2024年11月2日发(作者：闻嘉佑)

浙江预防医学２０１５年７月第２７卷第７期Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｐｒｅｖ　Ｍｅｄ，Ｊｕ１．２０１５，Ｖｏｌ　２７，Ｎｏ．７　・６９１・　

・

论著・　

ＭＰＢ６４免疫胶体金检测法在　

分枝杆菌菌种鉴定中的应用　

潘爱珍，吴蓓蓓，柳正卫，郑琳，王晓萌　

浙江省疾病预防控制中心，浙江杭州

摘要：目的

３１００５１　

以ＰＣＲ扩增测序法　评价ＭＰＢ６４免疫胶体金快速检测法在分枝杆菌菌种鉴定中的应用价值。方法

为“金标准”，对ＭＰＢ６４免疫胶体金法和传统ＰＮＢ／ＴＣＨ法对２种分枝杆菌标准菌株和４１８株临床分枝杆菌分离　

株的菌种鉴定能力作比较。结果胶体金法、ＰＮＢ／ＴＣＨ法与ＰＣＲ测序法结果一致率分别是９５．９３％和８７．０８％，　

胶体金法鉴定结核分枝杆菌敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别８８．４１％、９９．６４％、９９．１９％和　

９４．５８％。而ＰＮＢ／ＴＣＨ法为６２．３２％、９９．２９％、９７．７２％和８４．２４％。胶体金法１５　ｍｉｎ即可作出鉴定结果，较传　

统的ＰＮＢ／ＴＣＨ法提前了２８　ｄ，比测序法提前３　ｄ。结论

关键词：免疫胶体金法；分枝杆菌；菌种鉴定　

中图分类号：Ｒ４４６．６　文献标识码：Ａ　文章编号：１００７—０９３１（２０１５）０７—０６９１—０４　

与ＰＮＢ／ＴＣＨ法相比，ＭＰＢ６４免疫胶体金法在分枝杆菌　

菌种鉴定中，具有较高的特异度和灵敏度，且方法简便、快速，适合基层推广应用。　

Ａ　ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＰＢ６４　ａｎｔｉｇｅｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　

ｉｍｍｕｎｅ　ｃｏｌｌｏｉｄａｌ　ｇｏｌｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　

ＰＡＮ　Ａｉ—ｚｈｅｎ，ＷＵ　Ｂｅｉ—ｂｅｉ，ＬＩＵ　Ｚｈｅｎｇ—ｗｅｉ，ＺＨＥＮＧ　Ｌｉｎ，ＷＡＮＧ　Ｘｉａｏ—ｍｅｎｇ　

Ｔｈｅ　Ｃｅｎｔｅｒｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｆＺｈｅｊｉａｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，３１００５１，Ｃｈｉｎａ　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｋｎｏｗ　ｔｈｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＰＢ６４　ａｎｔｉｇｅｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｅ　ｃｏｌｌｏｉｄａｌ　ｇｏｌｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　

ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔａｋｉｎｇ　ｔｈｅ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｉｆｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ｇｏｌｄ　ｓｔａｎｄａｒｄ．ａ　ｔｏｔａｌ　ｏｆ　

４１８　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｍｙｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ａｎｄ　２　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｔｅｓｔｅｄ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｅ　ｃｏｌｌｏｉｄａｌ　ｇｏｌｄ　ｍｅｔｈｏｄ。ａｎｄ　

ｗａｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ＰＮＢ／ＴＣＨ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅ　ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ　ｒａｔｅ　

ｏｆ　ｉｍｍｕｎｅ　ｃｏｌｌｏｉｄａｌ　ｇｏｌｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ＰＮＢ／ＴＣＨ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ　ｗａｓ　９５．９３％ａｎｄ　８７．０８％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，　

ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ　ｖａｌｕｅ（ＰＰＶ）ａｎｄ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ　ｖａｌｕｅ（ＮＰＶ）ｏｆ　ｉｍｍｕｎｅ　ｃｏｌｌｏｉｄａｌ　ｇｏｌｄ　ｍｅｔｈｏｄ　

ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　８８．４１％，９９．６４％，９９．１９％ａｎｄ　９４．５８％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｉｔ　ｃｏｓｔｓ　ＭＰＢ６４　ｉｍｍｕｎｅ　ｃｏｌｌｏｉｄａｌ　ｇｏｌｄ　ｍｅｔｈｏｄ　

１５　ｍｉｎｕｔｅｓ　ｔｏ　ｃａｒｒｙ　ｏｕｔ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ，ｌｅｓｓ　ｔｈａｎ　２８　ｄａｙｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ｍｅｔｈｏｄ，ａｓ　ｗｅｌｌ　ａｓ　３　ｄａｙｓ　ｏｆ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ．　

Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ＰＮＢ／ＴＣＨ　ｍｅｔｈｏｄ，ＭＰＢ６４　ｉｍｍｕｎｅ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｃｏｌｌｏｉｄａｌ　ｇｏｌｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｈａｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　

ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｉｎ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｙｅｏｂａｅｔｅｒｉｕｍ．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｉｍｍｕｎｅ　ｃｏｌｌｏｉｄａｌ　ｇｏｌｄ　ｍｅｔｈｏｄ；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ；Ｓｐｅｃｉｅｓ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　

我国是结核病高负担国家之一，患病人数基数　

大，结核病流行形势严峻。近年来，受气候、环　

４．９％，２０００年为１１．１％，已成为威胁人类健康的　

重要公共卫生问题¨　。　

ＮＴＭ感染患者的症状及病灶变化与结核分枝　

杆菌感染者非常相似，但两者治疗方法完全不同。　

ＮＴＭ菌株占分离菌株的比例有明显上升趋势，且　

ＮＴＭ总耐药率为９５．９％，耐多药（同时对利福平　

和异烟肼耐药）率为８３．７％…。非结核病若按结　

核病治疗，长期规则化疗但疗效不好。两者仅凭影　

像学和临床检查无法鉴别，需病原体鉴定才能鉴　

别。由此可见，分枝杆菌的培养和菌种鉴定对结核　

境、检测手段等因素影响，非结核分枝杆菌感染　

（Ｎｏｎ—ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，ＮＴＭ）呈快速　

增多趋势。２０００年全国结核病流行病学调查显示：　

ＮＴＭ感染率１９８４／１９８５年为４．２％，１９９０年为　

基金项目：浙江省卫生适宜技术成果转化计划（２０１５ＺＨＢ００１）　

作者简介：潘爱珍，硕士，主管技师，主要从事结核病检测工作　

通讯作者：潘爱珍，Ｅ—ｍａｉｌ：ａｚｈｐａｎ＠ｃｄｃ．ｚｊ．ｃｎ　

浙江预防医学２０１５年７月第２７卷第７期Ｚｈ￣ｉａｎｇ　Ｐｒｅｖ　Ｍｅｄ，Ｊｕ１．２０１５，Ｖｏｌ　２７，Ｎｏ．７　

２．２　ＰＣＲ扩增测序及序列比对分析４１８株临床　

分离菌株经ｈｓｐ６５　ＰＣＲ扩增反应，全部扩增产物均　

条带清晰、唯一条带，大小为４４０　ｂｐ左右，与预　

期片段大小一致。部分临床分离菌株ＰＣＲ产物凝　

胶电泳图谱见图２。序列同源性比对分析结果显示　

１３８株为结核分枝杆菌复合群，３株诺卡菌，２７７　

株为各类非结核分枝杆菌，见表１。　

ｏｏｏｂｐ　

１００ｂｐ　

注：Ｍ．１００　ｂｐ　ＤＮＡ　ｌａｄｄｅｒ；１为阳性对照Ｈ３７Ｒｖ；２～　

７为临床分离茵株；８为阴性对照　

图２　ｈｓｐ６５基因ＰＣＲ扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果　

表１　分枝杆菌菌种ＰＣＲ测序鉴定结果　

２．３　两种菌种鉴定方法比较ＰＮＢ／ＴＣＨ法和胶　

体金法与“金标准”测序法结果相比，一致率分　

别为８７．０８％和９５．９３％。胶体金法鉴定结核分枝　

杆菌敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分　

别为８８．４１％、９９．６４％、９９．１９％和９４．５８％，　

ＰＮＢ／ＴＣＨ法分别为６２．３２％、９９．２９％、９７．７２％和　

８４．２４％。检测时间：传统ＰＮＢ／ＴＣＨ法２８　ｄ，测　

序法３　ｄ，胶体金法１５　ｍｉｎ。　

表２两种菌种鉴定方法比较　

注：ａ表示含３株诺卡菌。　

３讨论　

现行的分枝杆菌菌种鉴定试验主要有传统的　

ＰＮＢ／ＴＣＨ改良罗氏法、免疫胶体金法或分子生物　

学法。目前，国内结核病实验室对培养获得的纯菌　

落进行菌种鉴定，大部分采用ＰＮＢ／ＴＣＨ培养基生　

长试验，将分枝杆菌初步分为结核复合群、牛结核　

分枝杆菌和非结核分枝杆菌，但耗时较长，需要　

２８　ｄ方能报告结果。常规免疫学诊断方法特异性　

低，分子生物学诊断方法需特殊仪器，对实验室环　

境和技术人员要求高，至少需要３　ｈ且操作复杂，　

在大部分基层实验室难以广泛开展。　

结核分枝杆菌分泌多于３３种不同蛋白＿４］，　

ＭＰＢ６４是其中一种，分子量２４　ｋＤａ，最初分离与　

ｂｏｖｉｓ　ＢＣＧ分枝杆菌过滤培养物中　ｊ。ＭＰＢ６４是结　

核菌复合群培养中分泌到菌体外的蛋白质，易被检　

出。其单克隆抗体结合免疫金标技术已应用到结核　

菌复合群的快速检测，且显示有诊断用途　］。　

本研究以测序为“金标准”，胶体金检测结核　

分枝杆菌有１６例假阴性，可能是菌株储存时间过　

久，浓度过低，个别菌悬液未漩涡充分或菌株缺少　

ＭＰＢ６４基因　Ｊ。传统ＰＮＢ／ＴＣＨ法鉴定结核分枝杆　

菌敏感度是６２．３２％，与胶体金法相比，传统鉴定　

方法将３６例结核分枝杆菌错判为非结核分枝杆菌，　

延误诊断治疗，使结核病患者未能及时规范治疗，　

多耐和耐多药现象严重。痰结核菌检查和传统培养　

法均不能有效区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆　

菌，其误报常导致抗结核治疗失败。本研究显示传　

・

６９４・　浙江预防医学２０１５年７月第２７卷第７期Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｐｒｅｙ　Ｍｅｄ，Ｊｕ１．２０１５，Ｖｏｌ　２７，Ｎｏ．７　

统ＰＮＢ／ＴＣＨ法和胶体金法鉴定分枝杆菌一致率分　

别是８７．０８％和９５．９３％，鉴定结核分枝杆菌敏感　

度和特异度分别是６２．３２％、９９．２９％、８８．４１％和　

９９．６４％，与国内外文献基本一致＿６　。然而本研　

究胶体金敏感度低于部分研究９９％［６，１１　，推测　

可能是不同的金标准选择，非结核分枝杆菌菌株所　

占比例大，菌株冰冻储存时间过久，菌悬液未漩涡　

充分。胶体金各项分析指标（敏感度、特异度、　

阳性预测值和阴性预测值）均高于ＰＮＢ／ＴＣＨ法，　

且胶体金检测所需时间为１５　ｍｉｎ，与测序法３　ｄ和　

传统法２８　ｄ比较，具有明显优势。因此，培养法　

结合基于ＭＰＢ６４的胶体金法对分枝杆菌的鉴定和　

区分非结核分枝杆菌具有快速、省时、经济、操作　

方便和无须大型仪器投入的优点，有望在结核病诊　

断中得以应用，是对现有结核病细菌学检查手段的　

有益补充。目前浙江省陆续推广液体培养检测系　

统，但其缺乏快速菌群鉴定方法，与其他同类产品　

如ＢＤ【１６］鉴定试纸条相比，价格低廉。　

此外，该方法整个操作是在安全柜内只需在测　

定板相应位置滴下待测样本就能进行，与其他方法　

比较，菌体向周围飞散可以控制在最小程度，且　

ＭＰＢ６４免疫胶体金法特别适合液体培养物的直接　

快速鉴定，只需取培养上清液滴加到测定板上，不　

需制备菌悬液，因而降低了操作中结核杆菌感染的　

风险。将这种特异性强、敏感度高、快速简便且经　

济的结核病细菌学检查方法向基层医院推广，能极　

大提高结核病和ＮＴＭ病早期诊断水平，减少过诊　

率和误诊率，从而提高结核病预防控制工作水平。　

参考文献　

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病流行病学抽样调查报告［Ｊ］．中国防痨杂志，２００２，２４　

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［２］Ｔｈｏｍｓｏｎ　ＲＭ．ＮＴＭ　ｗｏｒｋｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ　ａｔ　Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ　ＴＢ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　

Ｃｅｎ￣ｅ　ａｎｄ　Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｌａ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．　

Ｃｈａｎｇｉｎｇ　ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ　ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ　

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国教育文化出版社，２００６．　

［４］Ｃｏｌｅ　ＳＴ，Ｂｒｏｓｃｈ　Ｒ，Ｐａｒｋｈｉｌｌ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｃｉｐｈｅｉｒｎｇ　ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　

Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　

［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９３（６６８５）：５３７—５４４．　

［５］　Ｙａｍａｇｕｃｈｉ　Ｒ，Ｍａｔｓｕｏ　Ｋ，Ｙａｍａｚａｋｉ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　

ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｆｏｒ　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＭＰＢ６４　ｏｆ　

Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ　ＢＣＧ［Ｊ］．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９８９，　

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［６］Ｍｕｙｏｙｅｔａ　Ｍ，ｄｅ　Ｈａａｓ　Ｐ　ＥＷ，Ｍｕｅｌｌｅｒ　ＤＨ，ｅｔ　ａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　

ｔｈｅ　Ｃａｐｉｌｉａ　ＴＢ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｅｔｅｒｉｕｍ　

ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｉｆｎｅｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｚａｍｂｉａ　ａｎｄ　Ｓｏｕｔｈ　Ａｆｉｒｃａ［Ｊ］．Ｊｏｕｍａｌ　ｏｆ　

ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１０，４８（１０）：３７７３—３７７５．　

［７］Ｍｕｃｈｗａ　Ｃ，Ａｋｏｌ　Ｊ，Ｅｔｗｏｍ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｐｉｌｉａ　ＴＢ　

ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｒａｐｉｄ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　

ｃｏｍｐｌｅｘ　ｉｎ　ＢＡＣＴＥＣ　ＭＧ１Ｔ　９６０　ａｎｄ　ＢＡＣＴＥＣ　９１２０　ｂｌｏｏｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　

［Ｊ］．ＢＭＣ　ｒｅｓｅａｌ￣ｈ　ｎｏｔｅｓ，２０１２，５（１）：４４．　

［８］　Ｍｕｙｏｙｅｔａ　Ｍ，Ｍｗａｎｚａ　ＷＣ，Ｋａｓｅｓｅ　Ｎ，ｅｔ　ａ１．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，　

Ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ，ａｎｄ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃａｐｉｌｉａ　ＴＢ—Ｎｅｏ　Ａｓｓａｙ　

［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３，５１（１２）：４２３７—　

４２３９．　

［９］Ｈｉｒｎａｏ　Ｋ，Ａｏｎｏ　Ａ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　

ＩＳ６１　１０　Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ　Ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ＭＰＢ６４　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　

Ｃａｐｉｌｉａ　ＴＢ—ＮｅｇａｔｉｖｅＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　Ｉｓｏｌａｔｅｓ［Ｊ］．　

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００４，４２（１）：３９０—３９２．　

［１０］Ｈｉｌｌｅｍａｎｎ　Ｄ，Ｒａｓｃｈ—Ｇｅｒｄｅｓ　Ｓ，Ｒｉｃｈｔｅｒ　Ｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　

Ｃａｐｉｌｉａ　ＴＢ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　

ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　Ｓｈｏｒｔ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｔｈｅ　

Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｌｕｎｇ　Ｄｉｓｅａｓｅ，２００５，９　

（１２）：１４０９—１４１１．　

［１１］孙雪娟，陈忠秀，胡旭，等．ＭＰＢ６４特异性抗原检测在结核病　

临床快速诊断中的应用价值［Ｊ］．中国实验诊断学，２０１１，　

１５（１２）：２０９４—２０９５．　

［１２］沈建山，张丽水，黄明翔．应用ＭＰＢ６４抗原检测快速鉴定结　

核分枝杆菌的研究［Ｊ］．检验医学与ｌ临床，２０１２，９（１５）：　

ｌ８８１—１８８２．　

［１３］Ｐａｒｋ　ＭＹ，Ｋｉｍ　ＹＪ，Ｈｗａｎｇ　ＳＨ，ｅｔ　ａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　

ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｅ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ　ｆｏｒ　ｒａｐｉｄ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　

Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｉｎ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｉｓｏｌａｔｅｓ［Ｊ］．　

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，４７（２）：４８１—４８４．　

［１４］Ｋｕｍａｒ　ＶＧＳ，Ｕｒｓ　ＴＡ，Ｒａｎｇａｎａｔｈ　ＲＲ［Ｊ］．ＭＰＴ　６４　Ａｎｔｉｇｅｎ　

ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆｒ　Ｒａｐｉｄ　ｃｏｎｆｉｍｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｉｓｏｌａｔｅｓ［Ｊ］．　

ＢＭＣ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｎｏｔｅｓ，２０１１（４）：７９．　

［１５］Ｋａｎａｄｅ　Ｓ，Ｎａｔａｒａｊ　Ｇ，Ｓｕｒｙａｗａｎｓｈｉ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｕｔｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ＭＰＴ　６４　

ａｎｔｉｇｅｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｒａｐｉｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　

ａ　ｒｅｓｏｕｒｃｅ　ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ　ｓｅｔｔｉｎｇ［Ｊ］．Ｉｎｄｉａｎ　Ｊ　Ｔｕｂｅｒｃ，２０１２，５９　

’　（２）：９２—９６．　

［１６］Ｙｕ　ＭＣ，Ｃｈｅｎ　ＨＹ，Ｗｕ　ＭＨ，ｅｔ　ａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆｔｈｅ　ｒａｐｉｄ　ＭＧＩＴ　

ＴＢｃ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ　ｆｏｒ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｉｆｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　

ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｓｔｒａｉｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｅｂｉｏ１．　

２０１１，４９（３）：８０２—８０７．　

收稿日期：２０１４—０４—０４修回１３期：２０１４—０８—０６本文编辑：陈丹　

2024年11月2日发(作者：闻嘉佑)

浙江预防医学２０１５年７月第２７卷第７期Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｐｒｅｖ　Ｍｅｄ，Ｊｕ１．２０１５，Ｖｏｌ　２７，Ｎｏ．７　・６９１・　

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论著・　

ＭＰＢ６４免疫胶体金检测法在　

分枝杆菌菌种鉴定中的应用　

潘爱珍，吴蓓蓓，柳正卫，郑琳，王晓萌　

浙江省疾病预防控制中心，浙江杭州

摘要：目的

３１００５１　

以ＰＣＲ扩增测序法　评价ＭＰＢ６４免疫胶体金快速检测法在分枝杆菌菌种鉴定中的应用价值。方法

为“金标准”，对ＭＰＢ６４免疫胶体金法和传统ＰＮＢ／ＴＣＨ法对２种分枝杆菌标准菌株和４１８株临床分枝杆菌分离　

株的菌种鉴定能力作比较。结果胶体金法、ＰＮＢ／ＴＣＨ法与ＰＣＲ测序法结果一致率分别是９５．９３％和８７．０８％，　

胶体金法鉴定结核分枝杆菌敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别８８．４１％、９９．６４％、９９．１９％和　

９４．５８％。而ＰＮＢ／ＴＣＨ法为６２．３２％、９９．２９％、９７．７２％和８４．２４％。胶体金法１５　ｍｉｎ即可作出鉴定结果，较传　

统的ＰＮＢ／ＴＣＨ法提前了２８　ｄ，比测序法提前３　ｄ。结论

关键词：免疫胶体金法；分枝杆菌；菌种鉴定　

中图分类号：Ｒ４４６．６　文献标识码：Ａ　文章编号：１００７—０９３１（２０１５）０７—０６９１—０４　

与ＰＮＢ／ＴＣＨ法相比，ＭＰＢ６４免疫胶体金法在分枝杆菌　

菌种鉴定中，具有较高的特异度和灵敏度，且方法简便、快速，适合基层推广应用。　

Ａ　ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＰＢ６４　ａｎｔｉｇｅｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　

ｉｍｍｕｎｅ　ｃｏｌｌｏｉｄａｌ　ｇｏｌｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　

ＰＡＮ　Ａｉ—ｚｈｅｎ，ＷＵ　Ｂｅｉ—ｂｅｉ，ＬＩＵ　Ｚｈｅｎｇ—ｗｅｉ，ＺＨＥＮＧ　Ｌｉｎ，ＷＡＮＧ　Ｘｉａｏ—ｍｅｎｇ　

Ｔｈｅ　Ｃｅｎｔｅｒｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｆＺｈｅｊｉａｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，３１００５１，Ｃｈｉｎａ　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｋｎｏｗ　ｔｈｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＰＢ６４　ａｎｔｉｇｅｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｅ　ｃｏｌｌｏｉｄａｌ　ｇｏｌｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　

ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔａｋｉｎｇ　ｔｈｅ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｉｆｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ｇｏｌｄ　ｓｔａｎｄａｒｄ．ａ　ｔｏｔａｌ　ｏｆ　

４１８　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｍｙｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ａｎｄ　２　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｔｅｓｔｅｄ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｅ　ｃｏｌｌｏｉｄａｌ　ｇｏｌｄ　ｍｅｔｈｏｄ。ａｎｄ　

ｗａｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ＰＮＢ／ＴＣＨ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅ　ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ　ｒａｔｅ　

ｏｆ　ｉｍｍｕｎｅ　ｃｏｌｌｏｉｄａｌ　ｇｏｌｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ＰＮＢ／ＴＣＨ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ　ｗａｓ　９５．９３％ａｎｄ　８７．０８％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，　

ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ　ｖａｌｕｅ（ＰＰＶ）ａｎｄ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ　ｖａｌｕｅ（ＮＰＶ）ｏｆ　ｉｍｍｕｎｅ　ｃｏｌｌｏｉｄａｌ　ｇｏｌｄ　ｍｅｔｈｏｄ　

ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　８８．４１％，９９．６４％，９９．１９％ａｎｄ　９４．５８％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｉｔ　ｃｏｓｔｓ　ＭＰＢ６４　ｉｍｍｕｎｅ　ｃｏｌｌｏｉｄａｌ　ｇｏｌｄ　ｍｅｔｈｏｄ　

１５　ｍｉｎｕｔｅｓ　ｔｏ　ｃａｒｒｙ　ｏｕｔ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ，ｌｅｓｓ　ｔｈａｎ　２８　ｄａｙｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ｍｅｔｈｏｄ，ａｓ　ｗｅｌｌ　ａｓ　３　ｄａｙｓ　ｏｆ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ．　

Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ＰＮＢ／ＴＣＨ　ｍｅｔｈｏｄ，ＭＰＢ６４　ｉｍｍｕｎｅ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｃｏｌｌｏｉｄａｌ　ｇｏｌｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｈａｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　

ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｉｎ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｙｅｏｂａｅｔｅｒｉｕｍ．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｉｍｍｕｎｅ　ｃｏｌｌｏｉｄａｌ　ｇｏｌｄ　ｍｅｔｈｏｄ；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ；Ｓｐｅｃｉｅｓ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　

我国是结核病高负担国家之一，患病人数基数　

大，结核病流行形势严峻。近年来，受气候、环　

４．９％，２０００年为１１．１％，已成为威胁人类健康的　

重要公共卫生问题¨　。　

ＮＴＭ感染患者的症状及病灶变化与结核分枝　

杆菌感染者非常相似，但两者治疗方法完全不同。　

ＮＴＭ菌株占分离菌株的比例有明显上升趋势，且　

ＮＴＭ总耐药率为９５．９％，耐多药（同时对利福平　

和异烟肼耐药）率为８３．７％…。非结核病若按结　

核病治疗，长期规则化疗但疗效不好。两者仅凭影　

像学和临床检查无法鉴别，需病原体鉴定才能鉴　

别。由此可见，分枝杆菌的培养和菌种鉴定对结核　

境、检测手段等因素影响，非结核分枝杆菌感染　

（Ｎｏｎ—ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，ＮＴＭ）呈快速　

增多趋势。２０００年全国结核病流行病学调查显示：　

ＮＴＭ感染率１９８４／１９８５年为４．２％，１９９０年为　

基金项目：浙江省卫生适宜技术成果转化计划（２０１５ＺＨＢ００１）　

作者简介：潘爱珍，硕士，主管技师，主要从事结核病检测工作　

通讯作者：潘爱珍，Ｅ—ｍａｉｌ：ａｚｈｐａｎ＠ｃｄｃ．ｚｊ．ｃｎ　

浙江预防医学２０１５年７月第２７卷第７期Ｚｈ￣ｉａｎｇ　Ｐｒｅｖ　Ｍｅｄ，Ｊｕ１．２０１５，Ｖｏｌ　２７，Ｎｏ．７　

２．２　ＰＣＲ扩增测序及序列比对分析４１８株临床　

分离菌株经ｈｓｐ６５　ＰＣＲ扩增反应，全部扩增产物均　

条带清晰、唯一条带，大小为４４０　ｂｐ左右，与预　

期片段大小一致。部分临床分离菌株ＰＣＲ产物凝　

胶电泳图谱见图２。序列同源性比对分析结果显示　

１３８株为结核分枝杆菌复合群，３株诺卡菌，２７７　

株为各类非结核分枝杆菌，见表１。　

ｏｏｏｂｐ　

１００ｂｐ　

注：Ｍ．１００　ｂｐ　ＤＮＡ　ｌａｄｄｅｒ；１为阳性对照Ｈ３７Ｒｖ；２～　

７为临床分离茵株；８为阴性对照　

图２　ｈｓｐ６５基因ＰＣＲ扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果　

表１　分枝杆菌菌种ＰＣＲ测序鉴定结果　

２．３　两种菌种鉴定方法比较ＰＮＢ／ＴＣＨ法和胶　

体金法与“金标准”测序法结果相比，一致率分　

别为８７．０８％和９５．９３％。胶体金法鉴定结核分枝　

杆菌敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分　

别为８８．４１％、９９．６４％、９９．１９％和９４．５８％，　

ＰＮＢ／ＴＣＨ法分别为６２．３２％、９９．２９％、９７．７２％和　

８４．２４％。检测时间：传统ＰＮＢ／ＴＣＨ法２８　ｄ，测　

序法３　ｄ，胶体金法１５　ｍｉｎ。　

表２两种菌种鉴定方法比较　

注：ａ表示含３株诺卡菌。　

３讨论　

现行的分枝杆菌菌种鉴定试验主要有传统的　

ＰＮＢ／ＴＣＨ改良罗氏法、免疫胶体金法或分子生物　

学法。目前，国内结核病实验室对培养获得的纯菌　

落进行菌种鉴定，大部分采用ＰＮＢ／ＴＣＨ培养基生　

长试验，将分枝杆菌初步分为结核复合群、牛结核　

分枝杆菌和非结核分枝杆菌，但耗时较长，需要　

２８　ｄ方能报告结果。常规免疫学诊断方法特异性　

低，分子生物学诊断方法需特殊仪器，对实验室环　

境和技术人员要求高，至少需要３　ｈ且操作复杂，　

在大部分基层实验室难以广泛开展。　

结核分枝杆菌分泌多于３３种不同蛋白＿４］，　

ＭＰＢ６４是其中一种，分子量２４　ｋＤａ，最初分离与　

ｂｏｖｉｓ　ＢＣＧ分枝杆菌过滤培养物中　ｊ。ＭＰＢ６４是结　

核菌复合群培养中分泌到菌体外的蛋白质，易被检　

出。其单克隆抗体结合免疫金标技术已应用到结核　

菌复合群的快速检测，且显示有诊断用途　］。　

本研究以测序为“金标准”，胶体金检测结核　

分枝杆菌有１６例假阴性，可能是菌株储存时间过　

久，浓度过低，个别菌悬液未漩涡充分或菌株缺少　

ＭＰＢ６４基因　Ｊ。传统ＰＮＢ／ＴＣＨ法鉴定结核分枝杆　

菌敏感度是６２．３２％，与胶体金法相比，传统鉴定　

方法将３６例结核分枝杆菌错判为非结核分枝杆菌，　

延误诊断治疗，使结核病患者未能及时规范治疗，　

多耐和耐多药现象严重。痰结核菌检查和传统培养　

法均不能有效区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆　

菌，其误报常导致抗结核治疗失败。本研究显示传　

・

６９４・　浙江预防医学２０１５年７月第２７卷第７期Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｐｒｅｙ　Ｍｅｄ，Ｊｕ１．２０１５，Ｖｏｌ　２７，Ｎｏ．７　

统ＰＮＢ／ＴＣＨ法和胶体金法鉴定分枝杆菌一致率分　

别是８７．０８％和９５．９３％，鉴定结核分枝杆菌敏感　

度和特异度分别是６２．３２％、９９．２９％、８８．４１％和　

９９．６４％，与国内外文献基本一致＿６　。然而本研　

究胶体金敏感度低于部分研究９９％［６，１１　，推测　

可能是不同的金标准选择，非结核分枝杆菌菌株所　

占比例大，菌株冰冻储存时间过久，菌悬液未漩涡　

充分。胶体金各项分析指标（敏感度、特异度、　

阳性预测值和阴性预测值）均高于ＰＮＢ／ＴＣＨ法，　

且胶体金检测所需时间为１５　ｍｉｎ，与测序法３　ｄ和　

传统法２８　ｄ比较，具有明显优势。因此，培养法　

结合基于ＭＰＢ６４的胶体金法对分枝杆菌的鉴定和　

区分非结核分枝杆菌具有快速、省时、经济、操作　

方便和无须大型仪器投入的优点，有望在结核病诊　

断中得以应用，是对现有结核病细菌学检查手段的　

有益补充。目前浙江省陆续推广液体培养检测系　

统，但其缺乏快速菌群鉴定方法，与其他同类产品　

如ＢＤ【１６］鉴定试纸条相比，价格低廉。　

此外，该方法整个操作是在安全柜内只需在测　

定板相应位置滴下待测样本就能进行，与其他方法　

比较，菌体向周围飞散可以控制在最小程度，且　

ＭＰＢ６４免疫胶体金法特别适合液体培养物的直接　

快速鉴定，只需取培养上清液滴加到测定板上，不　

需制备菌悬液，因而降低了操作中结核杆菌感染的　

风险。将这种特异性强、敏感度高、快速简便且经　

济的结核病细菌学检查方法向基层医院推广，能极　

大提高结核病和ＮＴＭ病早期诊断水平，减少过诊　

率和误诊率，从而提高结核病预防控制工作水平。　

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ｃｏｍｐｌｅｘ　ｉｎ　ＢＡＣＴＥＣ　ＭＧ１Ｔ　９６０　ａｎｄ　ＢＡＣＴＥＣ　９１２０　ｂｌｏｏｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　

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［１６］Ｙｕ　ＭＣ，Ｃｈｅｎ　ＨＹ，Ｗｕ　ＭＨ，ｅｔ　ａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆｔｈｅ　ｒａｐｉｄ　ＭＧＩＴ　

ＴＢｃ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ　ｆｏｒ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｉｆｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　

ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｓｔｒａｉｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｅｂｉｏ１．　

２０１１，４９（３）：８０２—８０７．　

收稿日期：２０１４—０４—０４修回１３期：２０１４—０８—０６本文编辑：陈丹