2024年8月2日发(作者：满露)
不同方法提取活性污泥胞外聚合物的特性分析
吴桂荣;储昭瑞;荣宏伟;谭炳琰
【摘 要】本研究采用超声法、甲醛+ NaOH法、Na2CO3-加热法、NaOH+加热
法和CER法等5种方法提取普通活性污泥的EPS.通过傅里叶红外光谱、三维荧光
光谱对不同方法提取的EPS进行特性分析,并利用平行因子分析法的结果对EPS的
EEM光谱信号进行分析.NaOH+加热法和Na2CO3+加热法提取EPS所得的蛋白
质和多糖总含量是几种方法中较高的.甲醛+ NaOH法、Na2CO3+加热法、
NaOH+加热法3种EPS提取方法所得的红外光谱特征峰相对于超声法、CER法
所获得的EPS特征峰更明显.从三维荧光光谱图可得:不同方法提取EPS的信号峰位
置也不尽相同.从平行因子法分析可得:EPS中的色氨酸可通过CER法提取获得,EPS
中的络氨酸可通过超声法和CER法提取获得,EPS中的类蛋白质类物质可通过超声
法、甲醛+NaOH法、Na2CO3+加热法、NaOH+加热法提取获得.
【期刊名称】《广州大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2017(016)006
【总页数】7页(P77-83)
【关键词】胞外聚合物;三维荧光光谱;平行因子分析法;活性污泥
【作 者】吴桂荣;储昭瑞;荣宏伟;谭炳琰
【作者单位】广州大学土木工程学院,广东广州510006;广州大学土木工程学院,广
东广州510006;广州大学土木工程学院,广东广州510006;广州大学土木工程学院,
广东广州510006
【正文语种】中 文
【中图分类】X703
随着环境污染的加剧，污水处理日益受到民众的关注.污水厂处理污水过程产生的
污泥量也急剧上升，成为一个急需解决的难题.研究表明，在活性污泥中，大多数
微生物以菌胶团的形式存在；在细胞的周围，具有大量的黏性物质存在，即胞外聚
合物(EPS).EPS由细胞分泌的高分子聚合物组成，主要有蛋白质、多糖、核酸、腐
殖质等成分[1].活性污泥胞外聚合物(EPS)上的各种官能团，如羰基、羟基、羧基等，
在很大程度上影响着污泥絮体结构、脱水性能、沉降性能、重金属的吸收性能，具
有重要的环境意义[2].因此，采取有效的提取方法，分析活性污泥EPS的成分，研
究EPS对污水处理性能影响和微生物的形态具有重大的意义.
污泥的提取方法很大程度上影响了EPS的提取量和成分.目前EPS的提取技术可分
为物理法、化学法等，常见的方法有超声法、甲醛-NaOH法、Na2CO3+加热法、
NaOH+加热法、阳离子交换树脂法(CER)等.但EPS采用不同的提取方法，所得出
的EPS成分也不尽相同，一种高效的提取方法难以建立，因此,实验所得出结论的
解释和比较具有一定的局限性.本研究旨在通过各种分析手段对不同的提取方法进
行比较，得出不同提取方法所得的胞外聚合物成分之间的差别，对未来的胞外聚合
的研究提供重要参考.
1 材料与方法
1.1 污泥的来源
污泥取自广州市沥滘污水厂二沉池的活性污泥，具有絮凝性，沉降性能良好， 易
于沉淀.污泥浓度为4 842 mg·L-1，SVI为89 mL·g-1,含水率为97%.
1.2 胞外聚合物(EPS)的提取方法
胞外聚合物(EPS)在提取之前先做如下预处理：即取50 mL的污泥液在4 ℃，4
000×g的离心力下离心污泥20 min，并倒掉上清液，收集污泥.补充超纯水至50
mL，重复上述操作2次，最后一次收集的沉淀物进行下一步操作.接着用不同的方
法提取胞外聚合物(EPS)：超声法是在0 ℃的温度下以45 W的功率用脉冲超声波
去混匀混合物10 min后，离心过滤提取所得的胞外聚合物(EPS)[3].甲醛+NaOH
法是加0.3 mL 37%的甲醛溶液，并储存于4 ℃的冰箱中1 h，然后加20 mL 1 M
的NaOH溶液到污泥悬浮液中，并储存于4 ℃的冰箱中，3 h后离心过滤提取所
得的胞外聚合物(EPS).Na2CO3+加热法是在80 ℃的水浴加热下加入0.25 g无水
Na2CO3或者0.67 g Na2CO3·10H2O以保证Na2CO3溶液浓度为0.5%，并在
400 rpm的转速下搅拌混合液35 min后离心过滤提取所得的胞外聚合物
(EPS).NaOH+加热法是加20 mL 1 M的NaOH溶液到污泥悬浮液中并储存于4 ℃
的冰箱中3 h，然后在400 rpm的转速和80 ℃的温度下搅拌混合液35 min，离
心过滤提取所得的胞外聚合物(EPS).CER法是加入阳离子交换树脂(本试验采用的
树脂为732纳型阳离子交换树脂)约60 g·g-1 VSS于烧杯中(实验开始前测量
MLVSS)，在4 ℃下200 rpm的转速下搅拌12 h后离心提取过滤所得的胞外聚合
物(EPS)[4].
1.3 多糖、蛋白质和UV254的测定方法
胞外聚合物中多糖的测定采用硫酸-苯酚法[5]，蛋白质的测定采用改良型BCA法
[6].UV254是在波长254 nm下测得的各个EPS提取液的吸光度值.
1.4 傅里叶红外光谱分析
取适量EPS提取液进行冷冻干燥，将冷冻干燥后的粉末与KBr进行1∶100混合
均匀后，用Tensor27傅里叶红外光谱仪进行扫描，分辨率为0.4 cm-1，测定波
长范围为400～4 000 cm-1[7].
1.5 三维荧光光谱扫描
荧光光谱采用的是(F-4500，Hitachi)荧光分光光度计，光源为氙灯，光电倍(PMT)
为700 V.首先，为了消除内滤效应对测量结果的影响，须将待测的EPS用超纯水
稀释至0.1 cm-1以下.然后，上机进行三维荧光扫描，发射波长的扫描范围从250
nm到550 nm,步长为2 nm，激发波长的扫描范围从220 nm到450 nm，步长
为5 nm，发射光和激发光的狭缝宽度均为5 nm，扫描速度为2 400 nm·min-1.
扫描结果的分析和光谱图的绘制使用MATLAB2014a完成.
1.6 PARAFAC分析
平行因子(PARAFAC)分析法最先由BRO提出，它是以三线性分解理论为基础，将
三维荧光光谱的高阶部分分解为3个线性结构部分，剩余部分分解为噪声，因而
识别出各个荧光组分的特征及浓度[8].平行因子分析法参考STEDMON等[9]提出
的分析方法和DOMFluor分析工具.首先，剔除信噪比比较高的部分，并将瑞利散
射的数值归零以消除瑞利散射对平行因子分析的影响.然后，将荧光组分从2到7
下的平行因子矩阵分别计算，并考虑残差分析、各种荧光组分的光谱特性.最后，
根据CHEN等[10]提出的各类物质三维荧光信号对应关系，确定各个组分所对应
的荧光物质.
2 结果与讨论
2.1 EPS成分分析和UV254的测定
胞外聚合物(EPS)的主要成分有蛋白质、多糖等.图1比较了5种不同提取方法下蛋
白质和多糖的含量变化，一般情况下以蛋白质和多糖的总含量来衡量EPS的提取
量.从图1可以看出，甲醛+NaOH法提取EPS的蛋白质和多糖的总含量为117.24
mg·g-1VSS，为所有提取方法中最低的，而NaOH+加热法提取EPS的蛋白质和
多糖的总含量为326.41 mg·g-1VSS，是甲醛+NaOH法提取EPS的蛋白质和多
糖的总含量的2倍以上.NaOH+加热法和甲醛+NaOH法提取EPS过程中都加入
相等量的NaOH，但2者提取所得蛋白质的含量相差巨大，说明在提取过程中加
热有助于提高EPS的提取量.NaOH+加热法和Na2CO3+加热提取EPS的蛋白质
和多糖的总含量分别为326.41 mg·g-1VSS和254.68 mg·g-1VSS,NaOH+加热
法的EPS提取量高于Na2CO3+加热法是因为NaOH的投加量多于Na2CO3，会
导致溶液的pH更高，从而加强EPS酸性基团的分离和带负电荷EPS分子之间的
排斥，因而会增加EPS在水中的溶解性，易于提取更多的EPS[11].Na2CO3+加
热法、NaOH+加热法提取EPS蛋白质的含量分别为225.25 mg·g-1VSS、
293.47 mg·g-1VSS，而超声法、甲醛+NaOH法、CER法提取EPS蛋白质的含
量分别为151.72 mg·g-1VSS、90.00 mg·g-1VSS、118.24 mg·g-
2CO3+加热法、NaOH+加热法提取EPS蛋白质的含量比超声法、甲醛
+NaOH法、CER法提取EPS蛋白质的含量高出48.46%以上，而5种不同提取
方法提取的多糖量差别不大，说明Na2CO3+加热法、NaOH+加热法在提取EPS
的过程中比甲醛+NaOH法、超声法、CER法更易于获取更多的蛋白质.从上述可
以得出，NaOH+加热法提取EPS所得蛋白质和多糖的量是这几种方法中最多的.
EPS中的一些有机物，可以采用UV254的数值作为它们含量的替代参数.分析表明：
分子量越大的有机物在波长为254 nm处有较高的吸收峰，特别是分子量大于3
000以上的有机物是紫外吸收的主体，而小于500的有机物紫外吸收很弱[12].因
此，UV254越高，表明EPS中的分子量大于3 000以上的有机物含量越高.从图1
中的数据可以得出：Na2CO3+加热法、NaOH+加热法的UV254数值最高，达
到5，而CER法的UV254数值最低，只有1.334,甲醛+NaOH法的UV254数值
也不算太高.从所测的UV254数值来看，CER法、甲醛+NaOH法的所提取的有机
物含量不太高，而Na2CO3+加热法、NaOH+加热法所提取的有机物含量相对较
高，跟上述所测的蛋白质和多糖总含量所得出的结论基本一致.
图1 不同方法对EPS各个成分提取量和UV254数值的比较
Fig.1 Comparison of extraction of EPS and UV254 by five different methods
2.2 傅里叶红外光谱分析
将EPS溶液冷冻干燥，进行傅里叶红外光谱扫描，得到EPS中各种基团的扫描图.
从图2可以得出，这几种方法提取的EPS都含有-OH、-CH、=CH、C=O等活性
基团，而且C=O和-OH对应的强频段存在很强的吸收峰.这充分表明了几种提取
方法提取所得的官能团都能含有胞外聚合物所对应的相应物质.不同方法提取EPS
所含有的EPS基团的吸收峰强度有不同.甲醛+NaOH法、Na2CO3+加热法、
NaOH+加热法的红外光谱图的吸收峰强度相对于超声法、CER法强，说明这3种
EPS提取方法相对于其他2种方法所获得的EPS提取液在相对应位置的官能团的
浓度更高.
图2 不同方法提取EPS的红外光谱
Fig.2 Infrared spectrum of EPS extracted by five different methods
2.3 三维荧光光谱(EEM)
胞外聚合物(EPS)的活性成分复杂，包含有大量的芳香类结构和不饱和的脂肪酸链，
且这些结构都具有内源荧光特性.因此，可以采用三维荧光光谱(EEM)来分析识别和
表征胞外聚合物(EPS)中的这些荧光物质.5种方法提取胞外聚合物(EPS)的三维荧光
光谱见图3，可以看出,甲醛+NaOH法提取所得的胞外聚合物(EPS)在Ex为250～
300 nm和300～350 nm之间各有一个信号峰，比Na2CO3+加热法、NaOH+
加热法提取所得的胞外聚合物(EPS)多了一个在Ex为250～300 nm处的信号
峰.Na2CO3+加热法、NaOH+加热法提取所得的胞外聚合物(EPS)在Ex为250～
300 nm和300～350 nm之间只有一个信号峰，即Ex=300～350 nm处的信号
峰.但Na2CO3+加热法提取所得的胞外聚合物(EPS)在Ex=300～350 nm处信号
峰的荧光强度强于甲醛+NaOH法和NaOH+加热法，说明Na2CO3+加热法提取
所得的胞外聚合物(EPS)在Ex为300～350 nm处信号峰所代表的物质具有更高的
物质浓度.CER法提取所得的胞外聚合物(EPS)在Ex为250～300 nm处有一个信
号峰，其信号峰的荧光强度高于其他4种方法提取所得的胞外聚合物(EPS)在该处
信号峰的荧光强度，即CER法提取所得的胞外聚合物(EPS)在Ex为250～300 nm
处信号峰所代表的物质具有更高的物质浓度.超声法提取所得的胞外聚合物(EPS)在
Ex为250～350 nm的位置却没有信号峰.CER法和超声法提取所得的胞外聚合物
(EPS)在Ex<250 nm处的位置有一个信号峰，而其他3种方法提取所得的胞外聚
合物(EPS)在相同的位置却没有，CER法提取所得的胞外聚合物(EPS)在Ex<250
nm处信号峰的荧光强度强于超声法，即CER法提取所得的胞外聚合物(EPS)在
Ex<250 nm处信号峰所代表的物质具有更高的物质浓度.
图3 不同方法提取的EPS三维荧光光谱Fig.3 3D EEMs of EPS extracted by five
different methods
2.4 平行因子法(PARAFAC)分析
采用平行因子(PARAFAC)分析法对不同方法提取的胞外聚合物(EPS)样品光谱信号
进行解析，得出不同方法提取的胞外聚合物(EPS)的荧光物质的主要成分及各组分
的变化规律.由图4可知，当荧光组分数从2增加到4时，误差平方和曲线变化不
大，结合二分法检验，确定最佳荧光组分数为4.
图4 平行因子法解析EPS的EEM不同荧光组分数下的误差平方和曲线
Fig.4 The curve of squared errorsum under different components in EEM
analysis of EPS by PARAFAC method
根据所绘制的组分曲线图(图5B、图5E、图5H、图5K)查阅相关文献，确定每个
组分所代表的有机物类别，可将几个组分所含的有机物类别列入表1.
从图5C可以得出只有CER法提取的胞外聚合物(EPS)中的色氨酸的含量最高，其
他几种提取方法所得胞外聚合物(EPS)的相对应含量偏低.组分2和组分4都代表类
蛋白质类物质，从图5F和图5L综合可以得出，NaOH+加热法提取的胞外聚合物
(EPS)中的类蛋白质类物质含量最高，而CER法提取的胞外聚合物(EPS)却基本没
有这种物质.从图5I可以得出超声法和CER法提取的胞外聚合物(EPS)中的络氨酸
相对于甲醛+NaOH法、Na2CO3+加热法、NaOH+加热法的含量高，其中超声
法提取的胞外聚合物(EPS)中的酪氨酸最高.
从以上的分析综合得出：胞外聚合物(EPS)中的色氨酸可以通过CER法提取获得，
而超声法、甲醛+NaOH法、Na2CO3+加热法、NaOH+加热法提取的的胞外聚
合物(EPS)中色氨酸含量偏低.胞外聚合物(EPS)中的络氨酸可以通过超声法和CER
法提取获得，其中超声法提取的胞外聚合物(EPS)中络氨酸的含量高，而甲醛
+NaOH法、Na2CO3+加热法、NaOH+加热法提取的胞外聚合物(EPS)中络氨酸
的含量偏低.胞外聚合物(EPS)中的类蛋白质类物质可以通过超声法、甲醛+NaOH
法、Na2CO3+加热法、NaOH+加热法提取获得，其中NaOH+加热法提取的胞
外聚合物(EPS)中的类蛋白质类物质含量最高，而CER法提取的胞外聚合物(EPS)
中的类蛋白质类物质偏低.
图5 EPS的三维荧光光谱的平行因子分析结果Fig.5 Results of PARAFAC
analysis for EEM of EPS
表1 不同组分所含的有机物类别
Table 1 The organic component contained in different categories
组分Ex/Em所含的有机物类别参考文献来源组分1225,280/332色氨酸[13,14]组
分2235,265/388类蛋白质类物质[15]组分3265/302络氨酸[16]组分
4230,280/364类蛋白质类物质[13,17]
3 结 论
本研究采用超声法、甲醛+NaOH法、Na2CO3+加热法、NaOH+加热法、CER
法提取普通活性污泥的胞外聚合物(EPS)，可得如下结论：
(1)根据蛋白质和多糖的测定结果可以得出，NaOH+加热法和Na2CO3+加热法提
取胞外聚合物(EPS)所得的蛋白质和多糖总含量是几种方法中较高的.
(2)5种方法得到的红外光谱图上均出现-OH、-CH、=CH、C=O等强峰，甲醛
+NaOH法、Na2CO3+加热法、NaOH+加热法等3种EPS提取方法相对于超声
法、CER法所获得的EPS特征峰更明显.
(3)从三维荧光光谱图可以得出：CER法提取所得的胞外聚合物(EPS)在Ex<250
nm和Ex为250～300 nm处信号峰所代表的物质具有更高的物质浓度；
Na2CO3+加热法提取所得的胞外聚合物(EPS)在Ex为300～350 nm处信号峰所
代表的物质具有更高的物质浓度.从平行因子分析可以得出，胞外聚合物(EPS)中的
色氨酸可以通过CER法提取获得，胞外聚合物(EPS)中的络氨酸可以通过超声法和
CER法提取获得，胞外聚合物(EPS)中的类蛋白质类物质可以通过超声法、甲醛
+NaOH法、Na2CO3+加热法和NaOH+加热法等提取获得.
参考文献：
[1] 郑晓英，黄希，王兴楠，等．好氧颗粒污泥中胞外聚合物的提取方法及其优
化[J]．中国给水排水，2013,29(7):1-4.
ZHENG X Y, HUANG X, WANG X N, et al. Optimized extraction of
extracellular polymeric substances in aerobic granular sludge[J]．China
Water Wastew,2013,29(7):1-4.
[2] 杨飘，康得军，谢丹瑜，等.不同方法组合对活性污泥细胞胞外聚合物的提取[J].
净水技术，2016,35(6)：88-92.
YANG P, KANG D J, XIE D Y, et al. Extracellular polymeric substances from
activated sludge by differernt combination of methods[J].Water Purif Tech,
2016,35(6)：88-92.
[3] FELZ S,AL-ZUHAIRY S, AARSTAD O A, et tion of structural
extracellular polymeric substances from aerobic granular sludge[J]. J Visual
Exp Jove, 2016, 115: 3-8(e54534).
[4] FROLUND B, PALMGREN R, KEIDING K, et al. Extraction of extracellular
polymers from activated sludge using a cation exchange resin[J]. Water
Res, 1996,30(8): 1749-1758.
[5] TAN C H, KOH K S, XIE C, et al. The role of quorum sensing signalling in
EPS production and the assembly of a sludge community into aerobic
granules[J].Int Soc Microb Ecol J, 2014, 8(6): 1186-1197.
[6] SHENG G P, YU H Q, LI X Y. Extracellular polymeric substances (EPS) of
microbial aggregates in biological wastewater treatment systems: A
review[J].Biotech Adv, 2010, 28(6): 882-894.
[7] 张宇，梁彦秋，贾春云.不同方法提取PAHs高效降解菌EPS的特性[J]. 生物学
杂志，2014,33(4)：1027-1033.
ZHANG Y,LIANG Y Q, JIA C Y. Characteristics of EPS extracted from a high
efficient PAHs-degrading bacterium by different methods[J].Chin J Ecol,
2014,33(4)：1027-1033.
[8] ISHII S K L, BOYER T H. Behavior of reoccurring PARAFAC components
in fluorescent dissolved organic matter in natural and engineered systems:
a critical review[J]. Environ Sci Tech, 2012, 46(4): 2006-2017.
[9] STEDMON C A, BRO R. Characterizing dissolved organic matter
fluorescence with parallel factor analysis: A tutorial[J]. Limnol Oceanogr
Meth, 2008, 6: 572-579.
[10] CHEN W, WESTERHOFF P, LEENHEER J A, et al. Fluorescence
excitation-emission matrix regional integration to quantify spectra for
dissolved organic matter[J].Environ Sci Tech, 2003, 37(24): 5701-5710.
[11] WINGENDER J,NEU T R,FLEMMING H C. Microbial extracellular
polymeric substances: Characterization, structures and function[M]. Berlin:
Springer-Verlag,1999.
[12] 蒋绍阶, 刘宗源. UV254 作为水处理中有机物控制指标的意义[J]. 重庆建筑大
学学报, 2004, 24(2): 61-65.
JIANG S J, LIU Z Y. The meaning of UV254 as an organic matter monitoring
parameter in water supply & wastewater treatment[J]. J Chongqing Jianzhu
Univ,2004, 24(2): 61-65.
[13] MURPHY K R. Organic matter fluorescence in municipal water
recycling schemes: Toward a unifed PARAFAC model[J].Environ Sci Tech,
2011,45(7): 2909-2916.
[14] SHAO S L, LIANG H, QU F S, et al. Fluorescent natural organic matter
fractions responsible for ultrafiltration membrane fouling: Identifcation by
adsorption pretreatment coupled with parallel factor analysis of excitation-
emission matrices[J]. J Membr Sci, 2014,464:33-42.
[15] SANCHEZ N P, SKERIOTIS A T, MILLER C M. Assessment of dissolved
organic matter fluorescence PARAFAC components before and afer
coagulation-filtration in a full scale water treatment plant[J]. Water Res,
2013,47: 1679-1690.
[16] CHEN W, WESTERHOFF P, LEENHEER J A, et al. Fluorescence
excitation-emission matrix regional integration to quantify spectra for
dissolved organic matter[J].Environ Sci Tech, 2003, 37(24): 5701-5710.
[17] SHUTOVA Y, BAKER A, BRIDGEMAN J, et al. Spectroscopic
characterisation of dissolved organic matter changes in drinking water
treatment: From PARAFAC analysis to online monitoring wavelengths[J].
Water Res, 2014,54:159-169.
2024年8月2日发(作者：满露)
不同方法提取活性污泥胞外聚合物的特性分析
吴桂荣;储昭瑞;荣宏伟;谭炳琰
【摘 要】本研究采用超声法、甲醛+ NaOH法、Na2CO3-加热法、NaOH+加热
法和CER法等5种方法提取普通活性污泥的EPS.通过傅里叶红外光谱、三维荧光
光谱对不同方法提取的EPS进行特性分析,并利用平行因子分析法的结果对EPS的
EEM光谱信号进行分析.NaOH+加热法和Na2CO3+加热法提取EPS所得的蛋白
质和多糖总含量是几种方法中较高的.甲醛+ NaOH法、Na2CO3+加热法、
NaOH+加热法3种EPS提取方法所得的红外光谱特征峰相对于超声法、CER法
所获得的EPS特征峰更明显.从三维荧光光谱图可得:不同方法提取EPS的信号峰位
置也不尽相同.从平行因子法分析可得:EPS中的色氨酸可通过CER法提取获得,EPS
中的络氨酸可通过超声法和CER法提取获得,EPS中的类蛋白质类物质可通过超声
法、甲醛+NaOH法、Na2CO3+加热法、NaOH+加热法提取获得.
【期刊名称】《广州大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2017(016)006
【总页数】7页(P77-83)
【关键词】胞外聚合物;三维荧光光谱;平行因子分析法;活性污泥
【作 者】吴桂荣;储昭瑞;荣宏伟;谭炳琰
【作者单位】广州大学土木工程学院,广东广州510006;广州大学土木工程学院,广
东广州510006;广州大学土木工程学院,广东广州510006;广州大学土木工程学院,
广东广州510006
【正文语种】中 文
【中图分类】X703
随着环境污染的加剧，污水处理日益受到民众的关注.污水厂处理污水过程产生的
污泥量也急剧上升，成为一个急需解决的难题.研究表明，在活性污泥中，大多数
微生物以菌胶团的形式存在；在细胞的周围，具有大量的黏性物质存在，即胞外聚
合物(EPS).EPS由细胞分泌的高分子聚合物组成，主要有蛋白质、多糖、核酸、腐
殖质等成分[1].活性污泥胞外聚合物(EPS)上的各种官能团，如羰基、羟基、羧基等，
在很大程度上影响着污泥絮体结构、脱水性能、沉降性能、重金属的吸收性能，具
有重要的环境意义[2].因此，采取有效的提取方法，分析活性污泥EPS的成分，研
究EPS对污水处理性能影响和微生物的形态具有重大的意义.
污泥的提取方法很大程度上影响了EPS的提取量和成分.目前EPS的提取技术可分
为物理法、化学法等，常见的方法有超声法、甲醛-NaOH法、Na2CO3+加热法、
NaOH+加热法、阳离子交换树脂法(CER)等.但EPS采用不同的提取方法，所得出
的EPS成分也不尽相同，一种高效的提取方法难以建立，因此,实验所得出结论的
解释和比较具有一定的局限性.本研究旨在通过各种分析手段对不同的提取方法进
行比较，得出不同提取方法所得的胞外聚合物成分之间的差别，对未来的胞外聚合
的研究提供重要参考.
1 材料与方法
1.1 污泥的来源
污泥取自广州市沥滘污水厂二沉池的活性污泥，具有絮凝性，沉降性能良好， 易
于沉淀.污泥浓度为4 842 mg·L-1，SVI为89 mL·g-1,含水率为97%.
1.2 胞外聚合物(EPS)的提取方法
胞外聚合物(EPS)在提取之前先做如下预处理：即取50 mL的污泥液在4 ℃，4
000×g的离心力下离心污泥20 min，并倒掉上清液，收集污泥.补充超纯水至50
mL，重复上述操作2次，最后一次收集的沉淀物进行下一步操作.接着用不同的方
法提取胞外聚合物(EPS)：超声法是在0 ℃的温度下以45 W的功率用脉冲超声波
去混匀混合物10 min后，离心过滤提取所得的胞外聚合物(EPS)[3].甲醛+NaOH
法是加0.3 mL 37%的甲醛溶液，并储存于4 ℃的冰箱中1 h，然后加20 mL 1 M
的NaOH溶液到污泥悬浮液中，并储存于4 ℃的冰箱中，3 h后离心过滤提取所
得的胞外聚合物(EPS).Na2CO3+加热法是在80 ℃的水浴加热下加入0.25 g无水
Na2CO3或者0.67 g Na2CO3·10H2O以保证Na2CO3溶液浓度为0.5%，并在
400 rpm的转速下搅拌混合液35 min后离心过滤提取所得的胞外聚合物
(EPS).NaOH+加热法是加20 mL 1 M的NaOH溶液到污泥悬浮液中并储存于4 ℃
的冰箱中3 h，然后在400 rpm的转速和80 ℃的温度下搅拌混合液35 min，离
心过滤提取所得的胞外聚合物(EPS).CER法是加入阳离子交换树脂(本试验采用的
树脂为732纳型阳离子交换树脂)约60 g·g-1 VSS于烧杯中(实验开始前测量
MLVSS)，在4 ℃下200 rpm的转速下搅拌12 h后离心提取过滤所得的胞外聚合
物(EPS)[4].
1.3 多糖、蛋白质和UV254的测定方法
胞外聚合物中多糖的测定采用硫酸-苯酚法[5]，蛋白质的测定采用改良型BCA法
[6].UV254是在波长254 nm下测得的各个EPS提取液的吸光度值.
1.4 傅里叶红外光谱分析
取适量EPS提取液进行冷冻干燥，将冷冻干燥后的粉末与KBr进行1∶100混合
均匀后，用Tensor27傅里叶红外光谱仪进行扫描，分辨率为0.4 cm-1，测定波
长范围为400～4 000 cm-1[7].
1.5 三维荧光光谱扫描
荧光光谱采用的是(F-4500，Hitachi)荧光分光光度计，光源为氙灯，光电倍(PMT)
为700 V.首先，为了消除内滤效应对测量结果的影响，须将待测的EPS用超纯水
稀释至0.1 cm-1以下.然后，上机进行三维荧光扫描，发射波长的扫描范围从250
nm到550 nm,步长为2 nm，激发波长的扫描范围从220 nm到450 nm，步长
为5 nm，发射光和激发光的狭缝宽度均为5 nm，扫描速度为2 400 nm·min-1.
扫描结果的分析和光谱图的绘制使用MATLAB2014a完成.
1.6 PARAFAC分析
平行因子(PARAFAC)分析法最先由BRO提出，它是以三线性分解理论为基础，将
三维荧光光谱的高阶部分分解为3个线性结构部分，剩余部分分解为噪声，因而
识别出各个荧光组分的特征及浓度[8].平行因子分析法参考STEDMON等[9]提出
的分析方法和DOMFluor分析工具.首先，剔除信噪比比较高的部分，并将瑞利散
射的数值归零以消除瑞利散射对平行因子分析的影响.然后，将荧光组分从2到7
下的平行因子矩阵分别计算，并考虑残差分析、各种荧光组分的光谱特性.最后，
根据CHEN等[10]提出的各类物质三维荧光信号对应关系，确定各个组分所对应
的荧光物质.
2 结果与讨论
2.1 EPS成分分析和UV254的测定
胞外聚合物(EPS)的主要成分有蛋白质、多糖等.图1比较了5种不同提取方法下蛋
白质和多糖的含量变化，一般情况下以蛋白质和多糖的总含量来衡量EPS的提取
量.从图1可以看出，甲醛+NaOH法提取EPS的蛋白质和多糖的总含量为117.24
mg·g-1VSS，为所有提取方法中最低的，而NaOH+加热法提取EPS的蛋白质和
多糖的总含量为326.41 mg·g-1VSS，是甲醛+NaOH法提取EPS的蛋白质和多
糖的总含量的2倍以上.NaOH+加热法和甲醛+NaOH法提取EPS过程中都加入
相等量的NaOH，但2者提取所得蛋白质的含量相差巨大，说明在提取过程中加
热有助于提高EPS的提取量.NaOH+加热法和Na2CO3+加热提取EPS的蛋白质
和多糖的总含量分别为326.41 mg·g-1VSS和254.68 mg·g-1VSS,NaOH+加热
法的EPS提取量高于Na2CO3+加热法是因为NaOH的投加量多于Na2CO3，会
导致溶液的pH更高，从而加强EPS酸性基团的分离和带负电荷EPS分子之间的
排斥，因而会增加EPS在水中的溶解性，易于提取更多的EPS[11].Na2CO3+加
热法、NaOH+加热法提取EPS蛋白质的含量分别为225.25 mg·g-1VSS、
293.47 mg·g-1VSS，而超声法、甲醛+NaOH法、CER法提取EPS蛋白质的含
量分别为151.72 mg·g-1VSS、90.00 mg·g-1VSS、118.24 mg·g-
2CO3+加热法、NaOH+加热法提取EPS蛋白质的含量比超声法、甲醛
+NaOH法、CER法提取EPS蛋白质的含量高出48.46%以上，而5种不同提取
方法提取的多糖量差别不大，说明Na2CO3+加热法、NaOH+加热法在提取EPS
的过程中比甲醛+NaOH法、超声法、CER法更易于获取更多的蛋白质.从上述可
以得出，NaOH+加热法提取EPS所得蛋白质和多糖的量是这几种方法中最多的.
EPS中的一些有机物，可以采用UV254的数值作为它们含量的替代参数.分析表明：
分子量越大的有机物在波长为254 nm处有较高的吸收峰，特别是分子量大于3
000以上的有机物是紫外吸收的主体，而小于500的有机物紫外吸收很弱[12].因
此，UV254越高，表明EPS中的分子量大于3 000以上的有机物含量越高.从图1
中的数据可以得出：Na2CO3+加热法、NaOH+加热法的UV254数值最高，达
到5，而CER法的UV254数值最低，只有1.334,甲醛+NaOH法的UV254数值
也不算太高.从所测的UV254数值来看，CER法、甲醛+NaOH法的所提取的有机
物含量不太高，而Na2CO3+加热法、NaOH+加热法所提取的有机物含量相对较
高，跟上述所测的蛋白质和多糖总含量所得出的结论基本一致.
图1 不同方法对EPS各个成分提取量和UV254数值的比较
Fig.1 Comparison of extraction of EPS and UV254 by five different methods
2.2 傅里叶红外光谱分析
将EPS溶液冷冻干燥，进行傅里叶红外光谱扫描，得到EPS中各种基团的扫描图.
从图2可以得出，这几种方法提取的EPS都含有-OH、-CH、=CH、C=O等活性
基团，而且C=O和-OH对应的强频段存在很强的吸收峰.这充分表明了几种提取
方法提取所得的官能团都能含有胞外聚合物所对应的相应物质.不同方法提取EPS
所含有的EPS基团的吸收峰强度有不同.甲醛+NaOH法、Na2CO3+加热法、
NaOH+加热法的红外光谱图的吸收峰强度相对于超声法、CER法强，说明这3种
EPS提取方法相对于其他2种方法所获得的EPS提取液在相对应位置的官能团的
浓度更高.
图2 不同方法提取EPS的红外光谱
Fig.2 Infrared spectrum of EPS extracted by five different methods
2.3 三维荧光光谱(EEM)
胞外聚合物(EPS)的活性成分复杂，包含有大量的芳香类结构和不饱和的脂肪酸链，
且这些结构都具有内源荧光特性.因此，可以采用三维荧光光谱(EEM)来分析识别和
表征胞外聚合物(EPS)中的这些荧光物质.5种方法提取胞外聚合物(EPS)的三维荧光
光谱见图3，可以看出,甲醛+NaOH法提取所得的胞外聚合物(EPS)在Ex为250～
300 nm和300～350 nm之间各有一个信号峰，比Na2CO3+加热法、NaOH+
加热法提取所得的胞外聚合物(EPS)多了一个在Ex为250～300 nm处的信号
峰.Na2CO3+加热法、NaOH+加热法提取所得的胞外聚合物(EPS)在Ex为250～
300 nm和300～350 nm之间只有一个信号峰，即Ex=300～350 nm处的信号
峰.但Na2CO3+加热法提取所得的胞外聚合物(EPS)在Ex=300～350 nm处信号
峰的荧光强度强于甲醛+NaOH法和NaOH+加热法，说明Na2CO3+加热法提取
所得的胞外聚合物(EPS)在Ex为300～350 nm处信号峰所代表的物质具有更高的
物质浓度.CER法提取所得的胞外聚合物(EPS)在Ex为250～300 nm处有一个信
号峰，其信号峰的荧光强度高于其他4种方法提取所得的胞外聚合物(EPS)在该处
信号峰的荧光强度，即CER法提取所得的胞外聚合物(EPS)在Ex为250～300 nm
处信号峰所代表的物质具有更高的物质浓度.超声法提取所得的胞外聚合物(EPS)在
Ex为250～350 nm的位置却没有信号峰.CER法和超声法提取所得的胞外聚合物
(EPS)在Ex<250 nm处的位置有一个信号峰，而其他3种方法提取所得的胞外聚
合物(EPS)在相同的位置却没有，CER法提取所得的胞外聚合物(EPS)在Ex<250
nm处信号峰的荧光强度强于超声法，即CER法提取所得的胞外聚合物(EPS)在
Ex<250 nm处信号峰所代表的物质具有更高的物质浓度.
图3 不同方法提取的EPS三维荧光光谱Fig.3 3D EEMs of EPS extracted by five
different methods
2.4 平行因子法(PARAFAC)分析
采用平行因子(PARAFAC)分析法对不同方法提取的胞外聚合物(EPS)样品光谱信号
进行解析，得出不同方法提取的胞外聚合物(EPS)的荧光物质的主要成分及各组分
的变化规律.由图4可知，当荧光组分数从2增加到4时，误差平方和曲线变化不
大，结合二分法检验，确定最佳荧光组分数为4.
图4 平行因子法解析EPS的EEM不同荧光组分数下的误差平方和曲线
Fig.4 The curve of squared errorsum under different components in EEM
analysis of EPS by PARAFAC method
根据所绘制的组分曲线图(图5B、图5E、图5H、图5K)查阅相关文献，确定每个
组分所代表的有机物类别，可将几个组分所含的有机物类别列入表1.
从图5C可以得出只有CER法提取的胞外聚合物(EPS)中的色氨酸的含量最高，其
他几种提取方法所得胞外聚合物(EPS)的相对应含量偏低.组分2和组分4都代表类
蛋白质类物质，从图5F和图5L综合可以得出，NaOH+加热法提取的胞外聚合物
(EPS)中的类蛋白质类物质含量最高，而CER法提取的胞外聚合物(EPS)却基本没
有这种物质.从图5I可以得出超声法和CER法提取的胞外聚合物(EPS)中的络氨酸
相对于甲醛+NaOH法、Na2CO3+加热法、NaOH+加热法的含量高，其中超声
法提取的胞外聚合物(EPS)中的酪氨酸最高.
从以上的分析综合得出：胞外聚合物(EPS)中的色氨酸可以通过CER法提取获得，
而超声法、甲醛+NaOH法、Na2CO3+加热法、NaOH+加热法提取的的胞外聚
合物(EPS)中色氨酸含量偏低.胞外聚合物(EPS)中的络氨酸可以通过超声法和CER
法提取获得，其中超声法提取的胞外聚合物(EPS)中络氨酸的含量高，而甲醛
+NaOH法、Na2CO3+加热法、NaOH+加热法提取的胞外聚合物(EPS)中络氨酸
的含量偏低.胞外聚合物(EPS)中的类蛋白质类物质可以通过超声法、甲醛+NaOH
法、Na2CO3+加热法、NaOH+加热法提取获得，其中NaOH+加热法提取的胞
外聚合物(EPS)中的类蛋白质类物质含量最高，而CER法提取的胞外聚合物(EPS)
中的类蛋白质类物质偏低.
图5 EPS的三维荧光光谱的平行因子分析结果Fig.5 Results of PARAFAC
analysis for EEM of EPS
表1 不同组分所含的有机物类别
Table 1 The organic component contained in different categories
组分Ex/Em所含的有机物类别参考文献来源组分1225,280/332色氨酸[13,14]组
分2235,265/388类蛋白质类物质[15]组分3265/302络氨酸[16]组分
4230,280/364类蛋白质类物质[13,17]
3 结 论
本研究采用超声法、甲醛+NaOH法、Na2CO3+加热法、NaOH+加热法、CER
法提取普通活性污泥的胞外聚合物(EPS)，可得如下结论：
(1)根据蛋白质和多糖的测定结果可以得出，NaOH+加热法和Na2CO3+加热法提
取胞外聚合物(EPS)所得的蛋白质和多糖总含量是几种方法中较高的.
(2)5种方法得到的红外光谱图上均出现-OH、-CH、=CH、C=O等强峰，甲醛
+NaOH法、Na2CO3+加热法、NaOH+加热法等3种EPS提取方法相对于超声
法、CER法所获得的EPS特征峰更明显.
(3)从三维荧光光谱图可以得出：CER法提取所得的胞外聚合物(EPS)在Ex<250
nm和Ex为250～300 nm处信号峰所代表的物质具有更高的物质浓度；
Na2CO3+加热法提取所得的胞外聚合物(EPS)在Ex为300～350 nm处信号峰所
代表的物质具有更高的物质浓度.从平行因子分析可以得出，胞外聚合物(EPS)中的
色氨酸可以通过CER法提取获得，胞外聚合物(EPS)中的络氨酸可以通过超声法和
CER法提取获得，胞外聚合物(EPS)中的类蛋白质类物质可以通过超声法、甲醛
+NaOH法、Na2CO3+加热法和NaOH+加热法等提取获得.
参考文献：
[1] 郑晓英，黄希，王兴楠，等．好氧颗粒污泥中胞外聚合物的提取方法及其优
化[J]．中国给水排水，2013,29(7):1-4.
ZHENG X Y, HUANG X, WANG X N, et al. Optimized extraction of
extracellular polymeric substances in aerobic granular sludge[J]．China
Water Wastew,2013,29(7):1-4.
[2] 杨飘，康得军，谢丹瑜，等.不同方法组合对活性污泥细胞胞外聚合物的提取[J].
净水技术，2016,35(6)：88-92.
YANG P, KANG D J, XIE D Y, et al. Extracellular polymeric substances from
activated sludge by differernt combination of methods[J].Water Purif Tech,
2016,35(6)：88-92.
[3] FELZ S,AL-ZUHAIRY S, AARSTAD O A, et tion of structural
extracellular polymeric substances from aerobic granular sludge[J]. J Visual
Exp Jove, 2016, 115: 3-8(e54534).
[4] FROLUND B, PALMGREN R, KEIDING K, et al. Extraction of extracellular
polymers from activated sludge using a cation exchange resin[J]. Water
Res, 1996,30(8): 1749-1758.
[5] TAN C H, KOH K S, XIE C, et al. The role of quorum sensing signalling in
EPS production and the assembly of a sludge community into aerobic
granules[J].Int Soc Microb Ecol J, 2014, 8(6): 1186-1197.
[6] SHENG G P, YU H Q, LI X Y. Extracellular polymeric substances (EPS) of
microbial aggregates in biological wastewater treatment systems: A
review[J].Biotech Adv, 2010, 28(6): 882-894.
[7] 张宇，梁彦秋，贾春云.不同方法提取PAHs高效降解菌EPS的特性[J]. 生物学
杂志，2014,33(4)：1027-1033.
ZHANG Y,LIANG Y Q, JIA C Y. Characteristics of EPS extracted from a high
efficient PAHs-degrading bacterium by different methods[J].Chin J Ecol,
2014,33(4)：1027-1033.
[8] ISHII S K L, BOYER T H. Behavior of reoccurring PARAFAC components
in fluorescent dissolved organic matter in natural and engineered systems:
a critical review[J]. Environ Sci Tech, 2012, 46(4): 2006-2017.
[9] STEDMON C A, BRO R. Characterizing dissolved organic matter
fluorescence with parallel factor analysis: A tutorial[J]. Limnol Oceanogr
Meth, 2008, 6: 572-579.
[10] CHEN W, WESTERHOFF P, LEENHEER J A, et al. Fluorescence
excitation-emission matrix regional integration to quantify spectra for
dissolved organic matter[J].Environ Sci Tech, 2003, 37(24): 5701-5710.
[11] WINGENDER J,NEU T R,FLEMMING H C. Microbial extracellular
polymeric substances: Characterization, structures and function[M]. Berlin:
Springer-Verlag,1999.
[12] 蒋绍阶, 刘宗源. UV254 作为水处理中有机物控制指标的意义[J]. 重庆建筑大
学学报, 2004, 24(2): 61-65.
JIANG S J, LIU Z Y. The meaning of UV254 as an organic matter monitoring
parameter in water supply & wastewater treatment[J]. J Chongqing Jianzhu
Univ,2004, 24(2): 61-65.
[13] MURPHY K R. Organic matter fluorescence in municipal water
recycling schemes: Toward a unifed PARAFAC model[J].Environ Sci Tech,
2011,45(7): 2909-2916.
[14] SHAO S L, LIANG H, QU F S, et al. Fluorescent natural organic matter
fractions responsible for ultrafiltration membrane fouling: Identifcation by
adsorption pretreatment coupled with parallel factor analysis of excitation-
emission matrices[J]. J Membr Sci, 2014,464:33-42.
[15] SANCHEZ N P, SKERIOTIS A T, MILLER C M. Assessment of dissolved
organic matter fluorescence PARAFAC components before and afer
coagulation-filtration in a full scale water treatment plant[J]. Water Res,
2013,47: 1679-1690.
[16] CHEN W, WESTERHOFF P, LEENHEER J A, et al. Fluorescence
excitation-emission matrix regional integration to quantify spectra for
dissolved organic matter[J].Environ Sci Tech, 2003, 37(24): 5701-5710.
[17] SHUTOVA Y, BAKER A, BRIDGEMAN J, et al. Spectroscopic
characterisation of dissolved organic matter changes in drinking water
treatment: From PARAFAC analysis to online monitoring wavelengths[J].
Water Res, 2014,54:159-169.