基于高通量测序技术筛选低温秸秆降解菌群的研究-USB迷|专注于互联网分享

2024年3月17日发(作者：冼听云)

AGRIC,UNIV.（NaturalScienceEdition）

学报（自然科学版）

2021，41（6）

075

何志刚，刘慧屿，刘艳，等.基于高通量测序技术筛选低温秸秆降解菌群的研究［J］.山西农业大学学报（自然科学版），2021，

41（6）：75-84.

HeZG，LiuHY，LiuY，inglowtemperaturestrawdegradationbacteriausinghigh-throughputsequencingtechnol‑

ogy［J］.JournalofShanxiAgriculturalUniversity（NaturalScienceEdition），2021，41（6）：75-84.

doi：10.13842/1671-8151.202106029

04069

基于高通量测序技术筛选低温秸秆降解菌群的研究

何志刚，刘慧屿，刘艳，隽英华，王秀娟，董环，韩瑛祚

（辽宁省农业科学院植物营养与环境资源研究所，辽宁沈阳110161）

摘要：［目的］本文旨在筛选低温（10℃）高效的玉米秸秆降解菌群。［方法］采集不同低温菌源的样品，进行低温

（10℃）连续富集继代（10代）培养，利用第二代高通量测序方法分析不同处理的细菌群落结构和数量，并测定不同世

代的纤维素酶、秸秆失重率等数据。［结果］筛选获得一组高效稳定分解玉米秸秆的复合菌群SLX。该菌群在15d内

产生复合纤维素酶系，对玉米秸秆的分解率达到58.97%。第二代高通量测序技术结果表明不同菌源来源是菌群分

类的主要依据，复合菌群SLX主要含有酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和芽单胞菌门（Gemmati‑

monadetes）的微生物菌株，种分类上，unculturedAcidobacteriaceae

，

unculturedSphingomonas等为优势菌株。外切β‑

葡聚糖酶（C1）与α‑变形菌纲（Deltaproteobacteria）、β‑葡萄糖苷酶（BG）与β‑变形菌纲（Betaproteobacteria）表现正相关；

内切β‑葡聚糖酶（CMCase）和滤纸酶（FPA）位于第二象限，与酸杆菌门（Acidobacteria）表现正相关，可以解释微生物

群落结构总变异的34.15%，菌群通过菌种之间的协同作用，共同维持了体系的稳定。固体发酵培养实验结果显示：

麦麸∶秸秆粉的比例为7∶3时为最佳配比，水料比的最佳比例为1∶1时，接种量的最佳值为5％。［结论］研究结果为明

确低温秸秆降解菌群降解机理和提高纤维素降解效率提供了理论基础。

关键词：复合菌群；玉米秸秆；微生物多样性；高通量测序技术

中图分类号：S141.4文献标识码：A文章编号：1671-8151（2021）06-0075-10

玉米秸秆是极为丰富且能直接利用的可再生

有机资源。作物秸秆的循环利用是农业有机生产

中最经济的，对保持和提高土壤肥力以及农业的

2］

可持续发展均有重要作用

［1，

。秸秆含有丰富的有

响翌年作物播种和生长，已成为制约辽宁省玉米

可持续发展的关键瓶颈问题。

有学者认为在满足温度条件下，秸秆还田可

以明显增加土壤微生物群落的多样性，微生物群

落多样性影响秸秆在土壤中的分解速度

［9~12］

，在通

常情况下，秸秆给土壤微生物繁殖提供养分，促进

微生物的生长，并提高土壤中微生物的活性

［13］

。

作物秸秆中的纤维素、木质素和半纤维素、蛋白质

等物质在土壤中腐解和发酵后转化成土壤有机

质

［14］

，能减缓土壤有机质的下降。为了解决东北

地区秸秆不易腐解的问题，有研究者采用秸秆还

田时加入腐熟剂，加快秸秆降解和养分释放，缓解

16］

秸秆未腐解的负面影响

［15，

，但由于菌种对生存环

机碳和大量的氮、磷、钾、硅等矿质营养元素

［3］

，将

其还田能够改善土壤结构

［4］

，提高土壤养分含量，

维持作物稳产、高产

［5］

，优化农田生态环境，是一种

7］

促进土壤有机质积累

［6，

、调节土壤温度和水分

［8］

的农艺措施。辽宁省是我国北方重要粮食主产

区，大量玉米秸秆无处安放，如何将秸秆高效、无

害化归还到农田土壤中，是现代农业急需解决的

问题。秸秆进入农业循环生产，不仅可以达到充

分利用其中养分资源的目的，还可以增加土壤碳

库储量，减少二氧化碳排放。随着农业机械化发

展，辽宁地区玉米秸秆还田规模越来越大，但由于

秋冬季节温度过低，秸秆进入土壤后不易腐解，影

境要求高，导致稳定性不高、定殖存活效率低以及

18］

与土著微生物群落竞争生态位等问题

［17，

，限制了

推广应用。有学者研究表明，受大田环境因素与

收稿日期：

2021

‑

修回日期：

2021

‑

基金项目：国家重点研发计划（2017YFD0300700）-A07A；辽宁省兴辽英才计划（XLYC1807221）

作者简介：何志刚（1978-），男，副研究员，硕士，研究方向：土壤培肥地力提升。E-mail：*********************

山西农业大学学报（自然科学版）2021

所产纤维素酶的影响，单一微生物菌株很难高效

降解秸秆类物质，利用微生物间的协同共生作用

将多种纤维素降解菌混合培养，其产酶具有多样

性，且有利于提高秸秆类物质的转化率

［19］

。近年

来，刘心吾等

［20］

报道通过筛选耐高温木质纤维素

降解菌株达到降解秸秆的效果；李雯等

［21］

研究了

不同纤维素降解菌对玉米秸秆的降解效果。目

前，对于纤维素降解菌的研究主要集中在中高温

菌株及常温菌株，对低温降解细菌菌群的研究较

少，但低温条件进行富集筛选具有高效、成本低等

优点

［22，23］

。直接筛选组合驯化获得的复合菌系群

落结构容易受环境条件影响

［24］

，且缺少对获得的

复合菌系在玉米秸秆降解过程中协同降解的微生

表1

Table1

编号

Number

SLA

SLW

SLX

SLZ

采集来源

Sourceofsamples

农田土壤、十年以上玉米连作

土、秸秆还田玉米田耕层土壤

土壤

叶（腐殖质）、松树森林土

叶、槐树森林土

采样地点

Samplingposition

物群落变化研究。因此，针对北方寒凉地区玉米

秸秆还田关键瓶颈问题，为获得低温高效降解玉

米秸秆的复合菌群，本试验进行了玉米秸秆低温

降解菌群的富集培养、纤维素酶测定、秸秆失重试

验及其微生物群落多样性分析，以期为秸秆综合

利用提供试验理论依据。

1.1

材料与方法

样品采集

于辽宁省冬季广泛采集低温环境下菌源样

品，如玉米田耕层冻土、林下土等，采集后−20℃

冰箱保存。

菌源样品来源

Sourceofsamples

采样经纬度

Samplinglongitudeand

latitude

E123°35'；N42°21'

E123°60'；N42°36'

E128°19'；N41°41'

E123°70'；N41°90'

采样温度/℃

Sampling

temperature

海拔/m

Altitude

165

154

827

254

辽宁省北部铁岭市蔡牛镇张庄村

冬季常年堆积玉米秸秆垛下辽宁省北部铁岭市蔡牛镇张庄玉

米合作社养殖场

长白山旅游风景区

旅游风景区

长白山冬季森林腐殖土、腐烂吉林省延边朝鲜族自治州安图县

棋盘山冬季林下殖土、腐烂辽宁省沈阳市浑南区棋盘山国际

1.2

1.2.1

方法

菌群的筛选

（3）玉米秸秆失重率的测定

发酵前称量添加干玉米秸秆的质量，发酵结

束后，发酵剩余物8000r·min

-1

离心10min，弃去

上清液，然后用去离子水洗2次，收集沉淀物于

105℃烘干至恒重，测定玉米秸秆失重计算秸秆降

解率，以不接菌处理作为对照，设置3个重复

［25］

。

（4）纤维素酶活性的测定

采用DNS法见

［25］

测定传代最后一代培养液的

不同纤维素酶活性［以纤维素类物质（滤纸、羧甲

基纤维素、脱脂棉、水杨苷）为底物测定降解能力，

其中以滤纸为底物的滤纸酶活性（FPA）、羧甲基

纤维素为底物的内切-1，4-β-葡聚糖酶活性

（CMCase）、脱脂棉为底物的外切-1，4-β-葡聚糖

酶酶活性（C1）、水杨苷为底物的β-葡萄糖苷酶活

性（BG）］。

1.3微生物菌群测定

微生物总DNA的提取采用DNA提取试剂盒

（1）富集培养基

每一代富集培养均采用赫奇逊富集培养基：

1.0g，NaCl0.1g，FeCl

·6H

O0.01g，

MgSO

·7H

O0.3g，NaNO

2.5g，CaCl

·6H

0.1g，蒸馏水1000mL，玉米秸秆1.0g。秸秆预

处理：蒸馏水浸泡过夜，去除可溶性糖，冲洗数次，

50~60℃烘干备用。

（2）传代培养

取样品5g加入装有50mL无菌水的150mL

三角瓶中，120r·min震荡30min，吸取悬浊液1

mL于盛有富集培养基的三角瓶中，以15d为周期

（10℃）培养箱中震荡120r·min培养，每15d按

5%（V/V）接种量接种到新的富集培养基中，连续

传代10次。

-1

41（6）

何志刚等：基于高通量测序技术筛选低温秸秆降解菌群的研究

（PowerSoil®DNAIsolationKit），提取微生物总

DNA。所提取的总DNA纯度和浓度用核酸定量

仪（NanoDropND-1000）检测。各样品纯化后

DNA送至北京百迈客公司应用Illumina平台的

HiSeq进行测序，分别测定细菌群落。方法见参考

文献

［26~28］

。

1.4固体发酵培养正交实验

为确定SLX菌系固体培养基的最佳配方，将

麦麸：秸秆粉、水料比、接种量作为三因素三水平

正交表设计试验，试验设计方案见表2。

表2

Table2

水平

Level

分析结果使用Canoco5.0软件制图，其余常规数据

采用Excel进行整理分析作图，采用SPSS19.6软

件进行相关分析，采用Duncan法，显著水平0.05。

2.1

结果与分析

富集菌群的分解玉米秸秆效果

4个处理进行富集培养传代10次后，均由培养

开始的淡黄色转为培养结束时的棕褐色；絮状物

析出明显（图1），呈现为随着世代的延长，秸秆降

解率增长的现象。在最后一个传代周期内，如表3

所示，不同处理SLA、SLW、SLX、SLZ的秸秆失重

率分别达到38.00%、41.33%、58.97%、50.10%，

分别比2代培养提高了30%、31.33%、40.97%、

30.77%。如表4所示，不同处理纤维素酶活性表

现结果：FPA酶：SLX>SLZ>SLW>SLA，其中

SLX处理比与SLA、SLW提高了6.97、5.06U·

-1

，差异显著（P<0.05）；CMC酶：SLZ>SLX>

SLW>SLA，SLZ处理比与SLA、SLW提高了

7.49、6.02U·mL

-1

，差异显著（P<0.05）；C1酶：SL

X>SLZ>SLW>SLA其中SLX处理比与SLA、

SLW提高了4.82、4.64U·mL

-1

，差异显著（P<

0.05）；BG酶：SLZ>SLW>SLX>SLA，处理间

差异不显著。分析其中原因：由于富集培养会使

某些特定的微生物菌株大量累积，4个处理的菌源

来源不同，导致富集后存在的菌种也存在差异，从

不同酶活性变现差异可以看到，SLX和SLZ处理

的酶活性均高于另外2个样品，说明这2个样品中

存在的微生物群落更加容易降解玉米秸秆，SLA

是采集玉米耕层冻土，从表3中观察也具有一定玉

米秸秆分解能力，但是由于土壤中的菌群降解能

力有限，在所有处理中效果最差，也从另一个角度

固体培养正交试验设计

Thedesignofsoilorthogonalexperiment

水料比

Water∶Solid

3∶1

2∶1

1∶1

接种量/%

Inoculation

麦麸∶秸秆粉

Wheatbran∶Straw

powder

7∶3

1∶1

3∶7

1.5数据分析

根据微生物种群测序结果的Barcode序列和

PCR扩增引物序列，从下机数据中拆分出各样品

数据，使用Flash软件对每个样品的数据进行拼

接，得到高通量测序原始数据。进一步去除嵌合

体、两端引物以及非靶区域序列后得到有效数据，

明确OTU

（

OperationalTaxonomicUnits）为研究

中的最小分类单元；然后用综合考虑物种多样性

及丰度的weightedunifrac法进行UPGMA（Un‑

weightedPairGroupMethodwithArithmetic

means）聚类分析；使用UniFrac软件中jackknifed

算法进行样本之间的距离计算，将细菌高通量测

序得出的细菌丰度指数、多样性指数作细菌矩阵。

a初代培养，b传代10代培养

a，Firstculture；b，Lastgenerationculture

图1

Fig.1

不同处理富集传代培养结果

Enrichmentsubcultureindifferenttreatments

山西农业大学学报（自然科学版）2021

说明北方地区玉米秸秆还田，存在很大难度。通

过观察低温继代培养过程中的变化，4个菌系均具

有良好的玉米秸秆降解和纤维素酶活性，具有稳

表3

Table3

定的分解功能。其中筛选的复合菌群SLX的玉米

秸秆降解率显著高于其他复合菌群，说明复合菌

群SLX具有更高的秸秆降解活性及低温优越性。

不同处理分解玉米秸秆降解率

单位：%Degradationrate（DR）ofcornstalkdecomposedbydifferenttreatment

玉米秸秆降解率

CornstrawDR

处理

Sample

SLA

SLW

SLX

SLZ

2代

Secondgeneration

8.00±2.00b

10.00±2.00b

18.00±2.00a

19.33±3.06a

4代

Fourthgeneration

18.67±3.06b

18.00±2.00b

26.67±3.06a

26.00±2.00a

6代

Sixthgeneration

28.00±2.00b

28.67±4.16b

41.33±3.06a

40.00±2.00a

8代

Eighthgeneration

33.33±1.15b

30.00±2.00b

44.00±4.00a

48.00±4.00a

10代

Tenthgeneration

38.00±2.00c

41.33±1.15c

58.97±4.00a

50.10±2.00b

注：不同小写字母表示不同处理间差异显著（P<0.05），下同

Note：easbelow

表4

Table4

不同处理纤维素酶活性变化

单位：U·mL

-1

Changesincellulaseactivityindifferenttreatments

SLZ细菌群落多样性指数和均匀度指数均很高，

说明这两个处理的菌群丰富度较高；处理SLX和

SLZ；SLW和SLA分别两样本的Shannon指数接

近，表示二者之间菌群落结构类似，进一步对比

分析。

表5

Table5

处理

Sam‑

ple

SLA

SLW

SLX

SLZ

处理

Sam‑

ple

SLA

SLX

SLZ

FPA酶

FPA

CMC酶

CMCase

C1酶

C1enzyme

0.42±0.26b

BG酶

BGenzyme

0.60±0.13a2.36±0.59b3.65±0.68b

9.33±1.40a

细菌群落多样性指数分析

SLW4.27±0.38b5.12±0.74b0.60±0.48b1.82±1.02a

10.48±2.03ab5.24±0.68a1.03±1.24a

5.26±4.17ab11.14±5.93a3.64±2.09a2.38±0.06a

AnalysisofBacterialCommunityDiversityIndex

操作分类单元/个

OTU

1038.33±37.31b

1056.33±52.79b

1140.33±6.66a

1144.67±19.86a

Ace指数

Aceindex

1111.11±41.40c

1118.02±29.43bc

1164.14±6.67ab

1169.91±12.23a

Shannon指数

Shannondi‑

versityindex

7.84±0.02b

7.67±0.17b

8.33±0.16a

8.20±0.09a

2.2

2.2.1

微生物群落多样性指数分析

细菌多样性指数分析

在微生物生态学研究中，OTU（operational

taxonomicunits）是将基因序列相似性接近97%的

定义为一个OTU；EffectiveTags为原始序列过滤

后得到的优化序列数再过滤嵌合体后的有效序列

数；本研究对不同处理细菌16SrRNA基因序列进

行了高通量测序，删除掉低质量序列后，共得到有

效序列量318356条，测序平均获得62348.5有效

片段，被聚类为1094.9个OTU，平均长度41475

bp。微生物群落的均匀度指数（Ace）和多样性指

数（Shannon）表5中可见，处理SLX和SLZ的

OTU数量达到1140.3和1144.7，均高于SLW和

SLA，差异达到显著水平；SLX和SLZ的Ace指数

达到1164.1和1169.9，均高于SLW和SLA；

SLX和SLZ的Shannon指数达到8.33和8.2，均高

于SLW和SLA，差异达到显著水平，处理SLX和

通过Venn图（图2）分析了4个处理细菌共有

的优势属（相对丰度>1%）的数量及特有的优势

属，4个处理优势属共有4378个，整体的优势菌属

排序：SLX>SLZ>SLW>SLA，3个处理中均有

分布的优势种属有1138个；SLX处理中优势属的

种类最多，为1210个；SLA处理中优势属的种类

最少，为1171个。从表5和图2中可见，SLX处理

中富集了更多的参与秸秆降解的微生物，菌种组

成多样性较高，菌群结构更加丰富。

2.2.2细菌群落组成分析

从图3中可以观察到，4个处理中丰度较高的

主要类群有：变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门

（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、芽单

41（6）

何志刚等：基于高通量测序技术筛选低温秸秆降解菌群的研究

胞菌门（Gemmatimonadetes）、疣微菌门（Verruco‑

SLX

SLA

SLZ

SLW

microbia）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bac‑

teroidetes）、浮霉菌门（Planctomycetes）、绿弯菌门

（Chloroflexi）、糖化菌门（Saccharibacteria）等。其

中SLA和SLW中的细菌类型，主要包括变形菌门

025

1138

（Proteobacteria）、装甲菌门（Armatimonadetes）、绿

弯菌门（Chloroflexi）、硝化螺菌门（Nitrospirae）；

SLX和SLZ主要包括酸杆菌门（Acidobacteria）、放

线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacte‑

ria）、拟杆菌门（Verrucomicrobia）、芽单胞菌门

（Gemmatimonadetes）等菌群。

图2

Fig.2

细菌群落维恩图

Venndiagramofbacterialcommunity

A：门水平；B：属水平

A，phylumlevel；B，genuslevel

图3

Fig.3

不同处理细菌群落热图

Bacterialcommunityheatmapofdifferenttreatments

与SLA相比，SLX和SLZ处理均显著增加的

门为拟杆菌门（Bacteroidetes）分别增加了18.18%

和44.69%；浮霉菌门（Planctomycetes）分别增加

了53.74%和60.50%；绿弯菌门（Chloroflexi）分

别增加了4.79%和12.35%；变形菌门（Proteobac‑

teria）分别增加了2.51%和3.57%。与SLA相

比，SLX和SLZ处理均显著降低的门糖化菌门

（Saccharibacteria）分别降低27.23%和33.98%；

放线菌门（Actinobacteria）分别降低0.58%和

12.34%。与SLA相比，酸杆菌门（Acidobacteria）

变化幅度较小，SLX处理增加了3.18%和SLZ处

理降低了1.09%；芽单胞菌门（Gemmatimonade‑

tes），SLX处理降低3.18%和SLZ处理增加

1.09%。

其中SLA和SLW变形菌门相对丰度较高，分

别达到21.4、23.2%，在SLZ和SLX的处理中，酸

山西农业大学学报（自然科学版）2021

杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）

芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）分别比（SLA和

SLW）增加7.86%、2.51%和5.55%。说明以这2

个处理，经过低温富集培养，主要增加了酸杆菌

门、放线菌门、芽单胞菌门等菌株。

与SLA相比，SLX和SLZ处理丰度均显著增

加的属有溶杆菌属（Lysobacter）分别增加

101.25%和168.19%；拟无枝酸菌属（Amycola⁃

topsis）分别增加了149.88%和48.25%；独岛菌属

（Dokdonella）分别增加了112.55%和69.71%；

Gemmatirora分别增加了220.89%和719.08%；

Haliangium分别增加了135.99%和159.66%；与

SLA相比，降低的属有Rhodoplaner分别降低了

54.42%和46.48%；Reyranella分别降低了

3.29%和28.07%。其他未分类属种处理间变化

差异亦很显著，进一步从SLX发现，unculturedAc‑

idobacteriaceae，unculturedSphingomonas等一些未

被鉴定的菌株，分别占细菌总量的3.7%~8.3%。

分析可能是一些现阶段未被发现的产纤维素酶的

新菌株。

从热图和基于Beta多样性分析，得到的不同

处理UPG-MA聚类结果见图4。样品越靠近，代

表样品物种组成越相似。第一、二主成分轴对细

菌群落结构变异解释量分别为32.42%和

22.77%。SLX和SLZ分布在PC1轴正向，SLA

和SLW分布在PC1轴反向；SLA和SLW的微生

物群落聚为一个类群，SLX和SLZ微生物群落为

一个类群，表明样品来源是影响微生物群落划分

的主要因素。

从图3、图4可见，不同处理富集了不同菌群，

其中SLX和SLZ、SLA和SLW各聚为一个类群，

其中SLX处理是在各处理中是最丰富的细菌类

群，菌群相对丰度越高，物种和遗传多样性越丰

富，同时也具有广泛的生理代谢功能，其中SLX主

要增加了，酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门

（Actinobacteria）是降解木质素的功能群，芽单胞

菌门（Gemmatimonadetes）可能参与木质素和环境

污染物的降解，并发现了一些新的菌种。由此可

知，SLX处理中保留了菌源土壤中的功能菌，通过

限制性培养使其大量扩繁，大大提高功能菌的丰

度，从而促进玉米秸秆的降解。

2.3细菌群落纲水平与纤维素酶活性响应关系

不同纤维素酶活因子用带有箭头的黑色线段

表示，响应变量用带有箭头的蓝色虚线线段表示，

其长短代表其在排序空间内的变化量。本研究通

过冗余分析探究细菌群落纲水平下4种不同纤维

素酶因子变化趋势。如图5所示，结果表明不同微

生物细菌群落结构对纤维素酶活性对有显著影

响，并可以解释微生物群落结构总变异的

34.15%。如图3B所示FPA、CMCase、C1和BG

酶。C1、BG位于第四象限，C1与α-变形菌纲

（Deltaproteobacteria）、BG与β-变形菌纲（Betapro⁃

teobacteria）表现正相关；CMCase和FPA位于第

二象限，与酸杆菌门（Acidobacteria）表现正相关。

．

�

PCoA - PC 1 vs PC2

．

---------------

一一一一一一一

．

一一一一一一一一一一一一一

一

＝

．

一

．

图5

Fig.5

纲水平细菌菌群与不同纤维素酶活冗余分析

Redundancyanalysis（RDA）oflmicrobialcommu‑

nitystructureanddifferenttypesofcellulase

，

•

PCl-Percent variation explained 32.42%

'I''

。

图4

Fig.4

不同处理UPG-MA聚类图

2.4固体培养正交实验

通过上述分析，确定以SLX为下一步试验菌

DifferentprocessingUPG-MAclusteringdia‑

gramofdifferenttreatments

群，通过正交试验明确该菌群的固体培养方案，从

41（6）

何志刚等：基于高通量测序技术筛选低温秸秆降解菌群的研究

表6和表7对于FPA酶酶活各因素按极差大小主

次顺序为：C>B>A。与FPA酶活对应的R值分

别为R1=1.02；R2=1.45；R3=2.37，表明接种量

的比例对FPA酶活的影响最大，F

=28.82>F

0.05

19，F

=68.89>F

0.05

=19，表明B、C因素对FPA

酶活影响显著。综合以上分析，得到最佳培养基

配方为A

。

表6

Table6

列号

Number

Ⅰ/3

Ⅱ/3

Ⅲ/3

7.53

7.42

6.43

1.02

株分泌多种木质纤维酶协同完成的

［29］

。纯培养单

一的菌株产生的木质纤维素酶种类较少

［30］

。现阶

段，国内外对人工复配菌群的研究主要集中于1~

3种纯菌混合培养

［31］

，超过4种菌种混合培养的报

道很少。同时，约有99%的微生物目前无法培养，

所以人工复配的复合菌群并不完全符合自然状态

下木质纤维素的分解条件和规律，其降解效率也

不高。有一些学者，采集自然界原生态环境样品

固体发酵正交试验结果

Resultsoforthogonalsolidfermentation

6.27

7.41

7.71

1.45

7.02

8.37

6.33

2.37

A1B3C2

水平组合

Combination

A1B1C1

A1B2C2

A1B3C3

A2B1C2

A2B2C3

A2B3C1

A3B1C3

A3B2C1

A3B3C2

FPA酶/

（U·g）

6.31

9.24

6.72

8.06

6.84

7.73

4.46

7.04

7.82

-1

为接种物，采用限制性富集培养条件，构建了高效

降解滤纸、水稻秸秆和纸浆废物等的复合菌

群

［32~34］

。目前对能够高效降解玉米秸秆的低温复

合菌群的报道较少。

本试验通过限制性培养条件和连续继代培

养，筛选获得了一组高效稳定分解玉米秸秆的复

合菌群SLX。与马欣雨等

［19］

分离筛选到的纤维素

分解菌最适生长条件下（温度：30℃、pH：7.5），液

态发酵培养15天秸秆降解率达到53.88%。进行

比较本实验筛选到复合菌群在温度10℃条件下，

玉米秸秆的分解率达到58.97%，具有更高的分解

效率。SLX菌群在15d内产复合酶系，与陈晶

晶

［15］

分离筛选到高活性纤维素分解菌菌株的

CMC酶活力最高，达25U·mL

-1

，比较本试验筛选

到复合菌群CMC酶活力达到10.48U·mL

-1

，FPA

酶活力达到9.33U·mL

-1

，C1酶活力达到5.24U·

-1

，BG酶活力达到1.03U·mL

-1

，酶活并不太

高，属于中等水平，这可能与培养温度有关，目前

对10℃低温条件下获得的产高纤维素酶活的菌株

的研究报道较少。

发酵条件优化试验常用的设计方法有正交试

验设计法、响应面设计法等，一般是由单因素试验

确定试验因素与水平，后经多因素设计试验得出

多因素试验条件下的最优组合，本实验通过固体

正交发酵培养实验结果显示：麦麸∶秸秆比例7∶3

时为最佳配比，水料比最佳比例为1∶1，接种量最

佳值为5%。本研究为菌系的后续固体发酵试验

奠定一了良好的基础。

3.2不同处理对微生物群落结构的影响

本研究结果表明富集可以增加功能微生物的

丰富度和多样性

［34~36］

，4个富集菌群丰度较高的主

要类群有：变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门

（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、芽单

胞菌门（Gemmatimonadetes）、疣微菌门（Verruco‑

表7

Table7

固体发酵正交试验方差分析结果

Analysisofvarianceoftheorthogonalexperiment

ofsolidfermentation

变异来源

source

空闲因子

总和

2.19

3.49

8.46

14.26

18.12

28.82

68.89

＊

临界值

Criticalvalue

0.05

=19

0.01

=99

注：*表示在5%水平上显著

Note：*IndicatessignificantdifferenceatP<5%level

正交试验结果表明，麦麸∶秸秆粉的比例7∶3

时为最佳配比，水料比的最佳比例为1∶1时，接种

量的最佳值为5%。

3.1

讨论

不同处理对纤维素酶活性及秸秆降解率的

影响

自然界中玉米秸秆的降解是由多种微生物菌

山西农业大学学报（自然科学版）2021

microbia）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bac‑

teroidetes）、浮霉菌门（Planctomycetes）、绿弯菌门

（Chloroflexi）、糖化菌门（Saccharibacteria）。

4个处理聚类为2大类，以SLA和SLW为一

类，以SLX和SLZ分为一类，其中SLX种群丰富

度在不同处理中最高，主要含有酸杆菌门（Acido‑

bacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和芽单胞菌门

（Gemmatimonadetes）拟杆菌门（Verrucomicrobia）

的微生物菌株。其中放线菌门（Actinobacteria）的

菌株具有优异的纤维素水解能力，厚壁菌门（Fir‑

micutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）是降解木质素

的功能群，芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）可能

参与木质素和环境污染物的降解，绿弯菌门（Chlo‑

roflexi）的菌种相对耐低温，对冬季秸秆的降解具

有促进作用。在属分类上unculturedAcidobacteri‑

aceae，unculturedSphingomonas，为优势菌株。这

说明可能存在某些新的菌种。

冗余分析结果表明不同微生物细菌群落结构

对纤维素酶活性对有显著影响，并可以解释微生

物群落结构总变异的34.15%。C1、BG位于第四

象限，C1与α-变形菌纲（Deltaproteobacteria）、BG

与β-变形菌纲（Betaproteobacteria）表现正相关，其

中变形菌纲是土壤细菌中的优势菌种，在森林土

壤中是最丰富的细菌类群，相对丰度越高，物种和

遗传多样性越丰富，具有广泛的生理代谢功能，在

土壤有机物质分解、循环和能量转化中起到了重

要作用；CMCase和FPA位于第二象限，与酸杆菌

门（Acidobacteria）表现正相关，其中酸杆菌门（Ac‑

idobacteria）的菌株具有优异的纤维素水解能力，

说明上述菌株是产生纤维素酶的主要菌纲。

idobacteriaceae

，

unculturedSphingomonas等为优

势菌株。它们均直接或间接参与秸秆降解进程中

的酶促反应，外切β-葡聚糖酶（C1）与α-变形菌纲

（Deltaproteobacteria）、β-葡萄糖苷酶（BG）与β-变

形菌纲（Betaproteobacteria）表现正相关；内切β-葡

聚糖酶（CMCase）和滤纸酶（FPA）位于第二象限，

与酸杆菌门（Acidobacteria）表现正相关。这可以

解释微生物群落结构总变异的34.15%，菌群通过

菌种之间的协同作用，共同维持了体系的稳定。

固体发酵培养试验结果显示：麦麸、秸秆粉的比例

7∶3时为最佳配比，水料比的最佳比例为1∶1时，接

种量的最佳值为5%。研究结果为明确低温秸秆

降解菌群降解机理和提高纤维素降解效率提供了

理论基础。

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4结论

本试验通过对4组菌源样品的不同纤维素酶

活性、秸秆分解效率以及Alpha多样性、OTU丰度

和差异度、菌群种群结构及含量进行测定，结果表

明复合菌群SLX具有高效稳定分解玉米秸秆的能

力。该菌群在15d内产生复合纤维素酶系，对玉

米秸秆的分解率达到58.97%。在限制性富集继

代培养过程中菌种组成多样性较高，菌群结构更

加丰富、均匀。菌株主要为酸杆菌门（Acidobacte‑

ria）、放线菌门（Actinobacteria）和芽单胞菌门

（Gemmatimonadetes），在种分类上，unculturedAc⁃

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（PlantNutritionandEnvironmentalResourcesResearchInstitute，LiaoningAcademyofAgricuturalSciences，Shenyang

100161China）

Abstract：［Objective］Thepresentresearchwasaimedatscreeningandidentifyingcornstalkdegradationcomplexflorawhich

wereefficientatthelowtemperature（10℃）.［Methods］Experimentalsampleswerecollectedfromdifferentlow-temperature

microbialsources，andculturedatlowtemperature（10℃）‑

ond-generationhigh-throughputsequencingmethodwasusedtoanalyzethebacterialcommunitystructureandnumberofdiffer‑

enttreatments，andtodeterminethecellulase，strawweightlossrateandotherdataofdifferentgenerations.［Results］The

mainresultsshowedthatagroupofcomplexfl

floraproducedacompositecellulasesystemwithin15days，andthedecompositionrateofcornstoverreached58.97%.The

resultsproducedbythesecond-generationhigh-throughputsequencingtechnologyshowedthatdifferentsourcesofbacteriawere

plexfloraSLXmainlycontainedAcidobacteria，ActinobacteriaandBacil‑

lusphylum（Gemmatimonadetes）；intermsofspeciesclassification，unculturedAcidobacteriaceae，unculturedSphingomonas，

-β-glucanase（C1）andα-Proteobacteria，β-glucosidase（BG）andβ-Proteobacteriawere

positivelycorrelatedwiththeirperformance；endo-β-glucanEnzymes（CMCase）andfilterpaperenzymes（FPA）werelocated

inthesecondquadrant，andwerepositivelycorrelatedwithAcidobacteria，whichcontributedfor34.15%ofthetotalvariation

terialcommunitymaintainedthestabilityofthesystemthroughthesynergicfunc‑

ultsofsolidfermentationcultureexperimentsshowedthattheoptimalratioofwheatbran：

strawpowderwas7∶3，andwhentheoptimalratioofwater∶materialwas1∶1，theoptimalinoculationamountwas5%.［Con‑

clusion］Theresearchresultsprovidedatheoreticalbasisforclarifyingthedegradationmechanismoflow-temperaturestraw

degradationbacteriaandimprovingtheefficiencyofcellulosedegradation.

Keywords：Complexflora，Cornstover，Microbialdiversity，High-throughputsequencingtechnology