2024年6月2日发(作者：公冶学)
齐鲁药事・Ｑｉｌｕ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｆｆａｉｒｓ ２０１２ Ｖｏ１．３１，Ｎｏ．６
・
３１１・
・
药物研究・
葡萄糖氧化酶生物传感器的构建和性能研究
韩文彪 ，蔡谨 ，石瑞 ，黄磊 ，徐志南
（１．南京林业大学森林资源与环境学院，江苏南京２１００３７；２．浙江大学化学工程与生物工程学系，浙江杭州Ｉ ３１００２７）
摘要：目的 以固定化葡萄糖氧化酶酶膜构建葡萄糖生物传感器，并对其性能进行评价。方法优化载体及戊二醛
交联固定化条件，制备性能良好的葡萄糖氧化酶酶膜，研究固定化酶的性能并用于构建葡萄糖传感器。结果 固定化葡
萄糖氧化酶的最适催化温度为４０℃、ｐＨ为７．０；葡萄糖生物传感器的响应时间小于２Ｏ ｓ，在０～１．５ ｇ・Ｌ 葡萄糖浓度
范围内有良好的线性，具有很强抗干扰和稳定性。结论
定。
该葡萄糖生物传感器性能良好，可用于生物样品中葡萄糖测
关键词：葡萄糖氧化酶；固定化；葡萄糖测定传感器
中图分类号：０６５８．９文献标识码：Ａ文章编号：１６７２—７７３８（２０１２）０６—０３１１—０５
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ
ｗｉｔｈ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ
ＨＡＮ Ｗｅｎ—ｂｉａｏ ，ＣＡＩ Ｊｉｎ。，ＳＨＩ Ｒｕｉ ，ＨＵＡＮＧ Ｌｅｉ ，ＸＵ Ｚｈｉ—ｎａｎ
（ ．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｉｆｎｇ ２１００３７，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００２７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｗｉｔｈ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｃｈａｒ—
ａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｏｆ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｒｅｐａｒｅｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｗｉｔｈ ｇｏｏｄ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｂｙ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ
ｃａｒｒｉｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｌｕｔａｒａｌ ｃｒｏｓｓ—ｌｉｎｋｉｎｇ．Ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ，ａｎｄ
ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｇｌｕｃｏｓｅ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｐＨ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｗｅｒｅ ４０
ｏＣ ａｎｄ ７．０，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｉｍｅ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｗａｓ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ２０ Ｓ，ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ
０～１．５ ｇ・Ｌ．ａｎｄ ｈａｄ ｈｉｇｈ ａｎｔｉ—ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｈａｄ
ｇｏｏｄ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ａｎｄ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ；Ｇ１ＵＯＯＳｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ
葡萄糖的定量测定在临床医学、生物化学、食品科学等
领域有极其重要的作用。可以用分光光度法、电流测定法、
在不同条件下通过交联法固定葡萄糖氧化酶，以期获得高比
活、高稳定性的葡萄糖氧化酶膜。并着重研究基于固定化葡
高效液相色谱法、极谱法及毛细管电泳法等测定葡萄糖含
量…，但是，这些方法有的需要复杂的前处理过程，分析速度
慢，仪器设备成本较高，而生物传感器法由于具有检测速度
萄糖氧化酶膜的葡萄糖生物传感器的性能及其应用。
１材料和方法
１．１实验材料葡萄糖氧化酶（ＧＯＤ，ＥＣ １．１．３．４，．ｒｙｐｅⅦ
快、选择性好、体积小、易操作等优点，受到众多研究者的重
视 。目前，葡萄糖生物传感器的研究日益增多，但是其检
测范围普遍较小，响应时间较长且抗干扰能力较弱 －６］，这
ｆｒｏｍＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ，１００ Ｕ・ｍｇ ）购于Ｓｉｇｍａ公司，牛血清
白蛋白（ＢＳＡ）和２５％戊二醛购于上海生工生物工程有限公
司，聚碳酸酯膜（０．２ ｍ）购于Ｗｈａｔｍａｎ公司，醋酸一硝酸混
合纤维素滤膜（０．２２ ｍ、０．４５ ｐ．ｍ、０．８ ｍ），购于上海兴亚
净化材料厂，尼龙６６微孔滤膜（０．２２ ｍ、０．４５ ｔｚｍ、０．８
Ｉｘｍ），购于杭州科诺过滤器材有限公司，鸡蛋壳膜自制。
１．２实验方法
些缺点使其在实际检测应用中受到限制较多。提高该传感
器的检测范围和灵敏度是亟待解决的问题。其中，作为葡萄
糖生物传感器重要组成元件——固定化葡萄糖氧化酶是影
响传感器性能的重要因素 。
本文筛选了几种不同类型的材料作为固定化酶的载体，
［基金项目］ 国家“８６３”项目（２０１１ＡＡＯ２Ａ１１４）
１．２．１ 酶的固定化 利用打孑Ｌ器将各种膜切割成直径为９
－
３１２・
ｍｍ的圆片（面积Ｓ＝０．６３５ ９ ｃｍ ），分别用０．１ ｍｏｌ・Ｌ～，ｐＨ
７．０的磷酸缓冲液浸泡清洗，取出用蒸馏水冲洗干净，晾干，
备用。
依次吸取１５ 葡萄糖氧化酶（ＧＯＤ）溶液，４ 牛血
清白蛋白（ＢＳＡ）溶液于１ ｍＬ离心管中混合均匀，然后加入１
戊二醛溶液迅速混匀，共２０ 。吸取混合液于预处理过
的膜片上，涂布均匀后置于４ ｏＣ，静置反应过夜。取出置于
０．０５ ｔｏｏｌ・Ｌ～，ｐＨ ７．０磷酸缓冲液中浸泡并振荡洗去未固
定的酶。
１．２．２酶活测定酶活性测定：取３５℃预保温的１．５ ｍＬ
溶液Ａ和１．５ ｍＬ溶液Ｂ，于１ ｅｍ比色皿中混合，加入一定量
溶液酶或剪碎的固定化酶膜，保温反应２ ｍｉｎ，测定其在５００
ｎｍ处的吸光值。其中，溶液Ａ：称取３．５ ｍｇ辣根过氧化物酶
和３．５ ｍｇ ４一氨基安替吡啉，溶于２０ ｍＬ ０．２ ｍｏｌ・Ｌ～，ｐＨ
７．０磷酸缓冲液中，再加入１ ｍＬ ３．０％苯酚。溶液Ｂ：６．５％
葡萄糖溶液。
葡萄糖氧化酶酶活力单位（ｕ）定义为：每分钟氧化１
Ｉｘｍｏｌ葡萄糖产生葡萄糖酸和Ｈ：Ｏ：所需的酶量。
１．２．３葡萄糖生物传感器的构建将固定化葡萄糖氧化酶
膜用“Ｏ”型圈紧贴固定于过氧化氢电极表面，连接信号处理
系统组成葡萄糖氧化酶传感器，结构示意图见图１。反应池
内待测样品和缓冲液经搅拌迅速混匀后，葡萄糖在固定化酶
的作用下反应生成Ｈ Ｏ ，通过过氧化氢电极检测Ｈ ０ 浓
度，由于底物浓度与Ｈ Ｏ 浓度成线性比例关系，便可以得到
葡萄糖浓度。
图１葡萄糖传感器结构示意图
Ａ．信号接收处理系统；Ｂ．过氧化氢电极；Ｃ．进样器；Ｄ．进样孔
Ｅ．反应池；Ｆ．“Ｏ”型圈；Ｇ．固定化酶膜；Ｈ．搅拌子；Ｉ．磁力搅拌器
２结果与讨论
２．１ 固定化条件的优化
２．１．１ 载体材料对酶固定化的影响载体种类直接影响固
定化酶的活力、底物扩散速度及酶的稳定性。本文分别以不
同材料（尼龙膜０．２２ ｊｘｍ、混合纤维素膜０．２２ ｍ、鸡蛋膜、聚
碳酸酯膜）作为载体进行了考察，结果见图２。尼龙作载体
材料时，固定化酶的活力较低；其中以混合纤维素膜为载体
材料时，酶的活力相对最高，且比较稳定，重复性好。
２．１．２ 载体孔径对酶固定化的影响 载体的孔径大小可能
会影响固定化酶的活力。本文分别以０．２２ Ｉ，Ｌｍ，０．４５ ｍ和
０．８ ｍ等不同孔径的 昆合纤维素膜作为固定化载体，考察
制得的固定化酶效果，结果见图３。以孔径为０．２２ ｍ的材
齐鲁药事・Ｑｉｌｕ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＡｆｆａｉｒｓ ２０１２ Ｖｏ１．３１，Ｎｏ．６
１２０．０
１００．０
差８ ｏ＿０
器６０．ｏ
４０．Ｏ
２０．０
Ｏ．０ 尼龙膜 鸡蛋壳膜 混纤膜 聚碳酸酯膜
载体材料
图２载体材料对酶固定化的影响
料为载体时固定化酶活最高，其次是孔径为０．４５ ｍ的，孔
径为０．８ ｍ的固定化效果最差，说明孔径大的膜表面可固
定化的蛋白量相对较少，但是以孔径为０．２２ ｍ的材料为载
体时，构建的生物传感器的分析响应较慢，孔径为０．４５ Ｉｘｍ
的材料为载体时，固定化酶量和分析响应较好，所以，后续实
验中选择０．４５ ｍ的混合纤维素材料为载体。
ｌ１Ｏ．Ｏ
一
９０．０
蜒
谧７０．０
靛
５０．０
３０．０ Ｏ
．
２２ ０．４５
孔径（ｔｍａ）
图３混合纤维素膜的孔径对酶固定化的影响
２．１．３戊二醛浓度对酶固定化的影响 以孔径为０．４５ ｍ
的混合纤维素材料为载体，在含２ ｍｇ・ｍＬ。。ＧＯＤ和２％
ＢＳＡ的条件下，以不同浓度的戊二醛为交联剂，来考察戊二
醛浓度对酶固定化的影响，结果见图４。戊二醛浓度较低时，
随着戊二醛浓度增大，酶的总活力也在增大，当戊二醛终浓
度为０．４％时，酶的活力达到最大，继续提高戊二醛浓度，酶
的活力明显下降。戊二醛浓度太低时，酶未被充分交联固
定，而浓度太高反而会影响酶的结构，从而影响酶活。在以
上实验条件下，戊二醛终浓度为０．４％时，固定化效果最佳。
ｌ１０
９０
《７０
避
靛５Ｏ
３Ｏ
１０
Ｏ．１％ Ｏ．２％ Ｏ－３％０．４％０．５％０．６％
戊二醛浓度（ｖ／ｖ）
图４戊二醛浓度对酶固定化的影响
齐鲁药事・Ｑｉｌｕ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＡ肪ｉｔｓ ２０１２ Ｖｏ１．３１，Ｎｏ．６
・
３１３・
２．１．４ ＢＳＡ浓度对酶固定化的影响以孔径为０．４５ ｍ的
ｌ１０．０
混合纤维素材料为载体，戊二醛浓度为０．４％，ＧＯＤ的浓度
为２ ｍｇ・ｍＬ 时，考察了ＢＳＡ浓度对酶固定化效果的影响，
结果见图５。ＢＳＡ的浓度对酶活的影响比较明显，浓度小于
３％时，随着ＢＳＡ浓度增加，固定化酶活也在增加。这可能是
９０．０
１｝ｇ
避
蓝７０．０
５０．０
加入ＢＳＡ可有效保护酶的活性中心并增加酶的固定量。但
当反应体系中ＢＳＡ浓度大于３％时，ＢＳＡ量的增加会使固定
化酶活迅速下降，这可能是过多的ＢＳＡ与戊二醛交联反而阻
２０ ２５ ３０ ３５ ４０ ４５ ５０ ５５
温度（℃）
碍了酶被充分交联固定。本实验条件下，ＢＳＡ浓度为３％时
效果最佳。
ｌ】０．Ｏ
一
９Ｏ．
藿７０．
莨
５０．
３０．Ｏ
ｌ％ ２％ ３％ ４％ ５％
ＢＳＡ浓度（ｗ／ｖ１
图５ ＢＳＡ浓度对酶固定化的影响
２．１．５ 加入酶量对酶固定化的影响 本文考察固定化酶反
应体系中加入酶量对固定化酶的影响，结果见图６。总体来
看，酶活力随着酶量的增加而提高，但当酶浓度大于３．７５ ｍｇ
・ｍＬ 时，再提高酶浓度，固定化酶的活力变化不明显，酶膜
固定酶量趋于饱和。在本实验条件下，酶的浓度为３．７５ ｍｇ
・ｍＬ 时效果较好。
ｌｌ０．Ｏ
９０．０
藿７０．ｏ
靛
５０．０
３０．０
０．７５ １．５Ｏ ２．２５ ３．０Ｏ ３．７５ ４．５０ ５．２５
酶浓度（ｍｇ－ｍＬ。１
图６酶量对酶固定化的影响
２．２ 固定化葡萄糖氧化酶的酶学性质
２．２．１ 温度对酶活力的影响 温度对酶的催化活性有很大
的影响，ｐＨ＝６．０条件下，考察温度对游离酶和固定化酶的
影响，结果见图７。游离酶和固定化酶的最适反应温度都在
４０℃左右，与游离酶相比，固定化酶受温度变化的影响较
小，说明经固定化后，酶的稳定性有所提高。
２．２．２ ｐＨ对酶活力的影响 酶的催化反应都存在于溶液
环境中，ｐＨ值会对酶产生一定的影响，因此，在４Ｏ℃条件
下，考察ｐＨ值对游离酶和固定化酶的影响，结果见图８。游
离酶的最适ｐＨ在５．５左右，固定化酶的最适ｐＨ为７．０左
右，且固定化酶受溶液ｐＨ变化影响较小，说明经固定化后，
图７温度对游离酶和固定化酶的影响
酶的稳定性有所提高。
ｌ１０．０
０・
嚣７０ ．
茛
５０，
３０．０
５ ５．５ ６ ６．５ ’７ ７．５ ８
ｐＨ
图８ ｐＨ对游离酶和固定化酶的影响
２．２．３葡萄糖氧化酶的米氏常数米氏常数Ｋ 和最大反
应速度Ｖ…能反映酶的催化动力学。本文在４０℃、ｐＨ＝７．０
条件下，测定了葡萄糖氧化酶的游离酶和固定化酶的Ｋ 值
和Ｖ ，结果见图９。固定化酶的米氏常数Ｋ ＝２０．３１７
ｍｍｏｌ・Ｌ～，最大反应速度Ｖ ：０．１１７ ６ ｍｍｏｌ・（Ｌ・
ａｒｉｎ）一，游离酶的米氏常数Ｋ ：８．５５８ ｍｍｏｌ・Ｌ～，最大反
应速度Ｖ…＝０．０７７ ２ ｍｍｏｌ・（Ｌ・ｍｉｎ）～。说明葡萄糖氧化
酶固定化后微环境发生了变化，酶与底物的亲和性稍有下
降。
２００
１５０
兰１ｏ０
５０
Ｏ
０ ０．２ ０．４ ０．６ ０．８ ｌ １．２ １．４ １．６
１／ＩＳ］
图９游离酶和固定化酶的米氏常数Ｋｍ
２．２．４ 固定化葡萄糖氧化酶酶膜的保存稳定性将固定化
葡萄糖氧化酶保存于０．１ Ｍ，ｐＨ＝７．０磷酸缓冲液中，分别置
于４℃冰箱和室温。考察不同温度下固定化酶活性的变化
情况，结果见图１０。４℃保存的固定化酶，前两周时间内，酶
膜活性变化很小，２０～４０ ｄ内酶活力下降比较明显，保存４０
ｄ以后，酶活下降比较缓慢，基本趋于稳定，固定化酶的半衰
期为６０ ｄ左右，具有很好的稳定性；室温环境下保存的酶膜，
前４ ｄ酶活下降明显，之后酶活缓慢下降，但是在保存到２０ ｄ
左右时，酶膜表面开始有霉菌生长，因此只能测定到２４ ｄ，此
时，酶膜的剩余酶活大约为初始酶活的６０％左右，说明４℃
・
３１４・
比室温更有利于固定化酶的保存，稳定性明显延长。
Ｏ
０
萤０
。
０
０
０ ６ ｌ２ ｌ８ ２４ ３０ ３６ ４２ ４８ ５４ ６Ｏ
时间（ｄ）
图１０葡萄糖氧化酶膜保存稳定性
２．２．５ 固定化葡萄糖氧化酶酶膜的热稳定性将游离酶和
固定化酶膜分别保存在ｐＨ＝７．０、０．１ Ｍ的磷酸缓冲液中，置
于６Ｏ℃水浴条件下，对比游离酶和固定化酶的热稳定性，结
果见图１１。游离酶在该条件下，１０ ｍｉｎ酶活下降５０％左右，
半小时几乎完全失活，而酶膜在该条件下，２ ｈ后还能保持初
始酶活的一半，８ ｈ后仅剩余不到初始酶活的１０％。与游离
酶相比，固定化酶的热稳定性有明显的提高。
０．８００
｛；、
０
凸
０．６００
０
烬
０．４００
避
０．２００
０．０００
Ｏ ｌ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８
时间（ｈ）
图１１ ６０℃时游离酶和固定化酶的热稳定性
２．３ 葡萄糖生物传感器的性能 本文以固定化葡萄糖氧化
酶酶膜与过氧化氢电极等组装成葡萄糖生物传感器，并对其
对葡萄糖的响应时间、检测范围，抗干扰能力以及对实验样
品的检测准确性和传感器的使用稳定性进行了考察。
２．３．１ 传感器的响应时间和检测限分别配制不同浓度的
葡萄糖溶液，用传感器分别测定１０ ｓ、１５ ｓ和２０ Ｓ时的响应
值，考察传感器的灵敏度和检测限，结果见图１２。该传感器
灵敏度较高，葡萄糖浓度小于３．０ ｇ・Ｌ 时，１５ Ｓ时响应值基
本达到稳定，２０ Ｓ达到稳定状态；浓度小于１．０ ｇ－Ｌ 时，１０ ｓ
时就能达到稳定状态。另外，当葡萄糖浓度在０—１．５ ｇ・Ｌ
时，２０ Ｓ时的响应值与实际值基本完全一致，说明，该传感器
响应时间较短，能准确测定０～１．５ ｇ・Ｌ 的葡萄糖浓度。
２．３．２ 传感器的抗干扰能力 在实际使用中，待测溶液中
不仅可能含葡萄糖，还可能含有其他物质。本文考察了葡萄
糖生物传感器对生物样品中常见成分的抗干扰能力。分别
检测１．０ ｇ・Ｌ 氯化钾、１．０ ｇ・Ｌ 氯化镁、１．０ ｇ・Ｌ 蔗
糖、１．０ ｇ・Ｌ 牛血清白蛋白、１．０ ｇ・Ｌ Ｌ一谷氨酸、１．０ ｇ
・
Ｌ 尿素、１．０ ｇ・Ｌ 维生素Ｃ的响应值，以１．０ ｇ・Ｌ 葡
萄糖为对照，结果见表１。除了对维生素Ｃ有极微弱响应外，
其他物质均无响应，且能准确测定葡萄糖的浓度，说明该生
物传感器系统有很高的选择性，抗干扰性很强。
齐鲁药事・Ｑｉｌｕ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａ【ｆｆａｉｒｓ ２０１２ Ｖｏ１．３１。Ｎｏ．６
葡萄糖浓度（ｇ・ ）
图１２传感器线性关系
表１ 葡萄糖生物传感器对干扰物质的响应
２．３．３传感器测定发酵液葡萄糖浓度 测定发酵液样品中
葡萄糖含量是葡萄糖生物传感器实际应用之一。本文使用
自制葡萄糖生物传感器测定发酵液中葡萄糖含量，并与ＳＢＡ
４０Ｃ生物传感分析仪进行比较，结果见表２。自制葡萄糖
生物传感器的测定结果与ＳＢＡ一４０Ｃ生物传感分析仪测定
结果基本一致。
表２ 发酵液中葡萄糖浓度测定结果
２．３．４葡萄糖生物传感器使用的稳定性使用稳定性是衡
量传感器的主要性能指标之一。本文在室温条件下，考察了
传感器的基础活性随时间的变化情况，结果见图１３。前两天
基础活性下降比较快，之后酶活逐渐变缓，基本趋于稳定，４０
ｄ时的传感器的基础活性保留初始酶活的３０％，说明，在室
温条件下，葡萄糖传感器有较好的使用稳定性。
３结论
综上所述，以孔径为０．４５ ｍ的混合纤维素材料为载
体，戊二醛、ＢＳＡ和酶的最佳浓度分别为０．４％、３％和３．７５
ｍｇ・ｍＬ 时，可制备高比酶活的固定化葡萄糖氧化酶。固
定化葡萄糖氧化酶的最适反应温度为４０℃，最适ｐＨ为７．０，
米氏常数Ｋ ＝２０．３１７ ｍｍｏｌ・Ｌ～，最大反应速度Ｖ…＝
０．１１７ ６ ｍｍｏｌ・（Ｌ・ｍｉｎ）～。固定化酶具有很好的热稳定
性。构建的葡萄糖生物传感器在葡萄糖浓度０—１．５ ｇ・Ｌ
之间，有良好的线性关系，且响应时间较短，能在２０ ｓ内迅速
达到平衡。传感器的选择性较好，几乎不受其他物质的影
齐鲁药事・Ｑｉｌｕ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａ ｉｒｓ ２０１２ Ｖｏ１．３１，Ｎｏ．６
７００
６００
５００
４００
３００
２００
・
３１５・
［４］
Ｓｔｒｕｔｈ Ｂ，Ｅｃｋｌｅ Ｍ，Ｄｅｃｈｅｒ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｈｉｎｄｅｒｅｄ ｉｏｎ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ
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１ＯＯ
Ｏ
０
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６ ｌ２ １８ ２４ ３０ ３６
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时间（ｄ）
图ｌ３葡萄糖传感器使用稳定性
［７］
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［２］ ｗｕ Ｂ，Ｚｈａｎｇ Ｇ，Ｓｈｕａｎｇ Ｓ，ｅｔ １．Ｂｉａｏｓｅｎｓｏｒｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａ—
ｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｗｉｔｈ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎ ａｎ
ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｏｎ ｐｏｌｙａｎｉｌｉｎｅ ｇｒａｆｔｅｄ ｐｏｌｙ—
ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｒｅ—
ｓｏｕｒ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１０，１０１（１８）：６８８１—６８８７．
ａｒ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｉｍｍｏｂｉ—
［１０］
Ｒａｕｆ Ｓ，Ｉｈｓａｎ Ａ，Ａｋｈｔ
ｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｎ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｃｅｔａｔｅ——ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙ・
ｅｇｇｓｈｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ［Ｊ］．Ｔａｌａｎｔａ，２００４，６４（２）：５４６—５５３．
［３］ 汤琳，曾光明，沈国励．基于抑制作用的新型葡萄糖氧
化酶传感器测定环境污染物汞离子的研究［Ｊ］．分析科
学学报，２００５，２１（２）：１２３—１２６． ｌａｔｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００６，１２１（３）：３５１—
３６０
・
国外药讯・
ＦＤＡ批准Ａｆｉｎｉｔｏｒ治疗ＴＳＣ相关，Ｉ生非癌肾肿瘤
２０１２年４月２６日，诺华公司宣布，ＦＤＡ批准
治疗组肿瘤应答率为４２％，皮肤损伤应答率为
２６％。
Ａｆｉｎｉｔｏｒ（依维莫司）治疗复合结节性硬化症（ＴＳＣ）相
关且不需立即手术治疗的成人非癌肾肿瘤患者。
Ａｆｉｎｉｔｏｒ是首个获批用于ＴＳＣ相关性非癌肾肿瘤的
治疗药物，它可通过抑制ｍＴＯＲ激酶的活性中断肿
瘤信号传导途径，抑制肿瘤细胞增殖。批准是基于
一
ＴＳＣ是一种罕见的致命性遗传病，由于ＴＳＣ１或
ＴＳＣ２基因的缺失，导致ｍＴＯＲ酶激活，引发脑、肾等
机体重要器官的非癌肿瘤生长和增殖。Ａｆｉｎｉｔｏｒ常
见不良反应为：口腔炎，月经中断，血胆脂醇过多，高
甘油三酯血症及贫血症。
项双盲、随机、多中心、安慰剂对照的ＩＩＩ期临床试
验，试验结果表明，与安慰剂组无应答相比，Ａｆｉｎｉｔｏｒ
2024年6月2日发(作者：公冶学)
齐鲁药事・Ｑｉｌｕ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｆｆａｉｒｓ ２０１２ Ｖｏ１．３１，Ｎｏ．６
・
３１１・
・
药物研究・
葡萄糖氧化酶生物传感器的构建和性能研究
韩文彪 ，蔡谨 ，石瑞 ，黄磊 ，徐志南
（１．南京林业大学森林资源与环境学院，江苏南京２１００３７；２．浙江大学化学工程与生物工程学系，浙江杭州Ｉ ３１００２７）
摘要：目的 以固定化葡萄糖氧化酶酶膜构建葡萄糖生物传感器，并对其性能进行评价。方法优化载体及戊二醛
交联固定化条件，制备性能良好的葡萄糖氧化酶酶膜，研究固定化酶的性能并用于构建葡萄糖传感器。结果 固定化葡
萄糖氧化酶的最适催化温度为４０℃、ｐＨ为７．０；葡萄糖生物传感器的响应时间小于２Ｏ ｓ，在０～１．５ ｇ・Ｌ 葡萄糖浓度
范围内有良好的线性，具有很强抗干扰和稳定性。结论
定。
该葡萄糖生物传感器性能良好，可用于生物样品中葡萄糖测
关键词：葡萄糖氧化酶；固定化；葡萄糖测定传感器
中图分类号：０６５８．９文献标识码：Ａ文章编号：１６７２—７７３８（２０１２）０６—０３１１—０５
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ
ｗｉｔｈ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ
ＨＡＮ Ｗｅｎ—ｂｉａｏ ，ＣＡＩ Ｊｉｎ。，ＳＨＩ Ｒｕｉ ，ＨＵＡＮＧ Ｌｅｉ ，ＸＵ Ｚｈｉ—ｎａｎ
（ ．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｉｆｎｇ ２１００３７，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００２７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｗｉｔｈ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｃｈａｒ—
ａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｏｆ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｒｅｐａｒｅｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｗｉｔｈ ｇｏｏｄ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｂｙ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ
ｃａｒｒｉｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｌｕｔａｒａｌ ｃｒｏｓｓ—ｌｉｎｋｉｎｇ．Ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ，ａｎｄ
ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｇｌｕｃｏｓｅ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｐＨ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｗｅｒｅ ４０
ｏＣ ａｎｄ ７．０，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｉｍｅ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｗａｓ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ２０ Ｓ，ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ
０～１．５ ｇ・Ｌ．ａｎｄ ｈａｄ ｈｉｇｈ ａｎｔｉ—ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｈａｄ
ｇｏｏｄ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ａｎｄ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ；Ｇ１ＵＯＯＳｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ
葡萄糖的定量测定在临床医学、生物化学、食品科学等
领域有极其重要的作用。可以用分光光度法、电流测定法、
在不同条件下通过交联法固定葡萄糖氧化酶，以期获得高比
活、高稳定性的葡萄糖氧化酶膜。并着重研究基于固定化葡
高效液相色谱法、极谱法及毛细管电泳法等测定葡萄糖含
量…，但是，这些方法有的需要复杂的前处理过程，分析速度
慢，仪器设备成本较高，而生物传感器法由于具有检测速度
萄糖氧化酶膜的葡萄糖生物传感器的性能及其应用。
１材料和方法
１．１实验材料葡萄糖氧化酶（ＧＯＤ，ＥＣ １．１．３．４，．ｒｙｐｅⅦ
快、选择性好、体积小、易操作等优点，受到众多研究者的重
视 。目前，葡萄糖生物传感器的研究日益增多，但是其检
测范围普遍较小，响应时间较长且抗干扰能力较弱 －６］，这
ｆｒｏｍＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ，１００ Ｕ・ｍｇ ）购于Ｓｉｇｍａ公司，牛血清
白蛋白（ＢＳＡ）和２５％戊二醛购于上海生工生物工程有限公
司，聚碳酸酯膜（０．２ ｍ）购于Ｗｈａｔｍａｎ公司，醋酸一硝酸混
合纤维素滤膜（０．２２ ｍ、０．４５ ｐ．ｍ、０．８ ｍ），购于上海兴亚
净化材料厂，尼龙６６微孔滤膜（０．２２ ｍ、０．４５ ｔｚｍ、０．８
Ｉｘｍ），购于杭州科诺过滤器材有限公司，鸡蛋壳膜自制。
１．２实验方法
些缺点使其在实际检测应用中受到限制较多。提高该传感
器的检测范围和灵敏度是亟待解决的问题。其中，作为葡萄
糖生物传感器重要组成元件——固定化葡萄糖氧化酶是影
响传感器性能的重要因素 。
本文筛选了几种不同类型的材料作为固定化酶的载体，
［基金项目］ 国家“８６３”项目（２０１１ＡＡＯ２Ａ１１４）
１．２．１ 酶的固定化 利用打孑Ｌ器将各种膜切割成直径为９
－
３１２・
ｍｍ的圆片（面积Ｓ＝０．６３５ ９ ｃｍ ），分别用０．１ ｍｏｌ・Ｌ～，ｐＨ
７．０的磷酸缓冲液浸泡清洗，取出用蒸馏水冲洗干净，晾干，
备用。
依次吸取１５ 葡萄糖氧化酶（ＧＯＤ）溶液，４ 牛血
清白蛋白（ＢＳＡ）溶液于１ ｍＬ离心管中混合均匀，然后加入１
戊二醛溶液迅速混匀，共２０ 。吸取混合液于预处理过
的膜片上，涂布均匀后置于４ ｏＣ，静置反应过夜。取出置于
０．０５ ｔｏｏｌ・Ｌ～，ｐＨ ７．０磷酸缓冲液中浸泡并振荡洗去未固
定的酶。
１．２．２酶活测定酶活性测定：取３５℃预保温的１．５ ｍＬ
溶液Ａ和１．５ ｍＬ溶液Ｂ，于１ ｅｍ比色皿中混合，加入一定量
溶液酶或剪碎的固定化酶膜，保温反应２ ｍｉｎ，测定其在５００
ｎｍ处的吸光值。其中，溶液Ａ：称取３．５ ｍｇ辣根过氧化物酶
和３．５ ｍｇ ４一氨基安替吡啉，溶于２０ ｍＬ ０．２ ｍｏｌ・Ｌ～，ｐＨ
７．０磷酸缓冲液中，再加入１ ｍＬ ３．０％苯酚。溶液Ｂ：６．５％
葡萄糖溶液。
葡萄糖氧化酶酶活力单位（ｕ）定义为：每分钟氧化１
Ｉｘｍｏｌ葡萄糖产生葡萄糖酸和Ｈ：Ｏ：所需的酶量。
１．２．３葡萄糖生物传感器的构建将固定化葡萄糖氧化酶
膜用“Ｏ”型圈紧贴固定于过氧化氢电极表面，连接信号处理
系统组成葡萄糖氧化酶传感器，结构示意图见图１。反应池
内待测样品和缓冲液经搅拌迅速混匀后，葡萄糖在固定化酶
的作用下反应生成Ｈ Ｏ ，通过过氧化氢电极检测Ｈ ０ 浓
度，由于底物浓度与Ｈ Ｏ 浓度成线性比例关系，便可以得到
葡萄糖浓度。
图１葡萄糖传感器结构示意图
Ａ．信号接收处理系统；Ｂ．过氧化氢电极；Ｃ．进样器；Ｄ．进样孔
Ｅ．反应池；Ｆ．“Ｏ”型圈；Ｇ．固定化酶膜；Ｈ．搅拌子；Ｉ．磁力搅拌器
２结果与讨论
２．１ 固定化条件的优化
２．１．１ 载体材料对酶固定化的影响载体种类直接影响固
定化酶的活力、底物扩散速度及酶的稳定性。本文分别以不
同材料（尼龙膜０．２２ ｊｘｍ、混合纤维素膜０．２２ ｍ、鸡蛋膜、聚
碳酸酯膜）作为载体进行了考察，结果见图２。尼龙作载体
材料时，固定化酶的活力较低；其中以混合纤维素膜为载体
材料时，酶的活力相对最高，且比较稳定，重复性好。
２．１．２ 载体孔径对酶固定化的影响 载体的孔径大小可能
会影响固定化酶的活力。本文分别以０．２２ Ｉ，Ｌｍ，０．４５ ｍ和
０．８ ｍ等不同孔径的 昆合纤维素膜作为固定化载体，考察
制得的固定化酶效果，结果见图３。以孔径为０．２２ ｍ的材
齐鲁药事・Ｑｉｌｕ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＡｆｆａｉｒｓ ２０１２ Ｖｏ１．３１，Ｎｏ．６
１２０．０
１００．０
差８ ｏ＿０
器６０．ｏ
４０．Ｏ
２０．０
Ｏ．０ 尼龙膜 鸡蛋壳膜 混纤膜 聚碳酸酯膜
载体材料
图２载体材料对酶固定化的影响
料为载体时固定化酶活最高，其次是孔径为０．４５ ｍ的，孔
径为０．８ ｍ的固定化效果最差，说明孔径大的膜表面可固
定化的蛋白量相对较少，但是以孔径为０．２２ ｍ的材料为载
体时，构建的生物传感器的分析响应较慢，孔径为０．４５ Ｉｘｍ
的材料为载体时，固定化酶量和分析响应较好，所以，后续实
验中选择０．４５ ｍ的混合纤维素材料为载体。
ｌ１Ｏ．Ｏ
一
９０．０
蜒
谧７０．０
靛
５０．０
３０．０ Ｏ
．
２２ ０．４５
孔径（ｔｍａ）
图３混合纤维素膜的孔径对酶固定化的影响
２．１．３戊二醛浓度对酶固定化的影响 以孔径为０．４５ ｍ
的混合纤维素材料为载体，在含２ ｍｇ・ｍＬ。。ＧＯＤ和２％
ＢＳＡ的条件下，以不同浓度的戊二醛为交联剂，来考察戊二
醛浓度对酶固定化的影响，结果见图４。戊二醛浓度较低时，
随着戊二醛浓度增大，酶的总活力也在增大，当戊二醛终浓
度为０．４％时，酶的活力达到最大，继续提高戊二醛浓度，酶
的活力明显下降。戊二醛浓度太低时，酶未被充分交联固
定，而浓度太高反而会影响酶的结构，从而影响酶活。在以
上实验条件下，戊二醛终浓度为０．４％时，固定化效果最佳。
ｌ１０
９０
《７０
避
靛５Ｏ
３Ｏ
１０
Ｏ．１％ Ｏ．２％ Ｏ－３％０．４％０．５％０．６％
戊二醛浓度（ｖ／ｖ）
图４戊二醛浓度对酶固定化的影响
齐鲁药事・Ｑｉｌｕ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＡ肪ｉｔｓ ２０１２ Ｖｏ１．３１，Ｎｏ．６
・
３１３・
２．１．４ ＢＳＡ浓度对酶固定化的影响以孔径为０．４５ ｍ的
ｌ１０．０
混合纤维素材料为载体，戊二醛浓度为０．４％，ＧＯＤ的浓度
为２ ｍｇ・ｍＬ 时，考察了ＢＳＡ浓度对酶固定化效果的影响，
结果见图５。ＢＳＡ的浓度对酶活的影响比较明显，浓度小于
３％时，随着ＢＳＡ浓度增加，固定化酶活也在增加。这可能是
９０．０
１｝ｇ
避
蓝７０．０
５０．０
加入ＢＳＡ可有效保护酶的活性中心并增加酶的固定量。但
当反应体系中ＢＳＡ浓度大于３％时，ＢＳＡ量的增加会使固定
化酶活迅速下降，这可能是过多的ＢＳＡ与戊二醛交联反而阻
２０ ２５ ３０ ３５ ４０ ４５ ５０ ５５
温度（℃）
碍了酶被充分交联固定。本实验条件下，ＢＳＡ浓度为３％时
效果最佳。
ｌ】０．Ｏ
一
９Ｏ．
藿７０．
莨
５０．
３０．Ｏ
ｌ％ ２％ ３％ ４％ ５％
ＢＳＡ浓度（ｗ／ｖ１
图５ ＢＳＡ浓度对酶固定化的影响
２．１．５ 加入酶量对酶固定化的影响 本文考察固定化酶反
应体系中加入酶量对固定化酶的影响，结果见图６。总体来
看，酶活力随着酶量的增加而提高，但当酶浓度大于３．７５ ｍｇ
・ｍＬ 时，再提高酶浓度，固定化酶的活力变化不明显，酶膜
固定酶量趋于饱和。在本实验条件下，酶的浓度为３．７５ ｍｇ
・ｍＬ 时效果较好。
ｌｌ０．Ｏ
９０．０
藿７０．ｏ
靛
５０．０
３０．０
０．７５ １．５Ｏ ２．２５ ３．０Ｏ ３．７５ ４．５０ ５．２５
酶浓度（ｍｇ－ｍＬ。１
图６酶量对酶固定化的影响
２．２ 固定化葡萄糖氧化酶的酶学性质
２．２．１ 温度对酶活力的影响 温度对酶的催化活性有很大
的影响，ｐＨ＝６．０条件下，考察温度对游离酶和固定化酶的
影响，结果见图７。游离酶和固定化酶的最适反应温度都在
４０℃左右，与游离酶相比，固定化酶受温度变化的影响较
小，说明经固定化后，酶的稳定性有所提高。
２．２．２ ｐＨ对酶活力的影响 酶的催化反应都存在于溶液
环境中，ｐＨ值会对酶产生一定的影响，因此，在４Ｏ℃条件
下，考察ｐＨ值对游离酶和固定化酶的影响，结果见图８。游
离酶的最适ｐＨ在５．５左右，固定化酶的最适ｐＨ为７．０左
右，且固定化酶受溶液ｐＨ变化影响较小，说明经固定化后，
图７温度对游离酶和固定化酶的影响
酶的稳定性有所提高。
ｌ１０．０
０・
嚣７０ ．
茛
５０，
３０．０
５ ５．５ ６ ６．５ ’７ ７．５ ８
ｐＨ
图８ ｐＨ对游离酶和固定化酶的影响
２．２．３葡萄糖氧化酶的米氏常数米氏常数Ｋ 和最大反
应速度Ｖ…能反映酶的催化动力学。本文在４０℃、ｐＨ＝７．０
条件下，测定了葡萄糖氧化酶的游离酶和固定化酶的Ｋ 值
和Ｖ ，结果见图９。固定化酶的米氏常数Ｋ ＝２０．３１７
ｍｍｏｌ・Ｌ～，最大反应速度Ｖ ：０．１１７ ６ ｍｍｏｌ・（Ｌ・
ａｒｉｎ）一，游离酶的米氏常数Ｋ ：８．５５８ ｍｍｏｌ・Ｌ～，最大反
应速度Ｖ…＝０．０７７ ２ ｍｍｏｌ・（Ｌ・ｍｉｎ）～。说明葡萄糖氧化
酶固定化后微环境发生了变化，酶与底物的亲和性稍有下
降。
２００
１５０
兰１ｏ０
５０
Ｏ
０ ０．２ ０．４ ０．６ ０．８ ｌ １．２ １．４ １．６
１／ＩＳ］
图９游离酶和固定化酶的米氏常数Ｋｍ
２．２．４ 固定化葡萄糖氧化酶酶膜的保存稳定性将固定化
葡萄糖氧化酶保存于０．１ Ｍ，ｐＨ＝７．０磷酸缓冲液中，分别置
于４℃冰箱和室温。考察不同温度下固定化酶活性的变化
情况，结果见图１０。４℃保存的固定化酶，前两周时间内，酶
膜活性变化很小，２０～４０ ｄ内酶活力下降比较明显，保存４０
ｄ以后，酶活下降比较缓慢，基本趋于稳定，固定化酶的半衰
期为６０ ｄ左右，具有很好的稳定性；室温环境下保存的酶膜，
前４ ｄ酶活下降明显，之后酶活缓慢下降，但是在保存到２０ ｄ
左右时，酶膜表面开始有霉菌生长，因此只能测定到２４ ｄ，此
时，酶膜的剩余酶活大约为初始酶活的６０％左右，说明４℃
・
３１４・
比室温更有利于固定化酶的保存，稳定性明显延长。
Ｏ
０
萤０
。
０
０
０ ６ ｌ２ ｌ８ ２４ ３０ ３６ ４２ ４８ ５４ ６Ｏ
时间（ｄ）
图１０葡萄糖氧化酶膜保存稳定性
２．２．５ 固定化葡萄糖氧化酶酶膜的热稳定性将游离酶和
固定化酶膜分别保存在ｐＨ＝７．０、０．１ Ｍ的磷酸缓冲液中，置
于６Ｏ℃水浴条件下，对比游离酶和固定化酶的热稳定性，结
果见图１１。游离酶在该条件下，１０ ｍｉｎ酶活下降５０％左右，
半小时几乎完全失活，而酶膜在该条件下，２ ｈ后还能保持初
始酶活的一半，８ ｈ后仅剩余不到初始酶活的１０％。与游离
酶相比，固定化酶的热稳定性有明显的提高。
０．８００
｛；、
０
凸
０．６００
０
烬
０．４００
避
０．２００
０．０００
Ｏ ｌ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８
时间（ｈ）
图１１ ６０℃时游离酶和固定化酶的热稳定性
２．３ 葡萄糖生物传感器的性能 本文以固定化葡萄糖氧化
酶酶膜与过氧化氢电极等组装成葡萄糖生物传感器，并对其
对葡萄糖的响应时间、检测范围，抗干扰能力以及对实验样
品的检测准确性和传感器的使用稳定性进行了考察。
２．３．１ 传感器的响应时间和检测限分别配制不同浓度的
葡萄糖溶液，用传感器分别测定１０ ｓ、１５ ｓ和２０ Ｓ时的响应
值，考察传感器的灵敏度和检测限，结果见图１２。该传感器
灵敏度较高，葡萄糖浓度小于３．０ ｇ・Ｌ 时，１５ Ｓ时响应值基
本达到稳定，２０ Ｓ达到稳定状态；浓度小于１．０ ｇ－Ｌ 时，１０ ｓ
时就能达到稳定状态。另外，当葡萄糖浓度在０—１．５ ｇ・Ｌ
时，２０ Ｓ时的响应值与实际值基本完全一致，说明，该传感器
响应时间较短，能准确测定０～１．５ ｇ・Ｌ 的葡萄糖浓度。
２．３．２ 传感器的抗干扰能力 在实际使用中，待测溶液中
不仅可能含葡萄糖，还可能含有其他物质。本文考察了葡萄
糖生物传感器对生物样品中常见成分的抗干扰能力。分别
检测１．０ ｇ・Ｌ 氯化钾、１．０ ｇ・Ｌ 氯化镁、１．０ ｇ・Ｌ 蔗
糖、１．０ ｇ・Ｌ 牛血清白蛋白、１．０ ｇ・Ｌ Ｌ一谷氨酸、１．０ ｇ
・
Ｌ 尿素、１．０ ｇ・Ｌ 维生素Ｃ的响应值，以１．０ ｇ・Ｌ 葡
萄糖为对照，结果见表１。除了对维生素Ｃ有极微弱响应外，
其他物质均无响应，且能准确测定葡萄糖的浓度，说明该生
物传感器系统有很高的选择性，抗干扰性很强。
齐鲁药事・Ｑｉｌｕ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａ【ｆｆａｉｒｓ ２０１２ Ｖｏ１．３１。Ｎｏ．６
葡萄糖浓度（ｇ・ ）
图１２传感器线性关系
表１ 葡萄糖生物传感器对干扰物质的响应
２．３．３传感器测定发酵液葡萄糖浓度 测定发酵液样品中
葡萄糖含量是葡萄糖生物传感器实际应用之一。本文使用
自制葡萄糖生物传感器测定发酵液中葡萄糖含量，并与ＳＢＡ
４０Ｃ生物传感分析仪进行比较，结果见表２。自制葡萄糖
生物传感器的测定结果与ＳＢＡ一４０Ｃ生物传感分析仪测定
结果基本一致。
表２ 发酵液中葡萄糖浓度测定结果
２．３．４葡萄糖生物传感器使用的稳定性使用稳定性是衡
量传感器的主要性能指标之一。本文在室温条件下，考察了
传感器的基础活性随时间的变化情况，结果见图１３。前两天
基础活性下降比较快，之后酶活逐渐变缓，基本趋于稳定，４０
ｄ时的传感器的基础活性保留初始酶活的３０％，说明，在室
温条件下，葡萄糖传感器有较好的使用稳定性。
３结论
综上所述，以孔径为０．４５ ｍ的混合纤维素材料为载
体，戊二醛、ＢＳＡ和酶的最佳浓度分别为０．４％、３％和３．７５
ｍｇ・ｍＬ 时，可制备高比酶活的固定化葡萄糖氧化酶。固
定化葡萄糖氧化酶的最适反应温度为４０℃，最适ｐＨ为７．０，
米氏常数Ｋ ＝２０．３１７ ｍｍｏｌ・Ｌ～，最大反应速度Ｖ…＝
０．１１７ ６ ｍｍｏｌ・（Ｌ・ｍｉｎ）～。固定化酶具有很好的热稳定
性。构建的葡萄糖生物传感器在葡萄糖浓度０—１．５ ｇ・Ｌ
之间，有良好的线性关系，且响应时间较短，能在２０ ｓ内迅速
达到平衡。传感器的选择性较好，几乎不受其他物质的影
齐鲁药事・Ｑｉｌｕ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａ ｉｒｓ ２０１２ Ｖｏ１．３１，Ｎｏ．６
７００
６００
５００
４００
３００
２００
・
３１５・
［４］
Ｓｔｒｕｔｈ Ｂ，Ｅｃｋｌｅ Ｍ，Ｄｅｃｈｅｒ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｈｉｎｄｅｒｅｄ ｉｏｎ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ
ｉｎ ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ／ｍｏｎｔｍｏｒｉｌｌｏｎｉｔｅ ｍｕｈｉｌａｙｅｒｓ：Ｔｏｗａｒｄ
ｃ０ｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚｅｄ ｉｆｌｍｓ［Ｊ］．Ｅｕｒ Ｐｈｙｓ Ｊ Ｅ，２００１，６（５）：
３５１—３５８．
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１ＯＯ
Ｏ
０
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时间（ｄ）
图ｌ３葡萄糖传感器使用稳定性
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定性。能较好地测定发酵液中的葡萄糖浓度。
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３６０
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国外药讯・
ＦＤＡ批准Ａｆｉｎｉｔｏｒ治疗ＴＳＣ相关，Ｉ生非癌肾肿瘤
２０１２年４月２６日，诺华公司宣布，ＦＤＡ批准
治疗组肿瘤应答率为４２％，皮肤损伤应答率为
２６％。
Ａｆｉｎｉｔｏｒ（依维莫司）治疗复合结节性硬化症（ＴＳＣ）相
关且不需立即手术治疗的成人非癌肾肿瘤患者。
Ａｆｉｎｉｔｏｒ是首个获批用于ＴＳＣ相关性非癌肾肿瘤的
治疗药物，它可通过抑制ｍＴＯＲ激酶的活性中断肿
瘤信号传导途径，抑制肿瘤细胞增殖。批准是基于
一
ＴＳＣ是一种罕见的致命性遗传病，由于ＴＳＣ１或
ＴＳＣ２基因的缺失，导致ｍＴＯＲ酶激活，引发脑、肾等
机体重要器官的非癌肿瘤生长和增殖。Ａｆｉｎｉｔｏｒ常
见不良反应为：口腔炎，月经中断，血胆脂醇过多，高
甘油三酯血症及贫血症。
项双盲、随机、多中心、安慰剂对照的ＩＩＩ期临床试
验，试验结果表明，与安慰剂组无应答相比，Ａｆｉｎｉｔｏｒ