2024年9月1日发(作者：郦晓莉)

整合高分辨熔解曲线和Sanger测序的MTHFR基因C677T

多态性检测新方法及其应用

王榕;白慧丽;程伟;张玉洪

【摘 要】目的 建立一种基于整合优化的高分辨熔解曲线(HRM)和Sanger测序的

分子诊断新方法,并探索其亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T多态性

(rs1801133)检测应用.方法 针对MTHFR基因C677T设计一对带有M13接头的

通用引物,通过优化HRM反应体系,提高HRM的分析性能;并利用M13接头作为

测序引物直接对HRM产物进行Sanger测序验证.收集该院体检中心的外周血标本

1 030份,应用所建立的新方法检测标本MTHFR基因C677T多态性.结果 成功建

立了基于整合优化的HRM和Sanger测序的新方法,并成功应用于临床标本

MTHFR基因C677T多态性检测.1 030份标本中,CC基因型占39.13％,CT基因型

占48.16％,TT基因型占12.71％.结论 本研究成功建立了一种检测MTHFR基因

C677T的新方法,该方法具有简便经济、快速准确和高通量的特点,适用于临床大规

模检测.

【期刊名称】《重庆医学》

【年(卷),期】2019(048)001

【总页数】3页(P161-163)

【关键词】高分辨熔解曲线;亚甲基四氢叶酸还原酶(NADPH);多态性,单核苷

酸;Sanger测序

【作 者】王榕;白慧丽;程伟;张玉洪

【作者单位】重庆医科大学附属第一医院检验科 400016;重庆医科大学附属第一

医院临床分子医学检测中心 400016;重庆医科大学附属第一医院临床分子医学检

测中心 400016;重庆医科大学附属第一医院检验科 400016

【正文语种】中 文

【中图分类】R446.9

亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是人体

叶酸代谢的关键酶，C677T是MTHFR基因最常见的多态性，会导致酶活性差异，

影响机体叶酸代谢[1]。与野生型比较，杂合突变型与纯合突变型表达的酶活性分

别下降30%和70%[2]。C677T多态性与高同型半胱氨酸血症[3]、高血压[4]、心

脑血管意外[5]、习惯性流产[6]、胎儿出生缺陷如神经管缺陷[7]、先天性心脏病[8]

等明显相关。我国《高血压合理用药指南》(第二版)[9]和《围受孕期增补叶酸预防

神经管缺陷指南(2017)》[10]均明确指出应基于MTHFR基因C677T检测结果进

行个体化干预，合理补充叶酸，防止高血压并发症和出生缺陷。

目前，针对MTHFR基因C677T检测，临床应用较多的聚合酶链式反应-限制性片

段长度多态性(PCR-RFLP)分析过程繁琐，周期较长，易造成污染；Sanger测序是

基因检测金标准，但成本高昂，通量不足，不适于临床大规模分析。高分辨熔解曲

线(high resolution melting curve，HRM)分析技术是一种基于高分辨检测不同

基因型扩增产物熔解温度(Tm)差异的基因多态性分析新方法[11]，该方法具有快

速简便、经济和高通量的优点，适用于临床批量检测。然而，传统的HRM分析技

术在临床实际应用过程中仍需突破以下固有缺陷：对部分野生型及纯合突变型辨识

能力不足，且对各标本扩增效率的一致性要求严苛。因此，本研究建立了一种基于

整合优化的HRM和Sanger测序的分子诊断新方法，并探索其MTHFR基因

C677T基因多态性检测临床应用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2016年6月至2017年10月本院体检中心1 030份乙二胺四乙酸

二钾(EDTA-2K)抗凝外周血标本；CC、CT和TT基因型DNA各10份(自备，均

经Sanger测序确认)。主要仪器与试剂：实时荧光定量PCR仪、LightCycler 480

High Resolution Melting Master(瑞士罗氏公司)；3500Dx测序仪(美国赛默飞

公司)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 提取基因组DNA，测定其纯度和浓度并将浓度调至4 ng/μL。

1.2.2 引物设计与验证 用Primer Premier5.0软件设计针对MTHFR基因C677T

多态性特异性引物，并引入正向(F)、反向(R)M13接头。MTHFR-F：5′-M13F-

GAA GCA CTT GAA GGA GAA-3′;MTHFR-R：5′-M13R-TCA CAA AGC GGA

AGA AGT-3′。M13F：5′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3′;M13R：5′-CAG

GAA ACA GCT ATG ACC-3′。通过PCR产物电泳及Sanger测序验证引物特异

性。

1.2.3 优化HRM分析技术 反应体系：4 ng/μL标本DNA 5.00 μL，4 μmol/L正、

反向引物各0.50 μL，25 mmol/L MgCl2 2.00 μL，PCR MIX 10.00 μL，在此基

础上加入4 ng/μL CC基因型DNA 0.83 μL(相当于DNA总量1/7)，余用

ddH2O补足至20.00 μL。反应程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，65 ℃至50 ℃

退火10 s，72 ℃ 10 s，45个循环；95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，65 ℃ 1 s，收

集65 ℃至95 ℃荧光信号(升温速度0.02 ℃/s)；40 ℃ 30 s。

1.2.4 Sanger测序直接检测HRM产物 以M13R为测序引物直对1.2.3中“灰区”

标本HRM产物进行Sanger测序。

1.3 统计学处理 采用SPSS21.0 软件进行数据分析，计量资料以频数或百分率表示。

2 结 果

2.1 引物特异性验证 PCR产物电泳结果为预期条带，经Sanger测序验证为目标

序列，见图1。

M:DL 2000 DNA Marker;1～6:标本PCR产物图1 MTHFR基因扩增产物电泳图

2.2 优化的HRM反应体系 传统HRM方法无法区分野生型和纯合突变型DNA。

本研究加入相当于DNA总量1/7的野生型DNA优化后能够显著区分3种基因型，

且结果与Sanger测序结果一致，见图2。

图2 加入1/7野生型DNA前后的熔解曲线

图3 Sanger测序直接检测6份“灰区”标本HRM产物

2.3 MTHFR基因C677T多态性检测结果 基于优化的HRM联合Sanger测序成

功检测1 030份未知标本：其中1 024份(99.42%)由优化的HRM有效分型；余

6份(0.58%)经HRM无法分型，其HRM产物经Sanger测序为2份野生型、3份

杂合突变型和1份纯合突变型，见图3。本研究中1 030份DNA的MTHFR基因

C677T野生(CC)基因型为403份(39.13%)，杂合突变(CT)基因型为496份

(48.16%)，纯合突变(TT)基因型为131份(12.71%)；等位基因(C)的频率为1 302

份(63.20%)，等位基因(T)的频率为758份(36.80%)。

3 讨 论

HRM是一种基于单核苷酸Tm值差异的高灵敏基因分析技术。它通过实时监测

DNA双链沟槽中饱和荧光染料信号值的变化，从而将单个碱基差异通过不同形态

的熔解曲线直观地展示出来。但是，在使用HRM技术检测单核苷酸多态性时往往

会出现部分纯合突变型和野生型标本无法辨识的问题[12-13]。本研究在实验初始

阶段使用传统HRM方法时结果亦是如此。随后，基于PALAIS等[14]研究，通过

加入1/7野生型DNA并在扩增结束后变性杂交(95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min)使纯

合突变型标本产生部分异源杂化双链DNA，造成其Tm值下降，从而准确区分于

野生型标本。

笔者使用上述优化HRM反应体系能够有效甄别绝大多数(99.42%)标本MTHFR

基因C677T多态性，但仍有6份(0.58%)标本使用优化HRM无法辨别基因型。

由于HRM对于各标本扩增效率的一致性要求严苛，笔者推测这6份标本可能是因

其DNA自身存在抑制剂等原因造成扩增效率不足，导致上述优化方案也无法检测。

因此，笔者通过Sanger测序检测这6份“灰区”标本的MTHFR基因C677T多

态性。如图3C所示，本研究优化时加入1/7野生型DNA造成测序时纯合突变型

红色T峰下有低小的蓝色C峰，随后笔者利用Chromas分析软件将其选作“背景

干扰”进行校正后碱基读取结果并未改变，说明本文所构建的优化方案对下游测序

分析无干扰。本研究设计的引物专门修饰了M13接头，可直接对6份标本HRM

产物进行Sanger测序验证，无需重新扩增标本，且得到了准确可靠的测序结果。

如前所述，MTHFR基因C677T多态性与许多疾病显著相关。本研究中TT基因型

频率高达12.71%，与其他已报道数据大体一致[15]。随着MTHFR基因C677T

检测被逐渐纳入相关诊疗指南，建立适用于临床大规模筛查的基因检测新方法十分

必要。本研究针对MTHFR基因C677T多态性，建立了一种基于有机整合优化的

HRM和Sanger测序的新方法，在保留传统HRM法无需特异性探针、闭管操作

无污染、灵敏度高、特异度高、经济简便、快速和高通量等优势的基础上，进一步

提高了传统HRM的基因分型能力和准确性。因此，本课题组所设计的整合优化的

HRM和Sanger测序的分子诊断新方法能够有机结合HRM和Sanger测序的优

势，适用于大规模临床标本检测。此外，本研究所构建的新方法不仅可用于

MTHFR基因C677T多态性的临床批量检测，也可推广应用于其他基因多态性检

测，具有重要的临床应用推广价值。

参考文献

【相关文献】

[1]SENEMAR S，SAFFARI B，SHARIFKAZEMI M B，et al．5，10-methylene

tetrahydrofolate reductase C677T gene polymorphism，homocysteine concentration and

the extent of premature coronary artery disease in southern Iran[J]．EXCLI J，2013，12：

437-448．

[2]ROZEN R．Genetic predisposition to hyperhomocysteinemia deficiency of

methylenetetrahydro folate reductase(MTHFR)[J]．Thromb Haemost，1997，78(1)：523-

526．

[3]CHANG Y T，HSU S W，TSAI S J，et al．Genetic effect of MTHFR C677T polymorphism

on the structural covariance network and white-matter integrity in Alzheimer′s

disease[J]．Hum Brain Mapp，2017，38(6)：3039-3051．

[4]ZHAO M，WANG X，HE M，et al．Homocysteine and stroke risk：modifying effect of

methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism and folic acid

intervention[J]．Stroke，2017，48(5)：1183-1190．

[5]HUANG X，LI Y，LI P，et al．Association between percent decline in serum total

homocysteine and risk of first stroke[J]．Neurology，2017，89(20)：2101-2107．

[6]ZHU rphisms in the methylene tetrahydrofolate reductase and methionine

synthase reductase genes and their correlation with unexplained recurrent spontaneous

abortion susceptibility[J].Genet Mol Res,2015,14(3):8500.

[7]HAYATI A R,ZAINAL A I,TAN G C,et C677T polymorphism as a risk factor of

neural tube defects in Malay:a case control study[J].Med J Malaysia,2008,63(5):379-383.

[8]YUAN Y,YU X,NIU F,et c polymorphism of methylenetetrahydrofolate

reductase as a potential risk factor for congenital heart disease:a meta-analysis in Chinese

pediatric population[J].Medicine,2017,96(23):e7057.

[9]国家卫生计生委合理用药专家委员会,中国医师协会高血压专业委员会.高血压合理用药指南(第2

版)[J/CD].中国医学前沿杂志(电子版),2017,9(7):28-126.

[10]围受孕期增补叶酸预防神经管缺陷指南工作组．围受孕期增补叶酸预防神经管缺陷指南

(2017)[J]．中国生育健康杂志，2017，28(5)：401-410．

[11]LI Y D，CHU Z Z，LIU X G，et al．A cost-effective high-resolution melting approach

using the EvaGreen dye for DNA polymorphism detection and genotyping in plants[J]．J

Integr Plant Biol，2010，52(12)：1036-1042．

[12]KANDERIAN S,JIANG L,KNIGHT ted classification and cluster visualization of

genotypes derived from high resolution melt curves[J].PLoS One,2015,10(11):e0143295.

[13]潘美晨，蔡应木．G6PD 缺乏症基因型检测新方法的建立及分子流行特征分析[J]．分子诊断与

治疗杂志，2012，4(4)：222-226．

[14]PALAIS R A，LIEW M A，WITTWER C T．Quantitative heteroduplex analysis for single

nucleotide polymorphism genotyping[J]．Anal Biochem，2005，346(1)：167-175．

[15]范超，陈鸣，邓少丽，等．重庆地区脑卒中患者Hcy水平及MTHFR C677T基因多态性研究

[J]．重庆医学，2016，45(35)：4932-4933．

2024年9月1日发(作者：郦晓莉)

整合高分辨熔解曲线和Sanger测序的MTHFR基因C677T

多态性检测新方法及其应用

王榕;白慧丽;程伟;张玉洪

【摘 要】目的 建立一种基于整合优化的高分辨熔解曲线(HRM)和Sanger测序的

分子诊断新方法,并探索其亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T多态性

(rs1801133)检测应用.方法 针对MTHFR基因C677T设计一对带有M13接头的

通用引物,通过优化HRM反应体系,提高HRM的分析性能;并利用M13接头作为

测序引物直接对HRM产物进行Sanger测序验证.收集该院体检中心的外周血标本

1 030份,应用所建立的新方法检测标本MTHFR基因C677T多态性.结果 成功建

立了基于整合优化的HRM和Sanger测序的新方法,并成功应用于临床标本

MTHFR基因C677T多态性检测.1 030份标本中,CC基因型占39.13％,CT基因型

占48.16％,TT基因型占12.71％.结论 本研究成功建立了一种检测MTHFR基因

C677T的新方法,该方法具有简便经济、快速准确和高通量的特点,适用于临床大规

模检测.

【期刊名称】《重庆医学》

【年(卷),期】2019(048)001

【总页数】3页(P161-163)

【关键词】高分辨熔解曲线;亚甲基四氢叶酸还原酶(NADPH);多态性,单核苷

酸;Sanger测序

【作 者】王榕;白慧丽;程伟;张玉洪

【作者单位】重庆医科大学附属第一医院检验科 400016;重庆医科大学附属第一

医院临床分子医学检测中心 400016;重庆医科大学附属第一医院临床分子医学检

测中心 400016;重庆医科大学附属第一医院检验科 400016

【正文语种】中 文

【中图分类】R446.9

亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是人体

叶酸代谢的关键酶，C677T是MTHFR基因最常见的多态性，会导致酶活性差异，

影响机体叶酸代谢[1]。与野生型比较，杂合突变型与纯合突变型表达的酶活性分

别下降30%和70%[2]。C677T多态性与高同型半胱氨酸血症[3]、高血压[4]、心

脑血管意外[5]、习惯性流产[6]、胎儿出生缺陷如神经管缺陷[7]、先天性心脏病[8]

等明显相关。我国《高血压合理用药指南》(第二版)[9]和《围受孕期增补叶酸预防

神经管缺陷指南(2017)》[10]均明确指出应基于MTHFR基因C677T检测结果进

行个体化干预，合理补充叶酸，防止高血压并发症和出生缺陷。

目前，针对MTHFR基因C677T检测，临床应用较多的聚合酶链式反应-限制性片

段长度多态性(PCR-RFLP)分析过程繁琐，周期较长，易造成污染；Sanger测序是

基因检测金标准，但成本高昂，通量不足，不适于临床大规模分析。高分辨熔解曲

线(high resolution melting curve，HRM)分析技术是一种基于高分辨检测不同

基因型扩增产物熔解温度(Tm)差异的基因多态性分析新方法[11]，该方法具有快

速简便、经济和高通量的优点，适用于临床批量检测。然而，传统的HRM分析技

术在临床实际应用过程中仍需突破以下固有缺陷：对部分野生型及纯合突变型辨识

能力不足，且对各标本扩增效率的一致性要求严苛。因此，本研究建立了一种基于

整合优化的HRM和Sanger测序的分子诊断新方法，并探索其MTHFR基因

C677T基因多态性检测临床应用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2016年6月至2017年10月本院体检中心1 030份乙二胺四乙酸

二钾(EDTA-2K)抗凝外周血标本；CC、CT和TT基因型DNA各10份(自备，均

经Sanger测序确认)。主要仪器与试剂：实时荧光定量PCR仪、LightCycler 480

High Resolution Melting Master(瑞士罗氏公司)；3500Dx测序仪(美国赛默飞

公司)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 提取基因组DNA，测定其纯度和浓度并将浓度调至4 ng/μL。

1.2.2 引物设计与验证 用Primer Premier5.0软件设计针对MTHFR基因C677T

多态性特异性引物，并引入正向(F)、反向(R)M13接头。MTHFR-F：5′-M13F-

GAA GCA CTT GAA GGA GAA-3′;MTHFR-R：5′-M13R-TCA CAA AGC GGA

AGA AGT-3′。M13F：5′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3′;M13R：5′-CAG

GAA ACA GCT ATG ACC-3′。通过PCR产物电泳及Sanger测序验证引物特异

性。

1.2.3 优化HRM分析技术 反应体系：4 ng/μL标本DNA 5.00 μL，4 μmol/L正、

反向引物各0.50 μL，25 mmol/L MgCl2 2.00 μL，PCR MIX 10.00 μL，在此基

础上加入4 ng/μL CC基因型DNA 0.83 μL(相当于DNA总量1/7)，余用

ddH2O补足至20.00 μL。反应程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，65 ℃至50 ℃

退火10 s，72 ℃ 10 s，45个循环；95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，65 ℃ 1 s，收

集65 ℃至95 ℃荧光信号(升温速度0.02 ℃/s)；40 ℃ 30 s。

1.2.4 Sanger测序直接检测HRM产物 以M13R为测序引物直对1.2.3中“灰区”

标本HRM产物进行Sanger测序。

1.3 统计学处理 采用SPSS21.0 软件进行数据分析，计量资料以频数或百分率表示。

2 结 果

2.1 引物特异性验证 PCR产物电泳结果为预期条带，经Sanger测序验证为目标

序列，见图1。

M:DL 2000 DNA Marker;1～6:标本PCR产物图1 MTHFR基因扩增产物电泳图

2.2 优化的HRM反应体系 传统HRM方法无法区分野生型和纯合突变型DNA。

本研究加入相当于DNA总量1/7的野生型DNA优化后能够显著区分3种基因型，

且结果与Sanger测序结果一致，见图2。

图2 加入1/7野生型DNA前后的熔解曲线

图3 Sanger测序直接检测6份“灰区”标本HRM产物

2.3 MTHFR基因C677T多态性检测结果 基于优化的HRM联合Sanger测序成

功检测1 030份未知标本：其中1 024份(99.42%)由优化的HRM有效分型；余

6份(0.58%)经HRM无法分型，其HRM产物经Sanger测序为2份野生型、3份

杂合突变型和1份纯合突变型，见图3。本研究中1 030份DNA的MTHFR基因

C677T野生(CC)基因型为403份(39.13%)，杂合突变(CT)基因型为496份

(48.16%)，纯合突变(TT)基因型为131份(12.71%)；等位基因(C)的频率为1 302

份(63.20%)，等位基因(T)的频率为758份(36.80%)。

3 讨 论

HRM是一种基于单核苷酸Tm值差异的高灵敏基因分析技术。它通过实时监测

DNA双链沟槽中饱和荧光染料信号值的变化，从而将单个碱基差异通过不同形态

的熔解曲线直观地展示出来。但是，在使用HRM技术检测单核苷酸多态性时往往

会出现部分纯合突变型和野生型标本无法辨识的问题[12-13]。本研究在实验初始

阶段使用传统HRM方法时结果亦是如此。随后，基于PALAIS等[14]研究，通过

加入1/7野生型DNA并在扩增结束后变性杂交(95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min)使纯

合突变型标本产生部分异源杂化双链DNA，造成其Tm值下降，从而准确区分于

野生型标本。

笔者使用上述优化HRM反应体系能够有效甄别绝大多数(99.42%)标本MTHFR

基因C677T多态性，但仍有6份(0.58%)标本使用优化HRM无法辨别基因型。

由于HRM对于各标本扩增效率的一致性要求严苛，笔者推测这6份标本可能是因

其DNA自身存在抑制剂等原因造成扩增效率不足，导致上述优化方案也无法检测。

因此，笔者通过Sanger测序检测这6份“灰区”标本的MTHFR基因C677T多

态性。如图3C所示，本研究优化时加入1/7野生型DNA造成测序时纯合突变型

红色T峰下有低小的蓝色C峰，随后笔者利用Chromas分析软件将其选作“背景

干扰”进行校正后碱基读取结果并未改变，说明本文所构建的优化方案对下游测序

分析无干扰。本研究设计的引物专门修饰了M13接头，可直接对6份标本HRM

产物进行Sanger测序验证，无需重新扩增标本，且得到了准确可靠的测序结果。

如前所述，MTHFR基因C677T多态性与许多疾病显著相关。本研究中TT基因型

频率高达12.71%，与其他已报道数据大体一致[15]。随着MTHFR基因C677T

检测被逐渐纳入相关诊疗指南，建立适用于临床大规模筛查的基因检测新方法十分

必要。本研究针对MTHFR基因C677T多态性，建立了一种基于有机整合优化的

HRM和Sanger测序的新方法，在保留传统HRM法无需特异性探针、闭管操作

无污染、灵敏度高、特异度高、经济简便、快速和高通量等优势的基础上，进一步

提高了传统HRM的基因分型能力和准确性。因此，本课题组所设计的整合优化的

HRM和Sanger测序的分子诊断新方法能够有机结合HRM和Sanger测序的优

势，适用于大规模临床标本检测。此外，本研究所构建的新方法不仅可用于

MTHFR基因C677T多态性的临床批量检测，也可推广应用于其他基因多态性检

测，具有重要的临床应用推广价值。

参考文献

【相关文献】

[1]SENEMAR S，SAFFARI B，SHARIFKAZEMI M B，et al．5，10-methylene

tetrahydrofolate reductase C677T gene polymorphism，homocysteine concentration and

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[2]ROZEN R．Genetic predisposition to hyperhomocysteinemia deficiency of

methylenetetrahydro folate reductase(MTHFR)[J]．Thromb Haemost，1997，78(1)：523-

526．

[3]CHANG Y T，HSU S W，TSAI S J，et al．Genetic effect of MTHFR C677T polymorphism

on the structural covariance network and white-matter integrity in Alzheimer′s

disease[J]．Hum Brain Mapp，2017，38(6)：3039-3051．

[4]ZHAO M，WANG X，HE M，et al．Homocysteine and stroke risk：modifying effect of

methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism and folic acid

intervention[J]．Stroke，2017，48(5)：1183-1190．

[5]HUANG X，LI Y，LI P，et al．Association between percent decline in serum total

homocysteine and risk of first stroke[J]．Neurology，2017，89(20)：2101-2107．

[6]ZHU rphisms in the methylene tetrahydrofolate reductase and methionine

synthase reductase genes and their correlation with unexplained recurrent spontaneous

abortion susceptibility[J].Genet Mol Res,2015,14(3):8500.

[7]HAYATI A R,ZAINAL A I,TAN G C,et C677T polymorphism as a risk factor of

neural tube defects in Malay:a case control study[J].Med J Malaysia,2008,63(5):379-383.

[8]YUAN Y,YU X,NIU F,et c polymorphism of methylenetetrahydrofolate

reductase as a potential risk factor for congenital heart disease:a meta-analysis in Chinese

pediatric population[J].Medicine,2017,96(23):e7057.

[9]国家卫生计生委合理用药专家委员会,中国医师协会高血压专业委员会.高血压合理用药指南(第2

版)[J/CD].中国医学前沿杂志(电子版),2017,9(7):28-126.

[10]围受孕期增补叶酸预防神经管缺陷指南工作组．围受孕期增补叶酸预防神经管缺陷指南

(2017)[J]．中国生育健康杂志，2017，28(5)：401-410．

[11]LI Y D，CHU Z Z，LIU X G，et al．A cost-effective high-resolution melting approach

using the EvaGreen dye for DNA polymorphism detection and genotyping in plants[J]．J

Integr Plant Biol，2010，52(12)：1036-1042．

[12]KANDERIAN S,JIANG L,KNIGHT ted classification and cluster visualization of

genotypes derived from high resolution melt curves[J].PLoS One,2015,10(11):e0143295.

[13]潘美晨，蔡应木．G6PD 缺乏症基因型检测新方法的建立及分子流行特征分析[J]．分子诊断与

治疗杂志，2012，4(4)：222-226．

[14]PALAIS R A，LIEW M A，WITTWER C T．Quantitative heteroduplex analysis for single

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