]。据研究，经过聚山梨醇酯80修饰的聚氰基丙烯酸正丁
酯载药纳米粒在进入外周血循环后吸附血液中的载脂蛋白ApoE和ApoB，而聚山
梨醇酯80做为结合脂蛋白和纳米粒的链接点[16]。其中，ApoE在低密度脂蛋白
的脑转运中有重要作用[17-19]。而普朗尼克P85是否起到与聚山梨醇酯80类似
作用，使苯妥英钠纳米粒模仿低密度脂蛋白与脑中毛细血管内皮细胞相互作用，最
终将药物通过受体介导的细胞内吞方式而进入脑组织中。进一步的研究提出，通过
抗生物素蛋白的方式将载脂蛋白ApoE与包裹人类血清蛋白的纳米粒相连接，再
包裹左旋多巴，能证明载脂蛋白ApoE在脑给药转运中具有呈剂量依赖性的作用。
近来也有研究其它载脂蛋白ApoE3、B-100和A-I在脑靶向给药系统中所起的作
用[20-21]。但关于该研究中的聚氰基丙烯酸正丁酯包裹的苯妥英钠纳米粒的脑靶
向的作用机制尚需进一步的研究证实，并且在本研究的基础上将苯妥英钠纳米粒进
一步优化，为耐药性癫痫寻找一个切实有效的治疗方法。
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