2024年9月7日发(作者：单诗丹)
MSP
原理
其基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因组
DNA,
未甲基化的胞喀咤变成尿喀咤，而甲基化的
胞喀咤不变，然后用
3
对特异性的引物对所测基因的同一核甘酸序列进行扩增。扩增产物用
DNA
琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描观察分析结果。
引物设计原则
标准的
PCR
引物设计原则同样适用于硫化测序
PCR(bisulfitesequencingPCR,BSP),
除了
标准
PCR
的一些参数外
，“MethPrime
应用
3'
端算法计算自身退火温度、末端退火温度、碱基对互补率、
GC
含量、解链温度
(Tm),
而且还提供了上游引物和下游引物的
Tm
区别，以及
引物中最大允许的单核甘酸重复率。因为所有非甲基化的
“C
都被转换成
“T”
所以
“MethPrimer
中默认的重
复
“T
为
8
个,而其他碱基重复数为
5
个。
DNA
的完全硫化是很重要的，因此应选择含尽可能多的非甲基化
CpG
的
“C
区域作为源序列，设计
引物。对于
BSP,
引物设计的原则
[1]:
①为了区别甲基化
DNA
和非甲基化
DNA,
引物不应含有
CpG
位点:②
引物扩增的产物应包含尽可能多的
CpG
位点。
对于
MSP
需要设计
2
对引物，一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的甲基化的
DNA;
另一对
是针对于经亚硫酸氢盐处理的非甲基化的
DNA
。根据甲基化的
DNA
为模板的
PCR
扩增甲
基化的
DNA;
根据非甲基化的
DNA
为模板的
PCR
扩增非甲基化的
DNA
。
MSP
引物设计的原则：①为了最
大限度的区分甲基化与非甲基化，引物的
3'
端至少包含
1
个
CpG
位点，我们
可以自己设定
CpG
的
“C"
距
3'
末端的最远距离。
"MethPrimer”
中默认值为
3,
即是在引物的最后
3
个碱基中
至少有
1
个是
CpG
的
“C"
。②引物序列中应包含尽可能多的
CpG
位点。
③甲基化引物和非甲基化引物序列
3'
端应处于相同的
CpG
位点。如果
,2
对引物不在相同
的
CpG
位点退火
，PCR
结果就不能准确反映样本
DNA
甲基化的情况。但是甲基化引物和非
甲基化引物可跨越不同的长度，在起始位点和长度上也可以不同。一般非甲基化引物比甲基
化引物长，因为受
Tm
值限制，由于非甲基化引物中的
“C”
转化成
“T”，
导致
GC
含量降低，从而引起
Tm
降低。④
2
套引物应有相近的
Tm
值，
“MethPrimer”
中默认
2
套引物
Tm
值相差不超过
5C,
这种限制可使
2
个
PCR
反应在同一
PCR
仪中进行。
问题解决参考
./bbs/topic/9184927?keywords=MSP
引物设计步骤（以
CLEC14A
基因为例）：
1.
找到目标基因的启动子区（
promoter）
序列
首先打开
ensembl
页面：
./
BLAST/BLATbioMart|ToolsHelp&Dwume
杭窥
ion|EflogMirrors
Si«h|Human~V|for
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榜
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如图在搜索框第一个物种选择
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基因填入要研究的基因名，点击
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C-7Y=ELECTINDOMAIN!FNMILY14,MEIMSHRACLECfM[^l6S4b].：
UMgenerecorddesctiplion.C-TYPELECTINDOMAINFAMILY14,VIEhl
日
ERA
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matchedtcG&neENSG000001/M3S
VariGnttaDle*PhanDtjpes・Location*EdennglRefs.*Rggulafion•Drihclagues*G
曰
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搜索结果页面第一条下面箭头所指处
Regulation,
点击它（这里面主要是基因调控区域的信
打开新的页面后，下拉至长长的表格，找到第一个
息）
promoter,
长度在
2000bp
左右。
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然后点击最右侧
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旁边的
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出现的就是启动子区的序列了
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将序列信息复制，然后就可以进入下一步
2. MSP
引物设计
./methprimer/
或者他们新开发的
2.0
页
打开
MSP
在线引物设计工具页面:
/methprimer2/
Search
predesigned
primers
进入后我们选择第一个就好
Mapprimersto
genomes
Sequence
manipulation
Sequence
extraction
MeihPnMgsdesignpfimersmrmostbfsunteccmersmbasedi
FOR
primers：celit
alwalwyoutosearchfcrpr«ledgr>ectprimersfgrhirrign
日
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* CpGIslandprEugrrYoucanaiwus?(tieprogram：0
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rtCpG13m
力
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进入引物设计页面后，我们把上一步得到的启动子区序列复制进这个大框框里，然后勾选箭
头标示的两个选框，没有其他特殊要求其他部分均按默认选项设置就好。然后点击
submit
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CpGIslandPrediction
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门：
1.
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新生成的页面中会有
CpG
岛的预测，后续如果还有其他引物要设计，可能需要这些信息。
将页面继续下拉即出现设计好的引物啦
我们通常没有特殊要求选择第一对引物就可以。要注意
PrimerDesignResults
MSP
需要两对引物，分别针对被甲
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基化的基因序列和没有被甲基化的。将序列复制下来加入实验设计，
done.
当然如果第一对引物不
work,
建议一次把多组引物都保存下来，以备不时之需。
2024年9月7日发(作者：单诗丹)
MSP
原理
其基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因组
DNA,
未甲基化的胞喀咤变成尿喀咤，而甲基化的
胞喀咤不变，然后用
3
对特异性的引物对所测基因的同一核甘酸序列进行扩增。扩增产物用
DNA
琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描观察分析结果。
引物设计原则
标准的
PCR
引物设计原则同样适用于硫化测序
PCR(bisulfitesequencingPCR,BSP),
除了
标准
PCR
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端算法计算自身退火温度、末端退火温度、碱基对互补率、
GC
含量、解链温度
(Tm),
而且还提供了上游引物和下游引物的
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区别，以及
引物中最大允许的单核甘酸重复率。因为所有非甲基化的
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引物设计的原则
[1]:
①为了区别甲基化
DNA
和非甲基化
DNA,
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引物扩增的产物应包含尽可能多的
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需要设计
2
对引物，一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的甲基化的
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是针对于经亚硫酸氢盐处理的非甲基化的
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MSP
引物设计的原则：①为了最
大限度的区分甲基化与非甲基化，引物的
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CpG
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可以自己设定
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即是在引物的最后
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至少有
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CpG
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③甲基化引物和非甲基化引物序列
3'
端应处于相同的
CpG
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对引物不在相同
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CpG
位点退火
，PCR
结果就不能准确反映样本
DNA
甲基化的情况。但是甲基化引物和非
甲基化引物可跨越不同的长度，在起始位点和长度上也可以不同。一般非甲基化引物比甲基
化引物长，因为受
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值限制，由于非甲基化引物中的
“C”
转化成
“T”，
导致
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含量降低，从而引起
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降低。④
2
套引物应有相近的
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2
套引物
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值相差不超过
5C,
这种限制可使
2
个
PCR
反应在同一
PCR
仪中进行。
问题解决参考
./bbs/topic/9184927?keywords=MSP
引物设计步骤（以
CLEC14A
基因为例）：
1.
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打开
MSP
在线引物设计工具页面:
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进入后我们选择第一个就好
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进入引物设计页面后，我们把上一步得到的启动子区序列复制进这个大框框里，然后勾选箭
头标示的两个选框，没有其他特殊要求其他部分均按默认选项设置就好。然后点击
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我们通常没有特殊要求选择第一对引物就可以。要注意
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基化的基因序列和没有被甲基化的。将序列复制下来加入实验设计，
done.
当然如果第一对引物不
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建议一次把多组引物都保存下来，以备不时之需。