2024年5月27日发(作者：红乐英)
北方园艺２０１０（６）：５～７ ・试验研究・
嘎拉苹果单芽系组培苗的获得
高 兵 。，孙 俊 。，章 镇
（１．南京农业大学园艺学院，江苏南京２１００９５；２．山西林业职业技术学院园艺系，山西太原０３０００９；３．安徽农业大学园艺学院，安徽合肥２３００３６）
摘 要：以皇家嘎拉苹果芽为外植体，研究不同消毒方法、消毒时间、不同防褐化措施和不同
激素配比对组培苗获得的影响。结果表明：嘎拉芽消毒选择０．１％ＨｇＣＩ：消毒７ ｍｉｎ为宜；接种
前使用４ ｇ／Ｉ ＰＶＰ、接种后暗培养１０ ｄ左右可以较有效地减轻褐变；诱导、增殖培养基是ＭＳ＋
ＢＡ ２．０ ｍｇ／Ｉ ＋ＮＡＡ ０．１ ｍｇ，／Ｉ ，继代、扩繁培养基是ＭＳ＋ＢＡ ０．５ ｒａｇ／Ｉ 十ＮＡＡ ０．１ ｍｇ／Ｉ ；继代
周期以２８４３０ ｄ为宜。
关键词：苹果；组培苗；消毒方法；防褐措施；激素配比
中图分类号：Ｓ ６６１．１０３．４文献标识码：Ａ文章编号：１００１—０００９（２０１０）０６—０００５—０３
１．２．２防褐化处理接种前，采用培养基中附加Ｖｃ、
植物组织培养技术不仅是植物体细胞遗传学的基
础，而且对理论研究和植物基因工程以及农作物品种改
良和种苗快速繁育都有重大意义。应用组织培养实现
苹果的快速繁殖、无病毒苹果苗的产生以及基因变异从
Ａｃ、ＰＶＰ和对芽进行４℃低温处理、Ｎａｅ Ｓ２（ 浸泡的方
法。每种处理接种６瓶，每瓶２个芽，重复２次。接种
后，采取间隔不同天数更换培养基，以确定最佳的防褐
措施。
而获得新品种苹果等具有重要的研究价值。前人在苹
果组织培养中已经做了大量研究，但对于苹果单芽系组
培苗研究尚未报道。试验以嘎拉苹果为材料，研究影响
嘎拉苹果单芽系组培苗繁殖体系建立的因素，主要针对
组织培养中常遇到的外植体污染、褐化和玻璃化苗问题
进行研究，为实现嘎拉苹果的快速繁育和基因工程的应
用提供有力的保障。
１．２．３组培苗的快繁与继代 以ＭＳ为基本培养基，使
用激素ＢＡ和ＮＡＡ进行了２Ｏ种浓度组合，每个浓度组
合接种６瓶，每瓶选取生长势相对一致的２个顶芽，
（３０±２）ｄ继代１次，统计每组处理芽增殖数量和生长
情况，重复２次。另外，分别以（１６±２）、（２６±２）、（３４±
２）ｄ为继代周期进行继代培养。
１材料与方法
１．１试验材料
“皇家嘎拉”苹果（Ｍａｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃａ Ｂｏｒｋｈ Ｃ Ｖ．Ｒｏｙａｌ
Ｇａｌａ），２００３年春天从徐州果园采集未萌芽的１ ａ生枝
２结果与分析
２．１ 不同消毒时间对外植体污染率与成活率的影响
由表ｌ可知，处理２比处理１的７Ｏ 酒精消毒时间
长５ Ｓ，污染率少３０．３４％，同时成活率也少３９．６７ Ａ；处 ０
理３、处理４和处理５相比，随着０．１％升汞＋吐温时间
条，保湿于４￣Ｃ冰箱。基本培养基为ＭＳ＋ＢＡ ２．０ ｒｎｇ／Ｌ十
ＮＡＡ ０．１ ｒａｇ／Ｉ 。
的加长，成活率降低。说明植物的芽对酒精比较敏感，
使用酒精消毒的时间较长时，虽然污染率比较低，但对
从冰箱中取出枝条，于恒温培养箱
１．２试验方法
１．２．１外植体消毒
（２５。Ｃ）中水培催芽，直至芽萌发并露出２～３片叶。用手
外植体易造成伤害。处理６和处理７消毒方法中，０．１
升汞＋吐温消毒７ Ｓ的污染率是消毒 Ｓ的１．８７５倍，但
是成活率却是消毒５ Ｓ的７８．９２ ；处理８和处理９消毒
术刀将萌发的芽从枝条上取下，流水冲洗２～３ ｈ后，在
无菌超净台上利用不同方法对外植体消毒不同的时间，
每种处理接种６瓶，每瓶２个芽，重复２次。
方法中，０．１ 升汞＋吐温消毒７ ｓ的污染率是消毒５ Ｓ
的７９．１Ｏ ，成活率是消毒５ Ｓ的１．０２倍。说明尽管
ＨｇＣ１ 杀毒效果很好，但是对外植体却有很强的杀伤作
用，抑制外植体的萌芽生长，尤其是随着处理时间的加
第一作者简介：高兵（１９７９一），女，山西太原人，硕士，现从事园艺教
学工作。
长，毒害的作用也加强。经９种处理后的统计数据值可
以看出，０．１ ＨｇＣ１。消毒７ ｍｉｎ的试验结果好，外植体
的成活率高，为７９．２ ，污染率较低，为２２．５ 。因此，
嘎拉芽消毒选择０．１ ＨｇＣｌ 消毒７ ｍｉｎ为宜，不需经
酒精消毒。
通讯作者：章镇（１９４７一），男，硕士，教授，博士生导师，现从事果树
学的科研与教学工作。Ｅ ｍａｉｌ：ｇｂｓｕｓａｎ．ｓｔｕｄｅｎｔ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。
基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０２００１９０）。
收稿日期：２００９—１２—０４
５
・
试验研究・
表１ 不同消毒处理对外檀体的影响
Ｔａｂｌｅ １ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｌａｎｔｓ
无菌水
７０ 酒
污染率 成活率
处理 浸泡 精
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ（）ｆ Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ａｓｅｐｔｉｃ ｗａｔｅｒ
７０
ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｖｅ ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ
ｄｉｐｐｉｎｇ／ｍｉｎ
Ａｌｃｏｈｏｌ／ｓ
ｅｘｐｌａｎｌｓ， ｅｘｐｌａｎｔｓ，
艨温 ” ¨ ～
驼 驼毖 卯 珀
３ ５ ２ ５ ３ ５ ４ ６
２．２防褐化措施对褐化率的影响
２．２．１接种前不同防褐化措施对褐化率的影响 由表
２看出，在接种３０ ｄ统计褐变程度及褐变率，发现接种
∞ 叭蚰蛆
３ １ ２ ３ ３ ３ ２
前采取不同的防褐措施后，都能比较明显地抑制外植体
的褐变，减轻组织和培养基的褐变程度。抗褐变剂种类
不同，其效果不同，其中ＰＶＰ对于防止外植体褐变效果
最好，外植体褐变度最小，褐变率最小的仅为３６．７％０，为
对照７６．７ 的一半左右。Ｖｃ较差些，最小的为５３．６ Ａ，０
活性炭的效果最差，为６８．Ｏ 。抗褐变剂浓度不同，效
果也不同，随着ＰＶＰ浓度的增大，外植体的褐变度降低，
浓度为４ ｇ／Ｌ的效果最好，浓度为２ ｇ／Ｌ效果较好；
１ ｇ／Ｌ的Ｖｃ比２ Ｌ效果更好，褐变率分别为５３．６
和５８．２ ；对于Ａｃ，与２ ｇ／Ｌ和３ ｇ／Ｌ相比，１ ｇ／Ｌ防褐
变的效果最差，褐变程度最大，褐变率最高，随着浓度的
增加，褐变程度降低，褐变率变化较小。消毒前４℃处理
芽的防褐效果较好，随处理时间的增加，褐变程度及褐
变率都有所降低，但变化不大。２ Ｎａ２ 浸泡２０ ｍｉｎ
比３０ ｍｉｎ的褐变率低，可能是因为浸泡时间增加，Ｓ离
子对组织的伤害加重。结果表明，接种前使用４ Ｉ ＰＶＰ
防褐化效果最好。
表２接种前不同防褐化处理对褐变的影响
Ｔａｂｌｅ ２ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ ｂｅｆｏｒｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
６
北方园艺２０１０（６）：５～７
２．２．２接种后不同防褐化措施对褐化率的影响 由表
３可看出，接种后３ ｄ更换培养基明显比９ ｄ褐变程度、
褐变率低，１５ ｄ才更换培养基的，褐变程度严重，而且褐
变率达到１００ ；暗培养天数的多少会明显的影响芽的
褐变程度，暗培养３ ｄ不仅褐变情况较严重，而且褐变率
均在６０ 以上，暗培养６ ｄ的褐变率也较高，只有短时间
内（３ ｄ）更换培养基才会降低褐变率，当暗培养达到１０ ｄ
时，褐变程度和褐变率都有明显下降，最低为１２．５ 。综
上所述，芽接种后暗培养１０ ｄ左右可以有效地减轻褐
变，结合每３ ｄ更换培养基将能达到更理想的防褐效果。
表３接种后不同防褐化处理对褐变的影响
Ｔａｂｌｅ ３ Ｅｆｆｅｃｔ ＯＤ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｂｙ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
注：接种前、后的防褐措施分别进＿ｆ丁
Ｎｏｔｅ：Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｂｅｆｏｒｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｒ ａｆｔｅｒ ｉｔ ｉｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ
２．３组培苗的快速繁殖
２．３．１激素浓度配比对快繁的影响 由表４看出，就
ＢＡ单因素来看，随着ＢＡ浓度的升高，芽的诱导率及每
个外植体上的平均芽数基本也呈上升的趋势。ＢＡ为
４．０ ｍｇ／Ｉ 的组合，芽的增殖数平均约为接种时２个的近
６倍，但同时植株的玻璃化现象也明显增加。一般认为，
培养基中ＢＡ含量的高低，直接影响玻璃化苗的发生与
否，只有细胞分裂素与生长素的合理搭配，才能达到理
想的生长分化效果。试验中ＢＡ为０．５～１．０ ｍｇ／Ｌ时，
玻璃化率为０，ＢＡ为４．０ ｍｇ／Ｌ时，玻璃化率高达
３３．３ ，当ＢＡ浓度小于２．０ ｍｇ／Ｌ时，ＢＡ：ＮＡＡ在
（５：１）～（２０：１），没有玻璃化现象。另有研究表明，ＢＡ
浓度高时，植株生长高度会受到抑制，该试验也可看出
这～点，ＢＡ为４．０ ｒａｇ／Ｉ 时，植株的高度均明显下降。
ＢＡ浓度在０．５～ｌ＿０ ｍｇ／Ｌ的组合，芽的分化数量较少，
生长缓慢且叶片小而发黄，不利于快繁。综合以上各
点，从芽的分化量、生长势及玻璃化程度考虑，组合
ＢＡ／ＮＡＡ为２．ｏ／０．１最适合嘎拉苹果芽的快繁，芽平均
增殖５倍，植株高２．０３ ｃｍ，无玻璃化现象。
２．３．２继代周期对芽增殖和生长的影响 据预备试验
的观察，从芽的增殖数量、生长势和生长速度考虑，嘎拉
苹果芽继代培养与扩大繁殖采用ＭＳ＋ＢＡ ０．５ ｍｇ／Ｌ十
ＮＡＡ ０．１ ｒａｇ／Ｉ 最为适宜，这时芽的增殖数基本稳定在
５倍左右，生长迅速，生长势强，芽苗深绿色。芽经过诱
北方园艺２ｏｉｏ（６）：５～７
表４嘎拉快繁激素浓度对植株生长的影响
Ｔａｂｌｅ ４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ
ｏｆ ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｌｎ‘Ｇａｌａ’
・试验研究・
可促进试管苗的生长和酶物质的增加ｌ３ ］。试验中的嘎
拉，接种前培养基添加４ ｇ／Ｌ ＰＶＰ，接种后暗培养１０ ｄ，
３ ｄ更换１次培养基都能有效地减轻褐变程度，提高芽
玻璃化率
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ
ｇｌａｓｓ ｓ｝ｌ０。ｔ／
激素浓度组合
Ｃｏｍｂｉｎｅｓ ｏｆ
培养 ｄ芽数
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｓｈｏｏｔｓ
植株平均高度
Ａｖｅｒａｇｅ ｌｅｎｇｌｈ
的成活率。
培养基的筛选是组织培养的基本内容之一，一般来
说，在茎尖培养和芽诱导时主要用ＭＳ培养基 。植物
生长调节物质种类及浓度搭配的合理选择，是组织培养
的初代芽诱导成功与否的关键。对诱导出的芽进行增
殖及继代培养，是植物组织培养成功与否的关键。该试
验发现，分化率及其生长量不仅取决于ＢＡ、ＮＡＡ的浓
度和外植体的质量，而且取决于激素的配比。在外植体
质量相近的情况下，ＢＡ和ＮＡＡ达到设定的最低或最高
浓度时，分化率较小；ＢＡ ２．０ ｍｇ／Ｉ 、ＮＡＡ ０．１ ｍｇ／Ｌ时，
。ｆｔｅ ｗｅｎｔｙ ｅ ｇ
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３ １ ７
分化率较高，且没有玻璃化苗现象。孙爱君等 研究表
明，ＢＡ与ＮＡＡ比值为２ｏ时，分化效果最好。继代培养
则选择ＭＳ＋ＢＡ ０．５ ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ ０．１ ｍｇ／Ｌ的培养基，
导或增殖后在同一培养基上培养时间过长会使材料干
枯，长势减弱，最终逐渐死亡。因此适时地对芽进行转
接培养是十分必要的。嘎拉增殖培养中１４ ｄ左右才出
继代周期以增殖培养后２８～３０ ｄ为佳，太早或太迟均
不利。
参考文献
［１］Ｙｕ Ｕ，Ｐｍｅｒｅｄｉｔｈ Ｃ．Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｅｘｐｌａｎｔ ｏｒｉｇｉｎ ｏｎ ｔｉｓｓｕｅ ｂｒｏｗｎｉｎｇ
ａｎｄ ｓｈｏｏｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｈｏｏｔ ｔｉｐ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｇｒａｐｅｃｉｎｅ［Ｊ］．Ｊａｍｅｒ Ｓｏｃ Ｈｏｒｔ
Ｓｃｉ，１９８６：４５６—４６６．
现新的小芽，２８ ｄ后每个新增殖的小芽有１～２片小叶
产生，此时芽生长的较健壮，随着芽增殖数量及每个小
芽上叶片数目的增多，芽的生长逐渐变慢，并有部分芽
开始变枯，如果此时仍不进行转接，将严重影响芽的生
［２］韩素英，齐立旺，张淑改，等．核桃组培中防止组织氧化褐变措施的
研究［Ｊ］．山西农业大学学报，１９９５，１５（４）：３３９ ３４１．
长。因此，２８～３０ ｄ进行转接继代是比较合适的，此时
转接，不但可使芽的增殖系数达到５倍左右，而且转接
后，芽生长较健壮。如果转接的太早，如１８￣２２ ｄ，不但会
［３］裴东，郑均宝，凌艳荣，等．红富士苹果试管培养中器官分化及其部
分生理指标的研究口］．园艺学报，１９９７，２４（３）：２２９ ２３４．
［４］裴东，袁丽钗，奚声珂．核桃品种试管嫩茎生根的研究口］．林业科学，
２００２，３８（２）：３２—３８．
减少增殖的数量，而且后代的生长状况也不好。
［５］师校欣，杜国强，高仪，等．黑暗培养对苹果组培快繁及叶片再生的
影响＿Ｊ］．河北农业大学学报，２００４，２７（４）：１８ ２１．
［６］ 袁巧平．生物技术与林木试管微型选育口］．世界林业研究，１９９０（３）：
５１－５５．
３结论与讨论
试验采用了在室内水培的方法，既避免了大范围的
污染，又使消毒用的时间相对比较短。褐变是植物组织
培养过程中普遍存在的现象ｕ ，在外植体接种前，用抗
氧化剂浸泡一定时问，能收到一定效果［ ，在培养基中
加入吸附剂（Ａｃ和ＰＶＰ）可以抑制褐变。适当的暗培养
［７］孙爱君，章镇，姚泉洪，等．苹果与八棱海棠的试管苗外植体植株再
牛ｒＩ］．Ｅ海农、 学报，２０００，１６（２）：２３—３０．
Ｇａｌａ Ａｐｐｌｅ Ａｃｃｅｓｓ ｔｏ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｕｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ
ＧＡ０ Ｂｉｎｇ ，ＳＵＮ ＪＨｎ 。，ＺＨＡＮＧ Ｚｈｅｎ
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ，Ｊｉａｎｇｓｕ ２１００９５；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｓｈａｎｘｉ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｖｏｃａｔｉｏｎ—
ａｌ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｙｕａｎ，Ｓｈａｎｘｉ ０３０００９；３．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ，Ａｎｈｕｉ ２３００３６）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｂｕｄｓ ｓｐｒｏｕｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｕｔｔｉｎｇ ｓｈｏｏｔｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｗａｔｅｒ ｉｎ ａ ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ
ｏｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｎｔ ｏｆ Ｒｏｙａｌ Ｇａｌａ ａｐｐｌｅ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｔｉｍｅｓ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｍｅｔｈ—
ｏｄｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｏｒｍｏｎｅｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｂｕｄｓ ｗａｓ ｔｒｅａｔｉｎｇ
ｗｉｔｈ ０．１ ９／６ ＨｇＣ１２ ｆｏｒ ７ ｒａｉｎ；ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ４ ｇ／Ｉ ＰＶＰ，ｕｐｐｅｒ ｄａｒｋ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ １０ ｄａｙｓ ｗｅｒｅ ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｔｏ ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ
ｂｒｏｗｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｂｕｄｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｗａｓ ＭＳ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ＢＡ ２．０ ｒａｇ／Ｌ ａｎｄ ＮＡＡ ０．１ ｍｇ／Ｌ。
ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ＭＳ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ＢＡ ０．５ ｍｇ／Ｌ ａｎｄ ＮＡＡ Ｏ．１ ｍｇ／Ｌ；ｔｈｅ ｓｕｉｔｅｄ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ ｗａｓ ２８～
３０ ｄａｙｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒ￣ｌｓ：ａｐｐｌｅ；ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇ；ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ；ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ；ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｏｒｍｏｎｅｓ
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2024年5月27日发(作者：红乐英)
北方园艺２０１０（６）：５～７ ・试验研究・
嘎拉苹果单芽系组培苗的获得
高 兵 。，孙 俊 。，章 镇
（１．南京农业大学园艺学院，江苏南京２１００９５；２．山西林业职业技术学院园艺系，山西太原０３０００９；３．安徽农业大学园艺学院，安徽合肥２３００３６）
摘 要：以皇家嘎拉苹果芽为外植体，研究不同消毒方法、消毒时间、不同防褐化措施和不同
激素配比对组培苗获得的影响。结果表明：嘎拉芽消毒选择０．１％ＨｇＣＩ：消毒７ ｍｉｎ为宜；接种
前使用４ ｇ／Ｉ ＰＶＰ、接种后暗培养１０ ｄ左右可以较有效地减轻褐变；诱导、增殖培养基是ＭＳ＋
ＢＡ ２．０ ｍｇ／Ｉ ＋ＮＡＡ ０．１ ｍｇ，／Ｉ ，继代、扩繁培养基是ＭＳ＋ＢＡ ０．５ ｒａｇ／Ｉ 十ＮＡＡ ０．１ ｍｇ／Ｉ ；继代
周期以２８４３０ ｄ为宜。
关键词：苹果；组培苗；消毒方法；防褐措施；激素配比
中图分类号：Ｓ ６６１．１０３．４文献标识码：Ａ文章编号：１００１—０００９（２０１０）０６—０００５—０３
１．２．２防褐化处理接种前，采用培养基中附加Ｖｃ、
植物组织培养技术不仅是植物体细胞遗传学的基
础，而且对理论研究和植物基因工程以及农作物品种改
良和种苗快速繁育都有重大意义。应用组织培养实现
苹果的快速繁殖、无病毒苹果苗的产生以及基因变异从
Ａｃ、ＰＶＰ和对芽进行４℃低温处理、Ｎａｅ Ｓ２（ 浸泡的方
法。每种处理接种６瓶，每瓶２个芽，重复２次。接种
后，采取间隔不同天数更换培养基，以确定最佳的防褐
措施。
而获得新品种苹果等具有重要的研究价值。前人在苹
果组织培养中已经做了大量研究，但对于苹果单芽系组
培苗研究尚未报道。试验以嘎拉苹果为材料，研究影响
嘎拉苹果单芽系组培苗繁殖体系建立的因素，主要针对
组织培养中常遇到的外植体污染、褐化和玻璃化苗问题
进行研究，为实现嘎拉苹果的快速繁育和基因工程的应
用提供有力的保障。
１．２．３组培苗的快繁与继代 以ＭＳ为基本培养基，使
用激素ＢＡ和ＮＡＡ进行了２Ｏ种浓度组合，每个浓度组
合接种６瓶，每瓶选取生长势相对一致的２个顶芽，
（３０±２）ｄ继代１次，统计每组处理芽增殖数量和生长
情况，重复２次。另外，分别以（１６±２）、（２６±２）、（３４±
２）ｄ为继代周期进行继代培养。
１材料与方法
１．１试验材料
“皇家嘎拉”苹果（Ｍａｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃａ Ｂｏｒｋｈ Ｃ Ｖ．Ｒｏｙａｌ
Ｇａｌａ），２００３年春天从徐州果园采集未萌芽的１ ａ生枝
２结果与分析
２．１ 不同消毒时间对外植体污染率与成活率的影响
由表ｌ可知，处理２比处理１的７Ｏ 酒精消毒时间
长５ Ｓ，污染率少３０．３４％，同时成活率也少３９．６７ Ａ；处 ０
理３、处理４和处理５相比，随着０．１％升汞＋吐温时间
条，保湿于４￣Ｃ冰箱。基本培养基为ＭＳ＋ＢＡ ２．０ ｒｎｇ／Ｌ十
ＮＡＡ ０．１ ｒａｇ／Ｉ 。
的加长，成活率降低。说明植物的芽对酒精比较敏感，
使用酒精消毒的时间较长时，虽然污染率比较低，但对
从冰箱中取出枝条，于恒温培养箱
１．２试验方法
１．２．１外植体消毒
（２５。Ｃ）中水培催芽，直至芽萌发并露出２～３片叶。用手
外植体易造成伤害。处理６和处理７消毒方法中，０．１
升汞＋吐温消毒７ Ｓ的污染率是消毒 Ｓ的１．８７５倍，但
是成活率却是消毒５ Ｓ的７８．９２ ；处理８和处理９消毒
术刀将萌发的芽从枝条上取下，流水冲洗２～３ ｈ后，在
无菌超净台上利用不同方法对外植体消毒不同的时间，
每种处理接种６瓶，每瓶２个芽，重复２次。
方法中，０．１ 升汞＋吐温消毒７ ｓ的污染率是消毒５ Ｓ
的７９．１Ｏ ，成活率是消毒５ Ｓ的１．０２倍。说明尽管
ＨｇＣ１ 杀毒效果很好，但是对外植体却有很强的杀伤作
用，抑制外植体的萌芽生长，尤其是随着处理时间的加
第一作者简介：高兵（１９７９一），女，山西太原人，硕士，现从事园艺教
学工作。
长，毒害的作用也加强。经９种处理后的统计数据值可
以看出，０．１ ＨｇＣ１。消毒７ ｍｉｎ的试验结果好，外植体
的成活率高，为７９．２ ，污染率较低，为２２．５ 。因此，
嘎拉芽消毒选择０．１ ＨｇＣｌ 消毒７ ｍｉｎ为宜，不需经
酒精消毒。
通讯作者：章镇（１９４７一），男，硕士，教授，博士生导师，现从事果树
学的科研与教学工作。Ｅ ｍａｉｌ：ｇｂｓｕｓａｎ．ｓｔｕｄｅｎｔ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。
基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０２００１９０）。
收稿日期：２００９—１２—０４
５
・
试验研究・
表１ 不同消毒处理对外檀体的影响
Ｔａｂｌｅ １ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｌａｎｔｓ
无菌水
７０ 酒
污染率 成活率
处理 浸泡 精
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ（）ｆ Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ａｓｅｐｔｉｃ ｗａｔｅｒ
７０
ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｖｅ ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ
ｄｉｐｐｉｎｇ／ｍｉｎ
Ａｌｃｏｈｏｌ／ｓ
ｅｘｐｌａｎｌｓ， ｅｘｐｌａｎｔｓ，
艨温 ” ¨ ～
驼 驼毖 卯 珀
３ ５ ２ ５ ３ ５ ４ ６
２．２防褐化措施对褐化率的影响
２．２．１接种前不同防褐化措施对褐化率的影响 由表
２看出，在接种３０ ｄ统计褐变程度及褐变率，发现接种
∞ 叭蚰蛆
３ １ ２ ３ ３ ３ ２
前采取不同的防褐措施后，都能比较明显地抑制外植体
的褐变，减轻组织和培养基的褐变程度。抗褐变剂种类
不同，其效果不同，其中ＰＶＰ对于防止外植体褐变效果
最好，外植体褐变度最小，褐变率最小的仅为３６．７％０，为
对照７６．７ 的一半左右。Ｖｃ较差些，最小的为５３．６ Ａ，０
活性炭的效果最差，为６８．Ｏ 。抗褐变剂浓度不同，效
果也不同，随着ＰＶＰ浓度的增大，外植体的褐变度降低，
浓度为４ ｇ／Ｌ的效果最好，浓度为２ ｇ／Ｌ效果较好；
１ ｇ／Ｌ的Ｖｃ比２ Ｌ效果更好，褐变率分别为５３．６
和５８．２ ；对于Ａｃ，与２ ｇ／Ｌ和３ ｇ／Ｌ相比，１ ｇ／Ｌ防褐
变的效果最差，褐变程度最大，褐变率最高，随着浓度的
增加，褐变程度降低，褐变率变化较小。消毒前４℃处理
芽的防褐效果较好，随处理时间的增加，褐变程度及褐
变率都有所降低，但变化不大。２ Ｎａ２ 浸泡２０ ｍｉｎ
比３０ ｍｉｎ的褐变率低，可能是因为浸泡时间增加，Ｓ离
子对组织的伤害加重。结果表明，接种前使用４ Ｉ ＰＶＰ
防褐化效果最好。
表２接种前不同防褐化处理对褐变的影响
Ｔａｂｌｅ ２ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ ｂｅｆｏｒｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
６
北方园艺２０１０（６）：５～７
２．２．２接种后不同防褐化措施对褐化率的影响 由表
３可看出，接种后３ ｄ更换培养基明显比９ ｄ褐变程度、
褐变率低，１５ ｄ才更换培养基的，褐变程度严重，而且褐
变率达到１００ ；暗培养天数的多少会明显的影响芽的
褐变程度，暗培养３ ｄ不仅褐变情况较严重，而且褐变率
均在６０ 以上，暗培养６ ｄ的褐变率也较高，只有短时间
内（３ ｄ）更换培养基才会降低褐变率，当暗培养达到１０ ｄ
时，褐变程度和褐变率都有明显下降，最低为１２．５ 。综
上所述，芽接种后暗培养１０ ｄ左右可以有效地减轻褐
变，结合每３ ｄ更换培养基将能达到更理想的防褐效果。
表３接种后不同防褐化处理对褐变的影响
Ｔａｂｌｅ ３ Ｅｆｆｅｃｔ ＯＤ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｂｙ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
注：接种前、后的防褐措施分别进＿ｆ丁
Ｎｏｔｅ：Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｂｅｆｏｒｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｒ ａｆｔｅｒ ｉｔ ｉｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ
２．３组培苗的快速繁殖
２．３．１激素浓度配比对快繁的影响 由表４看出，就
ＢＡ单因素来看，随着ＢＡ浓度的升高，芽的诱导率及每
个外植体上的平均芽数基本也呈上升的趋势。ＢＡ为
４．０ ｍｇ／Ｉ 的组合，芽的增殖数平均约为接种时２个的近
６倍，但同时植株的玻璃化现象也明显增加。一般认为，
培养基中ＢＡ含量的高低，直接影响玻璃化苗的发生与
否，只有细胞分裂素与生长素的合理搭配，才能达到理
想的生长分化效果。试验中ＢＡ为０．５～１．０ ｍｇ／Ｌ时，
玻璃化率为０，ＢＡ为４．０ ｍｇ／Ｌ时，玻璃化率高达
３３．３ ，当ＢＡ浓度小于２．０ ｍｇ／Ｌ时，ＢＡ：ＮＡＡ在
（５：１）～（２０：１），没有玻璃化现象。另有研究表明，ＢＡ
浓度高时，植株生长高度会受到抑制，该试验也可看出
这～点，ＢＡ为４．０ ｒａｇ／Ｉ 时，植株的高度均明显下降。
ＢＡ浓度在０．５～ｌ＿０ ｍｇ／Ｌ的组合，芽的分化数量较少，
生长缓慢且叶片小而发黄，不利于快繁。综合以上各
点，从芽的分化量、生长势及玻璃化程度考虑，组合
ＢＡ／ＮＡＡ为２．ｏ／０．１最适合嘎拉苹果芽的快繁，芽平均
增殖５倍，植株高２．０３ ｃｍ，无玻璃化现象。
２．３．２继代周期对芽增殖和生长的影响 据预备试验
的观察，从芽的增殖数量、生长势和生长速度考虑，嘎拉
苹果芽继代培养与扩大繁殖采用ＭＳ＋ＢＡ ０．５ ｍｇ／Ｌ十
ＮＡＡ ０．１ ｒａｇ／Ｉ 最为适宜，这时芽的增殖数基本稳定在
５倍左右，生长迅速，生长势强，芽苗深绿色。芽经过诱
北方园艺２ｏｉｏ（６）：５～７
表４嘎拉快繁激素浓度对植株生长的影响
Ｔａｂｌｅ ４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ
ｏｆ ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｌｎ‘Ｇａｌａ’
・试验研究・
可促进试管苗的生长和酶物质的增加ｌ３ ］。试验中的嘎
拉，接种前培养基添加４ ｇ／Ｌ ＰＶＰ，接种后暗培养１０ ｄ，
３ ｄ更换１次培养基都能有效地减轻褐变程度，提高芽
玻璃化率
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ
ｇｌａｓｓ ｓ｝ｌ０。ｔ／
激素浓度组合
Ｃｏｍｂｉｎｅｓ ｏｆ
培养 ｄ芽数
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｓｈｏｏｔｓ
植株平均高度
Ａｖｅｒａｇｅ ｌｅｎｇｌｈ
的成活率。
培养基的筛选是组织培养的基本内容之一，一般来
说，在茎尖培养和芽诱导时主要用ＭＳ培养基 。植物
生长调节物质种类及浓度搭配的合理选择，是组织培养
的初代芽诱导成功与否的关键。对诱导出的芽进行增
殖及继代培养，是植物组织培养成功与否的关键。该试
验发现，分化率及其生长量不仅取决于ＢＡ、ＮＡＡ的浓
度和外植体的质量，而且取决于激素的配比。在外植体
质量相近的情况下，ＢＡ和ＮＡＡ达到设定的最低或最高
浓度时，分化率较小；ＢＡ ２．０ ｍｇ／Ｉ 、ＮＡＡ ０．１ ｍｇ／Ｌ时，
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３ １ ７
分化率较高，且没有玻璃化苗现象。孙爱君等 研究表
明，ＢＡ与ＮＡＡ比值为２ｏ时，分化效果最好。继代培养
则选择ＭＳ＋ＢＡ ０．５ ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ ０．１ ｍｇ／Ｌ的培养基，
导或增殖后在同一培养基上培养时间过长会使材料干
枯，长势减弱，最终逐渐死亡。因此适时地对芽进行转
接培养是十分必要的。嘎拉增殖培养中１４ ｄ左右才出
继代周期以增殖培养后２８～３０ ｄ为佳，太早或太迟均
不利。
参考文献
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Ｓｃｉ，１９８６：４５６—４６６．
现新的小芽，２８ ｄ后每个新增殖的小芽有１～２片小叶
产生，此时芽生长的较健壮，随着芽增殖数量及每个小
芽上叶片数目的增多，芽的生长逐渐变慢，并有部分芽
开始变枯，如果此时仍不进行转接，将严重影响芽的生
［２］韩素英，齐立旺，张淑改，等．核桃组培中防止组织氧化褐变措施的
研究［Ｊ］．山西农业大学学报，１９９５，１５（４）：３３９ ３４１．
长。因此，２８～３０ ｄ进行转接继代是比较合适的，此时
转接，不但可使芽的增殖系数达到５倍左右，而且转接
后，芽生长较健壮。如果转接的太早，如１８￣２２ ｄ，不但会
［３］裴东，郑均宝，凌艳荣，等．红富士苹果试管培养中器官分化及其部
分生理指标的研究口］．园艺学报，１９９７，２４（３）：２２９ ２３４．
［４］裴东，袁丽钗，奚声珂．核桃品种试管嫩茎生根的研究口］．林业科学，
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［５］师校欣，杜国强，高仪，等．黑暗培养对苹果组培快繁及叶片再生的
影响＿Ｊ］．河北农业大学学报，２００４，２７（４）：１８ ２１．
［６］ 袁巧平．生物技术与林木试管微型选育口］．世界林业研究，１９９０（３）：
５１－５５．
３结论与讨论
试验采用了在室内水培的方法，既避免了大范围的
污染，又使消毒用的时间相对比较短。褐变是植物组织
培养过程中普遍存在的现象ｕ ，在外植体接种前，用抗
氧化剂浸泡一定时问，能收到一定效果［ ，在培养基中
加入吸附剂（Ａｃ和ＰＶＰ）可以抑制褐变。适当的暗培养
［７］孙爱君，章镇，姚泉洪，等．苹果与八棱海棠的试管苗外植体植株再
牛ｒＩ］．Ｅ海农、 学报，２０００，１６（２）：２３—３０．
Ｇａｌａ Ａｐｐｌｅ Ａｃｃｅｓｓ ｔｏ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｕｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ
ＧＡ０ Ｂｉｎｇ ，ＳＵＮ ＪＨｎ 。，ＺＨＡＮＧ Ｚｈｅｎ
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ，Ｊｉａｎｇｓｕ ２１００９５；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｓｈａｎｘｉ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｖｏｃａｔｉｏｎ—
ａｌ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｙｕａｎ，Ｓｈａｎｘｉ ０３０００９；３．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ，Ａｎｈｕｉ ２３００３６）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｂｕｄｓ ｓｐｒｏｕｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｕｔｔｉｎｇ ｓｈｏｏｔｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｗａｔｅｒ ｉｎ ａ ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ
ｏｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｎｔ ｏｆ Ｒｏｙａｌ Ｇａｌａ ａｐｐｌｅ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｔｉｍｅｓ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｍｅｔｈ—
ｏｄｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｏｒｍｏｎｅｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｂｕｄｓ ｗａｓ ｔｒｅａｔｉｎｇ
ｗｉｔｈ ０．１ ９／６ ＨｇＣ１２ ｆｏｒ ７ ｒａｉｎ；ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ４ ｇ／Ｉ ＰＶＰ，ｕｐｐｅｒ ｄａｒｋ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ １０ ｄａｙｓ ｗｅｒｅ ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｔｏ ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ
ｂｒｏｗｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｂｕｄｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｗａｓ ＭＳ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ＢＡ ２．０ ｒａｇ／Ｌ ａｎｄ ＮＡＡ ０．１ ｍｇ／Ｌ。
ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ＭＳ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ＢＡ ０．５ ｍｇ／Ｌ ａｎｄ ＮＡＡ Ｏ．１ ｍｇ／Ｌ；ｔｈｅ ｓｕｉｔｅｄ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ ｗａｓ ２８～
３０ ｄａｙｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒ￣ｌｓ：ａｐｐｌｅ；ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇ；ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ；ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ；ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｏｒｍｏｎｅｓ
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