2024年8月22日发(作者：百里慧巧)
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(21)申请号 CN2.X
(22)申请日 2011.09.20
(71)申请人 山东大学
地址 250100 山东省济南市历城区山大南路27号
(72)发明人 谷立川 朱春原 许素娟 陈颖 李冰清
(74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限公司
代理人 李健康
(51)
C07H19/213
C07H1/06
(10)申请公布号 CN 102443031 A
(43)申请公布日 2012.05.09
权利要求说明书 说明书 幅图
(54)发明名称
一种c-di-GMP的分离纯化方法
(57)摘要
本发明公开了一种c-di-GMP的分
离纯化方法，是将c-di-GMP粗产物溶液直
接上样于配有离子交换色谱柱的快速蛋白
液相色谱，用pH8.0缓冲液梯度洗脱，紫
外检测器254nm检测，收集出峰位置处洗
脱液，用质谱确证结构，然后将含目标化
合物洗脱液冻干，即制得固体c-di-GMP。
本发明方法制得的c-di-GMP经反相高效液
相色谱检测其纯度达95％以上，并实现了
一步法直接从c-di-GMP粗产物溶液中分离
纯化c-di-GMP，且本发明工艺简单，周期
短，不使用毒性有机溶剂，是一种高效、
环保、适合工业化生产的新方法。
法律状态
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.一种c-di-GMP的分离纯化方法，步骤是：
(1)取含c-di-GMP的粗产物溶液，以1～5mL/min的流速，直接上样于配有离子交
换色
(2)上样结束后，用洗脱液A和洗脱液B梯度洗脱，流速为1～5mL/min；其中所述
洗脱 液A为pH8.0的缓冲液，所述缓冲液为Tris-HCl、
谱柱的快速蛋白液相色谱，上样量为1～1000mL；
Na2HPO4-NaH2PO4或
K2HPO4-KH2PO4；
(3)用紫外检测器在254nm下检测，收集出峰位置处洗脱液，用质谱确证结构，然
后将
(4)以反相高效液相色谱检测，确定固体c-di-GMP纯度。
2.根据权利要求1所述c-di-GMP的分离纯化方法，其特征在于，所述快速蛋白液
相色
3.根据权利要求1所述c-di-GMP的分离纯化方法，其特征在于，所述离子交换色
谱柱 为Mini Q 4.6/50PE时，上样量为1～10mL，上样流速和洗脱
子交换色谱柱为
谱选GE AKTAFPLC。
含目标化合物洗脱液冻干，制得固体c-di-GMP；
所述洗脱液B为A液中加入1MNaCl；
流速均为1～2mL/min；所述离
Source Q HP 10/10时，上样量为10～100mL，上样流速和洗脱流速均为3～
4mL/min；所述离子交换色谱柱为Source Q HP 16/10时，上样量为50～
和洗脱流速均为4～5mL/min。 1000mL，上样流速
4.根据权利要求1所述c-di-GMP的分离纯化方法，其特征在于，所述梯度洗脱以
0→ 20倍柱体积进行，所述洗脱液A的浓度值以100％→0进行，
100％进行。 同时洗脱液B的浓度值以0→
5.根据权利要求1所述c-di-GMP的分离纯化方法，其特征在于，所述缓冲液为
Tris-HCl。
6.根据权利要求1所述c-di-GMP的分离纯化方法，其特征在于，所述高效液相色
谱为 Shimadzu LC-10AD/AT，反相色谱柱为
pH4.8的
Agela Venusil MP C184.6mm×250mm，洗脱液A为
10mM乙酸胺水溶液，洗脱液B为乙腈，流速为1mL/min；梯度洗脱运行时间30
分，洗脱液A的浓度值以100％→50％进行，同时洗脱液B的浓度
产物c-di-GMP保留时间在12.0～12.5min。值以0→50％进行；目标
说 明 书
技术领域
本发明涉及一种环鸟苷二磷酸(Cyclic diguanylate，c-di-GMP)的分离纯化方法，具
体地 说，是涉及用配有离子交换色谱柱的快速蛋白液相色谱
FPLC)分离纯化c-di-GMP的方法。(Fast protein liquid chromatography，
背景技术
环鸟苷二磷酸(Cyclic diguanylate，c-di-GMP)是一种具有细菌特异性的新型第二信
使， 它广泛存在于各种真细菌中，但不存在于真核生物中。c-di-GMP参
过程，包括生物膜的形成、运动性的调节、毒力
主要的生存方式，给人类的
据
与调控细菌的多种生理
因子的表达等。生物膜作为自然界中细菌
生产生活带来了严重危害。除了危害环境和工业生产以外，根
NIH的调查报告，80％以上的细菌性感染与生物膜有关，生物膜可以使细菌大幅度
提高
问题。
c-di-GMP在相关科研工作中有重要用途，但市场价格昂贵使其使用受限，2009年
12月 份价格调整为原价十分之一后，1μmol(0.7mg)仍需150欧元
它可以用多种方法来制备，例如组织提取
本的主要因素是其分
对抗生素的耐受性并抵抗机体的免疫防御，从而导致严重的临床耐药
(Biolog Life Science Institute)。
法、化学合成法或者酶促合成法，影响质量和成
离纯化。
现有技术通常采用反相高效液相色谱(High performance Liquid Chromatography，
HPLC) 来分离纯化c-di-GMP。以酶促合成c-di-GMP为例，步骤为：酶与底
c-di-GMP的混合液→煮沸、加入酸碱等方法使酶变性物GTP反应生成含
沉淀→离心→滤膜过滤除酶→冻干浓 缩→反相HPLC分离纯化→冻干
乙酸胺水溶液→得固体c-di-GMP。其中，HPLC所用流动相分别为乙腈和
(pH4.8)，用紫外检测器在254nm下检测产物。
由此可见，传统方法的分离纯化工艺复杂，耗时耗能。反相色谱柱对样品要求比较
严， 要先除去可能会在柱子上沉积的杂质(如酶)，不然会降低色谱柱使用
要有冻干仪又会耗费大量时间，致使生产效率低
溶剂，会对操作者和环境造
离纯化
寿命；冻干过程既需
下。并且由于在制备过程中使用大量有机
成危害，环保效果差。因此，开发新的简便、高效、绿色的分
技术是非常有必要的。
发明内容
针对现有技术中分离纯化c-di-GMP所存在的不足，本发明提供了一种新型的分离
纯
本发明所述c-di-GMP的分离纯化方法，步骤是：
(1)取含c-di-GMP的粗产物溶液，以1～5mL/min的流速，直接上样于配有离子交
换 色谱柱的快速蛋白液相色谱(Fast protein liquid chromatography，
1000mL；
化c-di-GMP的方法。
FPLC)，上样量为1～
(2)上样结束后，用洗脱液A和洗脱液B梯度洗脱，流速为1～5mL/min；其中所述
洗脱液A为pH8.0的缓冲液，所述缓冲液为Tris-HCl、
Na2HPO4-NaH2PO4或
K2HPO4-KH2PO4；所述
洗脱液B为A液中加入1M NaCl；
(3)用紫外检测器在254nm下检测，收集出峰位置处洗脱液，用质谱确证结构，然
后
(4)以反相高效液相色谱(High performance Liquid Chromatography，HPLC)检测，确
定
上述洗脱结束后的离子交换色谱柱，经洗脱液B彻底清除柱上吸附物，再经洗脱
液A
上述c-di-GMP分离纯化方法中，优选的实施条件是：
所述快速蛋白液相色谱优选GEAKTAFPLC；
所述离子交换色谱柱为Mini Q 4.6/50PE时，优选上样量为1～10mL，优选上样流
速 和洗脱流速均为1～2mL/min；所述离子交换色谱柱为
为10～100mL，优选上样流速和
Q HP 16/10时，
平衡后还可用于下一轮c-di-GMP的分离纯化。
固体c-di-GMP纯度。
将含目标化合物洗脱液冻干，制得固体c-di-GMP；
Source Q HP 10/10时，优选上样量
洗脱流速均为3～4mL/min；所述离子交换色谱柱为Source
优选上样量为50～1000mL，优选上样流速和洗脱流速均为4～5mL/min；
所述梯度洗脱优选以0→20倍柱体积进行，所述洗脱液A的浓度值以100％→0进
行，
所述缓冲液优选Tris-HCl；
同时洗脱液B的浓度值以0→100％进行；
所述高效液相色谱为Shimadzu LC-10AD/AT，反相色谱柱为Agela Venusil MP C18
4.6mm×250mm，洗脱液A为pH4.8的10mM乙酸胺水溶液，洗脱液B为乙
1mL/min；梯度洗脱运行时间30分，洗脱液A的浓度值以
B的浓度值以0→50％进行；目标产物c-
腈，流速为
100％→50％进行，同时洗脱液
di-GMP保留时间在12.0～12.5min。
利用本发明方法分离纯化后的c-di-GMP产物经反相HPLC检测，纯度达95％以上，
快速蛋白液相色谱(Fast protein liquid chromatography，FPLC)是一种新型、快速、
高效 色谱技术，目前主要用于分离纯化蛋白质，目前尚没有利用FPLC分
本发明采用离子交换FPLC装置作为主要设备来
产物，且待分离纯化的原料
理，实现了一
符合生物学、动物药理学等科研工作需要。
离纯化核苷酸的报导。
分离纯化c-di-GMP，不仅能够获得纯净的
在进入离子交换FPLC装置之前不需经过除酶、冻干浓缩等处
步法直接从酶反应液或组织提取液中分离纯化c-di-GMP。并且，离子交换
FPLC装置柱容量大、回收效率高且不易使生物分子失活，一次可以处理较
一步缩减了分离纯化时间，提高了分离纯化速度。 多的原料，进
与传统反相HPLC分离纯化技术相比，本发明在简化步骤、节省时间的同时，还
避免 了毒性有机溶剂乙腈的大量使用，显著提高了c-di-GMP分离纯化的
操作者和环境造成的危害。生产成本的降低、环
工业应用前景。
效率，消除了乙腈对
境污染的减轻无疑给该工作带来了广阔的
附图说明
图1.采用离子交换FPLC分离纯化c-di-GMP的图谱。
其中：FPLC为GE AKTA FPLC，离子交换色谱柱为Mini Q 4.6/50PE，两种洗脱液
分 别为25mM Tris-HCl(pH8.0)(A)和25mM Tris-HCl(pH8.0)+1M NaCl(B)。
c-di-GMP在洗脱液电导为35.97mS/cm时出峰。 目标产物
图2.本发明所得c-di-GMP经HPLC纯度鉴定图谱。
其中：HPLC为Shimadzu LC-10AD/AT，反相色谱柱为Agela Venusil MP C18
4.6mm×250mm，两种洗脱液分别为10mM乙酸胺水溶液(pH4.8)(A)和乙腈
c-di-GMP保留时间在12.3min。 (B)；目标产物
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细的描述，但本发明保护内容不仅限于此。
实施例1c-di-GMP的粗产物溶液的制备(酶促反应法)
将GTP(购自Sigma)和具有c-di-GMP合成活性的酶VCA0956以摩尔比1000∶2的
比例
加入到反应缓冲液(75mM Tris-HCl pH 8.0，250mM NaCl，25mM KCl，
室温下反应过夜，得含c-di-GMP的粗产10mM MgCl2)中，
物溶液。
其中：上述VCA0956的表达纯化及c-di-GMP的粗产物溶液制备的详细方法及步
骤请 参阅文献：Rita Tamayo，Anna er，
and Andrew EAL domain protein VieA
is a cyclic diguanylate .，2005，280，33324-
33330.
实施例2
(1)取实施例1制备的含c-di-GMP的粗产物溶液4mL，以1mL/min的流速，上样于
(2)上样结束后，以1.5mL/min流速，用25mM Tris-HCl(pH8.0)(A)和25mM Tris-
配有Mini Q 4.6/50PE的离子交换色谱柱GE AKTA FPLC；
HCl (pH8.0)+1M NaCl(B)梯度洗脱，梯度洗脱以0→20倍柱体积进行，洗
100％→0进行，同时洗脱液B的浓度值以0→100％进脱液A的浓度值以
行；
(3)用紫外检测器在254nm下检测；在洗脱液电导为35.97mS/cm时出峰，收集出峰
位置洗脱液，用质谱确证其结构[(ESI+)：m/e(relative intensity)：
346.2]，此部分洗脱液冻干，即得[M+1]+691.2，[M+2]2+
固体c-di-GMP(结果如图1所示)；
(4)将步骤(3)的产物经反相HPLC检测，所用高效液相色谱为Shimadzu LC-
10AD/AT， 反相色谱柱为Agela Venusil MP C18 4.6mm×250mm，洗脱液
溶液，洗脱液B为乙腈，流速为
以100％→50％
A为pH4.8的10mM乙酸胺水
1mL/min；梯度洗脱运行时间30分，洗脱液A的浓度值
进行，同时洗脱液B的浓度值以0→50％进行；检测结果：本实施例所制得
实施例3
(1)取实施例1制备的含c-di-GMP的粗产物溶液30mL，以3mL/min的流速，上样
于
(2)上样结束后，以3mL/min流速，用25mM Tris-HCl(pH8.0)(A)和25mM Tris-HCl
(pH8.0)+1M NaCl(B)梯度洗脱，梯度洗脱以0→20倍柱体积进行，洗脱液A
100％→0进行，同时洗脱液B的浓度值以0→100％进行；
配有Source Q HP 10/10离子交换色谱柱的GE AKTA FPLC；
的c-di-GMP纯度达100％(结果如图2所示)。
的浓度值以
(3)用紫外检测器在254nm下检测；在洗脱液电导为36.03mS/cm时出峰，收集出峰
位置洗脱液，用质谱确证其结构，此部分洗脱液冻干，即得固体c-di-GMP；
(4)将步骤(3)的产物经反相HPLC检测，所用高效液相色谱为Shimadzu LC-
10AD/AT， 反相色谱柱为Agela Venusil MP C184.6mm×250mm，洗脱液
溶液，洗脱液B为乙腈，流速为
以100％→50％进行，
的c-
A为pH4.8的10mM乙酸胺水
1mL/miin梯度洗脱运行时间30分，洗脱液A的浓度值
同时洗脱液B的浓度值以0→50％进行；检测结果：本实施例所制得
di-GMP纯度达96％。
实施例4
(1)取实施例1制备的含c-di-GMP的粗产物溶液200mL，以5mL/min的流速，上样
(2)上样结束后，以4mL/min流速，用25mM Tris-HCl(pH8.0)(A)和25mM Tris-HCl
(pH8.0)+1M NaCl(B)梯度洗脱，梯度洗脱以0→20倍柱体积进行，洗脱液A
100％→0进行，同时洗脱液B的浓度值以0→100％进行；
于配有Source Q HP 16/10离子交换色谱柱的GE AKTAFPLC；
的浓度值以
(3)用紫外检测器在254nm下检测；在洗脱液电导为36.07mS/cm时出峰，收集出峰
(4)将步骤(3)的产物经反相HPLC检测，所用高效液相色谱为Shimadzu LC-
10AD/AT， 反相色谱柱为Agela Venusil MP C184.6mm×250mm，洗脱液
溶液，洗脱液B为乙腈，流速为
以100％→50％
位置洗脱液，用质谱确证其结构，此部分洗脱液冻干，即得固体c-di-GMP；
A为pH4.8的10mM乙酸胺水
1mL/min；梯度洗脱运行时间30分，洗脱液A的浓度值
进行，同时洗脱液B的浓度值以0→50％进行；检测结果：本实施例所制得
的c-di-GMP纯度达95％。
2024年8月22日发(作者：百里慧巧)
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(21)申请号 CN2.X
(22)申请日 2011.09.20
(71)申请人 山东大学
地址 250100 山东省济南市历城区山大南路27号
(72)发明人 谷立川 朱春原 许素娟 陈颖 李冰清
(74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限公司
代理人 李健康
(51)
C07H19/213
C07H1/06
(10)申请公布号 CN 102443031 A
(43)申请公布日 2012.05.09
权利要求说明书 说明书 幅图
(54)发明名称
一种c-di-GMP的分离纯化方法
(57)摘要
本发明公开了一种c-di-GMP的分
离纯化方法，是将c-di-GMP粗产物溶液直
接上样于配有离子交换色谱柱的快速蛋白
液相色谱，用pH8.0缓冲液梯度洗脱，紫
外检测器254nm检测，收集出峰位置处洗
脱液，用质谱确证结构，然后将含目标化
合物洗脱液冻干，即制得固体c-di-GMP。
本发明方法制得的c-di-GMP经反相高效液
相色谱检测其纯度达95％以上，并实现了
一步法直接从c-di-GMP粗产物溶液中分离
纯化c-di-GMP，且本发明工艺简单，周期
短，不使用毒性有机溶剂，是一种高效、
环保、适合工业化生产的新方法。
法律状态
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.一种c-di-GMP的分离纯化方法，步骤是：
(1)取含c-di-GMP的粗产物溶液，以1～5mL/min的流速，直接上样于配有离子交
换色
(2)上样结束后，用洗脱液A和洗脱液B梯度洗脱，流速为1～5mL/min；其中所述
洗脱 液A为pH8.0的缓冲液，所述缓冲液为Tris-HCl、
谱柱的快速蛋白液相色谱，上样量为1～1000mL；
Na2HPO4-NaH2PO4或
K2HPO4-KH2PO4；
(3)用紫外检测器在254nm下检测，收集出峰位置处洗脱液，用质谱确证结构，然
后将
(4)以反相高效液相色谱检测，确定固体c-di-GMP纯度。
2.根据权利要求1所述c-di-GMP的分离纯化方法，其特征在于，所述快速蛋白液
相色
3.根据权利要求1所述c-di-GMP的分离纯化方法，其特征在于，所述离子交换色
谱柱 为Mini Q 4.6/50PE时，上样量为1～10mL，上样流速和洗脱
子交换色谱柱为
谱选GE AKTAFPLC。
含目标化合物洗脱液冻干，制得固体c-di-GMP；
所述洗脱液B为A液中加入1MNaCl；
流速均为1～2mL/min；所述离
Source Q HP 10/10时，上样量为10～100mL，上样流速和洗脱流速均为3～
4mL/min；所述离子交换色谱柱为Source Q HP 16/10时，上样量为50～
和洗脱流速均为4～5mL/min。 1000mL，上样流速
4.根据权利要求1所述c-di-GMP的分离纯化方法，其特征在于，所述梯度洗脱以
0→ 20倍柱体积进行，所述洗脱液A的浓度值以100％→0进行，
100％进行。 同时洗脱液B的浓度值以0→
5.根据权利要求1所述c-di-GMP的分离纯化方法，其特征在于，所述缓冲液为
Tris-HCl。
6.根据权利要求1所述c-di-GMP的分离纯化方法，其特征在于，所述高效液相色
谱为 Shimadzu LC-10AD/AT，反相色谱柱为
pH4.8的
Agela Venusil MP C184.6mm×250mm，洗脱液A为
10mM乙酸胺水溶液，洗脱液B为乙腈，流速为1mL/min；梯度洗脱运行时间30
分，洗脱液A的浓度值以100％→50％进行，同时洗脱液B的浓度
产物c-di-GMP保留时间在12.0～12.5min。值以0→50％进行；目标
说 明 书
技术领域
本发明涉及一种环鸟苷二磷酸(Cyclic diguanylate，c-di-GMP)的分离纯化方法，具
体地 说，是涉及用配有离子交换色谱柱的快速蛋白液相色谱
FPLC)分离纯化c-di-GMP的方法。(Fast protein liquid chromatography，
背景技术
环鸟苷二磷酸(Cyclic diguanylate，c-di-GMP)是一种具有细菌特异性的新型第二信
使， 它广泛存在于各种真细菌中，但不存在于真核生物中。c-di-GMP参
过程，包括生物膜的形成、运动性的调节、毒力
主要的生存方式，给人类的
据
与调控细菌的多种生理
因子的表达等。生物膜作为自然界中细菌
生产生活带来了严重危害。除了危害环境和工业生产以外，根
NIH的调查报告，80％以上的细菌性感染与生物膜有关，生物膜可以使细菌大幅度
提高
问题。
c-di-GMP在相关科研工作中有重要用途，但市场价格昂贵使其使用受限，2009年
12月 份价格调整为原价十分之一后，1μmol(0.7mg)仍需150欧元
它可以用多种方法来制备，例如组织提取
本的主要因素是其分
对抗生素的耐受性并抵抗机体的免疫防御，从而导致严重的临床耐药
(Biolog Life Science Institute)。
法、化学合成法或者酶促合成法，影响质量和成
离纯化。
现有技术通常采用反相高效液相色谱(High performance Liquid Chromatography，
HPLC) 来分离纯化c-di-GMP。以酶促合成c-di-GMP为例，步骤为：酶与底
c-di-GMP的混合液→煮沸、加入酸碱等方法使酶变性物GTP反应生成含
沉淀→离心→滤膜过滤除酶→冻干浓 缩→反相HPLC分离纯化→冻干
乙酸胺水溶液→得固体c-di-GMP。其中，HPLC所用流动相分别为乙腈和
(pH4.8)，用紫外检测器在254nm下检测产物。
由此可见，传统方法的分离纯化工艺复杂，耗时耗能。反相色谱柱对样品要求比较
严， 要先除去可能会在柱子上沉积的杂质(如酶)，不然会降低色谱柱使用
要有冻干仪又会耗费大量时间，致使生产效率低
溶剂，会对操作者和环境造
离纯化
寿命；冻干过程既需
下。并且由于在制备过程中使用大量有机
成危害，环保效果差。因此，开发新的简便、高效、绿色的分
技术是非常有必要的。
发明内容
针对现有技术中分离纯化c-di-GMP所存在的不足，本发明提供了一种新型的分离
纯
本发明所述c-di-GMP的分离纯化方法，步骤是：
(1)取含c-di-GMP的粗产物溶液，以1～5mL/min的流速，直接上样于配有离子交
换 色谱柱的快速蛋白液相色谱(Fast protein liquid chromatography，
1000mL；
化c-di-GMP的方法。
FPLC)，上样量为1～
(2)上样结束后，用洗脱液A和洗脱液B梯度洗脱，流速为1～5mL/min；其中所述
洗脱液A为pH8.0的缓冲液，所述缓冲液为Tris-HCl、
Na2HPO4-NaH2PO4或
K2HPO4-KH2PO4；所述
洗脱液B为A液中加入1M NaCl；
(3)用紫外检测器在254nm下检测，收集出峰位置处洗脱液，用质谱确证结构，然
后
(4)以反相高效液相色谱(High performance Liquid Chromatography，HPLC)检测，确
定
上述洗脱结束后的离子交换色谱柱，经洗脱液B彻底清除柱上吸附物，再经洗脱
液A
上述c-di-GMP分离纯化方法中，优选的实施条件是：
所述快速蛋白液相色谱优选GEAKTAFPLC；
所述离子交换色谱柱为Mini Q 4.6/50PE时，优选上样量为1～10mL，优选上样流
速 和洗脱流速均为1～2mL/min；所述离子交换色谱柱为
为10～100mL，优选上样流速和
Q HP 16/10时，
平衡后还可用于下一轮c-di-GMP的分离纯化。
固体c-di-GMP纯度。
将含目标化合物洗脱液冻干，制得固体c-di-GMP；
Source Q HP 10/10时，优选上样量
洗脱流速均为3～4mL/min；所述离子交换色谱柱为Source
优选上样量为50～1000mL，优选上样流速和洗脱流速均为4～5mL/min；
所述梯度洗脱优选以0→20倍柱体积进行，所述洗脱液A的浓度值以100％→0进
行，
所述缓冲液优选Tris-HCl；
同时洗脱液B的浓度值以0→100％进行；
所述高效液相色谱为Shimadzu LC-10AD/AT，反相色谱柱为Agela Venusil MP C18
4.6mm×250mm，洗脱液A为pH4.8的10mM乙酸胺水溶液，洗脱液B为乙
1mL/min；梯度洗脱运行时间30分，洗脱液A的浓度值以
B的浓度值以0→50％进行；目标产物c-
腈，流速为
100％→50％进行，同时洗脱液
di-GMP保留时间在12.0～12.5min。
利用本发明方法分离纯化后的c-di-GMP产物经反相HPLC检测，纯度达95％以上，
快速蛋白液相色谱(Fast protein liquid chromatography，FPLC)是一种新型、快速、
高效 色谱技术，目前主要用于分离纯化蛋白质，目前尚没有利用FPLC分
本发明采用离子交换FPLC装置作为主要设备来
产物，且待分离纯化的原料
理，实现了一
符合生物学、动物药理学等科研工作需要。
离纯化核苷酸的报导。
分离纯化c-di-GMP，不仅能够获得纯净的
在进入离子交换FPLC装置之前不需经过除酶、冻干浓缩等处
步法直接从酶反应液或组织提取液中分离纯化c-di-GMP。并且，离子交换
FPLC装置柱容量大、回收效率高且不易使生物分子失活，一次可以处理较
一步缩减了分离纯化时间，提高了分离纯化速度。 多的原料，进
与传统反相HPLC分离纯化技术相比，本发明在简化步骤、节省时间的同时，还
避免 了毒性有机溶剂乙腈的大量使用，显著提高了c-di-GMP分离纯化的
操作者和环境造成的危害。生产成本的降低、环
工业应用前景。
效率，消除了乙腈对
境污染的减轻无疑给该工作带来了广阔的
附图说明
图1.采用离子交换FPLC分离纯化c-di-GMP的图谱。
其中：FPLC为GE AKTA FPLC，离子交换色谱柱为Mini Q 4.6/50PE，两种洗脱液
分 别为25mM Tris-HCl(pH8.0)(A)和25mM Tris-HCl(pH8.0)+1M NaCl(B)。
c-di-GMP在洗脱液电导为35.97mS/cm时出峰。 目标产物
图2.本发明所得c-di-GMP经HPLC纯度鉴定图谱。
其中：HPLC为Shimadzu LC-10AD/AT，反相色谱柱为Agela Venusil MP C18
4.6mm×250mm，两种洗脱液分别为10mM乙酸胺水溶液(pH4.8)(A)和乙腈
c-di-GMP保留时间在12.3min。 (B)；目标产物
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细的描述，但本发明保护内容不仅限于此。
实施例1c-di-GMP的粗产物溶液的制备(酶促反应法)
将GTP(购自Sigma)和具有c-di-GMP合成活性的酶VCA0956以摩尔比1000∶2的
比例
加入到反应缓冲液(75mM Tris-HCl pH 8.0，250mM NaCl，25mM KCl，
室温下反应过夜，得含c-di-GMP的粗产10mM MgCl2)中，
物溶液。
其中：上述VCA0956的表达纯化及c-di-GMP的粗产物溶液制备的详细方法及步
骤请 参阅文献：Rita Tamayo，Anna er，
and Andrew EAL domain protein VieA
is a cyclic diguanylate .，2005，280，33324-
33330.
实施例2
(1)取实施例1制备的含c-di-GMP的粗产物溶液4mL，以1mL/min的流速，上样于
(2)上样结束后，以1.5mL/min流速，用25mM Tris-HCl(pH8.0)(A)和25mM Tris-
配有Mini Q 4.6/50PE的离子交换色谱柱GE AKTA FPLC；
HCl (pH8.0)+1M NaCl(B)梯度洗脱，梯度洗脱以0→20倍柱体积进行，洗
100％→0进行，同时洗脱液B的浓度值以0→100％进脱液A的浓度值以
行；
(3)用紫外检测器在254nm下检测；在洗脱液电导为35.97mS/cm时出峰，收集出峰
位置洗脱液，用质谱确证其结构[(ESI+)：m/e(relative intensity)：
346.2]，此部分洗脱液冻干，即得[M+1]+691.2，[M+2]2+
固体c-di-GMP(结果如图1所示)；
(4)将步骤(3)的产物经反相HPLC检测，所用高效液相色谱为Shimadzu LC-
10AD/AT， 反相色谱柱为Agela Venusil MP C18 4.6mm×250mm，洗脱液
溶液，洗脱液B为乙腈，流速为
以100％→50％
A为pH4.8的10mM乙酸胺水
1mL/min；梯度洗脱运行时间30分，洗脱液A的浓度值
进行，同时洗脱液B的浓度值以0→50％进行；检测结果：本实施例所制得
实施例3
(1)取实施例1制备的含c-di-GMP的粗产物溶液30mL，以3mL/min的流速，上样
于
(2)上样结束后，以3mL/min流速，用25mM Tris-HCl(pH8.0)(A)和25mM Tris-HCl
(pH8.0)+1M NaCl(B)梯度洗脱，梯度洗脱以0→20倍柱体积进行，洗脱液A
100％→0进行，同时洗脱液B的浓度值以0→100％进行；
配有Source Q HP 10/10离子交换色谱柱的GE AKTA FPLC；
的c-di-GMP纯度达100％(结果如图2所示)。
的浓度值以
(3)用紫外检测器在254nm下检测；在洗脱液电导为36.03mS/cm时出峰，收集出峰
位置洗脱液，用质谱确证其结构，此部分洗脱液冻干，即得固体c-di-GMP；
(4)将步骤(3)的产物经反相HPLC检测，所用高效液相色谱为Shimadzu LC-
10AD/AT， 反相色谱柱为Agela Venusil MP C184.6mm×250mm，洗脱液
溶液，洗脱液B为乙腈，流速为
以100％→50％进行，
的c-
A为pH4.8的10mM乙酸胺水
1mL/miin梯度洗脱运行时间30分，洗脱液A的浓度值
同时洗脱液B的浓度值以0→50％进行；检测结果：本实施例所制得
di-GMP纯度达96％。
实施例4
(1)取实施例1制备的含c-di-GMP的粗产物溶液200mL，以5mL/min的流速，上样
(2)上样结束后，以4mL/min流速，用25mM Tris-HCl(pH8.0)(A)和25mM Tris-HCl
(pH8.0)+1M NaCl(B)梯度洗脱，梯度洗脱以0→20倍柱体积进行，洗脱液A
100％→0进行，同时洗脱液B的浓度值以0→100％进行；
于配有Source Q HP 16/10离子交换色谱柱的GE AKTAFPLC；
的浓度值以
(3)用紫外检测器在254nm下检测；在洗脱液电导为36.07mS/cm时出峰，收集出峰
(4)将步骤(3)的产物经反相HPLC检测，所用高效液相色谱为Shimadzu LC-
10AD/AT， 反相色谱柱为Agela Venusil MP C184.6mm×250mm，洗脱液
溶液，洗脱液B为乙腈，流速为
以100％→50％
位置洗脱液，用质谱确证其结构，此部分洗脱液冻干，即得固体c-di-GMP；
A为pH4.8的10mM乙酸胺水
1mL/min；梯度洗脱运行时间30分，洗脱液A的浓度值
进行，同时洗脱液B的浓度值以0→50％进行；检测结果：本实施例所制得
的c-di-GMP纯度达95％。