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一种猪流行性腹泻病毒及其应用
2024年5月6日发(作者：功鸿煊)
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(21)申请号 CN2.8
(22)申请日 2014.03.07
(71)申请人 青岛易邦生物工程有限公司
地址 266114 山东省青岛市红岛经济区红岛街道泉大路东大洋社区岙东南路21号
(72)发明人 陶晓珊 刘蕾 韩乃君 申洪银 邹桂荣 邹敏 胡潇 范根成 孙健
(74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人 汤东凤
(51)
C12N7/04
C07K16/10
A61K39/215
A61P31/14
C12R1/93
(10)申请公布号 CN 103820399 A
(43)申请公布日 2014.05.28
权利要求说明书 说明书 幅图
(54)发明名称
一种猪流行性腹泻病毒及其应用
(57)摘要
本发明提供一种猪流行性腹泻病毒
SD10株,于2013年11月08日保藏于北京
市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院
中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生
物中心，保藏编号为：CGMCC No.8503。
与现有的病毒比较，本发明所筛选的猪流
行性腹泻病毒SD10株毒性低，免疫原性
好，制成的疫苗免疫后抗体产生快，产生
的抗体滴度高且维持时间长，保存期长，
免疫剂量小，在配种前进行免疫注射可使
怀孕母猪所产仔猪获得较好的被动免疫，
使仔猪产生坚强的免疫力，能够抵抗强毒
的攻击，提高仔猪的存活率。
法律状态
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.一种猪流行性腹泻病毒SD10株，其特征在于，所述的猪流行性腹泻
病毒SD10株于2013年11月08日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号
中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编
CGMCC No.8503。 号为：
2.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒SD10株，其特征在于，所述的
3.权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒SD10株用于制备预防猪流行性腹
4.权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒SD10株用于制备预防和治疗猪流
猪流行性腹泻病毒SD10株是由强度株经过传代后获得的。
泻的疫苗。
行性腹泻的抗体。
说 明 书
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒及其
背景技术
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻 病毒引
基本特
种高度
陆续发
巨大的
疫预防
猪传染
有必要
应用。
起的猪的一种高度接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻和食欲下降为
征，本病对不同年龄的猪均易感，尤其哺乳仔猪危害最严重，是一
接触性传染病。该病于1971年首发于英国，20世纪80年代初我国
生本病。近几年，全国猪流行性腹泻呈爆发流行，给养殖业造成了
经济损失。该病感染目前还没有有效的治疗方法，主要是以疫苗免
为主。目前，国外主要是韩国的弱毒苗，国内主要是哈兽研研制的
性胃肠炎、流行性腹泻灭活疫苗等，但临床应用效果较差。因此，
筛选出低毒，且保持高免疫原性的猪流行性腹泻病毒来制备疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪流行性腹泻病毒及其应用，即一种弱毒性，
本发明的猪流行性腹泻病毒SD10株（猪流行性腹泻病毒Porcine
且免疫原性好的猪流行性腹泻病毒，从而弥补现有技术的不足。
Epidemic Diarrhea Virus）,于2013年11月08日保藏于北京市朝阳区北
辰西路1号院3号中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物
中心，保藏编号为：CGMCC No.8503。
本发明的SD10株用于制备预防猪流行性腹泻的疫苗；
本发明的SD10株还用于制备抗体。
与现有的病毒比较，本发明所筛选的猪流行性腹泻病毒SD10株毒性低，
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的病毒株进行详细的描述。
实施例1：猪流行性腹泻病毒SD10株的筛选
1.1猪流行性腹泻病毒SD10株的分离和鉴定在进行流行病学调查 时，从
泻病毒
至第8
免疫原性好，制成的疫苗免疫后抗体产生快，产生的抗体滴度高且维持时
间长，保存期长，免疫剂量小，在配种前进行免疫注射可使怀孕母猪所产
仔猪获得较好的被动免疫，使仔猪产生坚强的免疫力，能够抵抗强毒的攻
击，提高仔猪的存活率。
山东莱西某猪场送检的腹泻猪小肠内容物中分离到一株猪流行性腹
（命名为SD10A1株），猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测阳性，盲传
代出现细胞病变，第16代出现规律、稳定的细胞病变，病毒含量≥
105.0TCID50/0.1ml，能够被抗猪流行性腹泻病毒特
代时，传代的病毒对3～5日龄健康未吃初乳仔
菌、支原体和外源病毒（猪瘟、猪细小病
与呼吸综合症、猪口蹄疫病毒）污染。将
性腹泻病毒
月08日保藏
种保藏管理委
异性血清中和，传至第121
猪安全，纯净，无细菌、霉
毒、牛病毒性腹泻病毒、猪繁殖
最终传代分离的SD10株（猪流行
Porcine Epidemic Diarrhea Virus）进行保藏，于2013年11
于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院中国微生物菌
员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.8503。
1.2本毒株接种母猪后，母猪未见流产、早产等不良反应，所产仔猪
泻发生。
1.3本发明毒株的病毒含量≥105.0TCID50/0.1ml。
1.4本发明毒株安全性好，对3～5日龄健康未吃初乳仔猪安全。
1.5本发明毒株病毒液与冻干保护剂混合，经冷冻真空干燥制备的疫
疫母猪后，所产仔猪能够100%抵抗强毒的攻击。
1.6克隆SD10株的ORF3基因,其全长为675bp,编码有224个氨基酸。
二、用筛选的SD10株制备疫苗
1.1疫苗的制备
1.2按照常规方法制备Vero细胞(Vero细胞购自美国ATCC)，生长液为
1.3取SD10株毒种（≥105.0TCID50/0.1ml）按1%接种长
势良好的Vero 细胞单层，置37℃吸附1.5小时，加含2%新生牛血清
含8%新生牛血清的MEM，培养细胞长成单层时接种SD10株病毒；
通过在NCBI中进行blastn分析，结果分离的ORF3基因与已报道的猪流行
性腹泻病毒的ORF3基因都存在3-5个氨基酸的差别。表明本发明所分离的
SD10株与已有的猪流行性腹泻病毒都存在遗传上的差异，为一新的病毒株。
苗，免
未有腹
MEM维持液继续培养；
1.4接毒后，每日观察2次，记录细胞病变情况，细胞病变达75%以上
时收获，反复冻融3次；
1.5取冻融后的病毒液测定病毒含量，每0.1ml病毒含量不低于
1.6将检验合格的细胞毒液与保护剂按常规方法制备成疫苗。
其中的保护剂可以为目前使用的任一种病毒疫苗用保护剂，例如蔗糖
为了提供疫苗的保存时间，本申请对疫苗的保护剂进行优化，最终制
酸
成的疫苗中包含有质量百分比浓度为5%的蔗糖、1%明胶和0.5%的酪蛋白
钠（将1ml疫苗视为1g）。通过添加上述的组分，可以使疫苗在长
还能保持活力。在4℃条件下放置180日，其效价基本不变，
其抗体阻断率稍有下降，但仍高于规定的标准；而用普通保护
品，在4℃条件下放置180日，其抗体效价基本上能达到规定
置360日后抗体效价下降很快，尤其720日后不可再使
处理。
牛奶冻干保护剂；以及蔗糖和明胶的保护剂其在疫苗中的质量百分比终浓
度分别为5%和1%。
105.0TCID50；
期保存后，
放置360日，
剂冻干的产
的标准，但放
用，只能按报废品
2.疫苗检验方法及结果
2.1性状检验3批活疫苗外观呈淡黄色海绵状疏松团块，加入稀释液
溶解，易与瓶壁脱离。
2.2无菌检验3批活疫苗按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进
均无菌生长。
后迅速
行检验，
2.3支原体检验3批活疫苗按照现行《中华人民共和国兽药典》附录
验，均无支原体生长。
2.4外源病毒检验3批活疫苗按照现行《中华人民共和国兽药典》附
检验，均无猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪细小病毒污染。
2.5剩余水分检验3批活疫苗按照现行《中华人民共和国兽药典》
行检验，剩余水分分别为2.5%、2.2%、2.4%。
2.6真空度检验3批活疫苗按照现行《中华人民共和国兽药典》附录
验，均呈紫色辉光。
2.7安全检验取猪流行性腹泻中和抗体、抗原均为阴性的3日龄仔猪
随机分成4组，每组5头，口服10头份疫苗，临床观察14日，均
活，未见不良反应发生。
2.8效力检验用细胞维持液将疫苗稀释为每1.0ml含1头份，再作
进行检
录进行
附录进
进行检
20头，
5/5健
10倍
系列稀释，取10-3、10-4、10-5、10-
64个稀释度，分别接种长势良好的
每个稀释度接种6孔，每孔0.1ml，同时设
Vero细胞（96孔细胞培养板），
细胞阴性对照孔。接种后，置37℃、含5%CO2培养72～96小
病变，出现CPE者判为感染，计算
为
时，观察细胞
TCID50。3批活疫苗每头份病毒含量分别
105.5TCID50、105.7TCID50、
105.5TCID50，均不低于
105.0TCID50。
表1：3批活疫苗检验结果
实施例2猪流行性腹泻活疫苗的安全试验
1.材料与方法
1.1单剂量试验
1.1.1对妊娠母猪的单剂量试验取产前4～6周猪流行性腹泻中和抗
原均为阴性的妊娠母猪6头，随机分成2组，每组3头，第1组肌
201001批猪流行性腹泻活疫苗1头份/头，第2组不进行注射作为
观察至母猪产仔。
1.1.2对仔猪的单剂量试验取1日龄仔猪12头，随机分成2组，每
第1组口服201001批猪流行性腹泻活疫苗1头份/头，第2组不
服作为对照组，观察14日。
1.2单剂量重复试验
1.2.1对妊娠母猪的单剂量重复试验取产前4～6周猪流行性腹泻中
抗原均为阴性的妊娠母猪6头，随机分成2组，每组3头，第1
注射201001批猪流行性腹泻活疫苗1头份/头，第2组不进行注射
免疫后2周第1组口服201001批猪流行性腹泻活疫苗1头份/头，
母猪产仔。
1.2.2对仔猪的单剂量重复试验取1日龄仔猪12头，随机分成2组，
头，第1组口服201001批猪流行性腹泻活疫苗1头份/头，第2组
口服作为对照组，免后2周第1组口服201001批猪流行性腹泻活疫
体、抗
肉注射
对照组，
组6头，
进行口
和抗体、
组肌肉
免疫，
观察至
每组6
不进行
苗1头
份/头，观察14日。
1.3超剂量试验
1.3.1对妊娠母猪的超剂量试验取产前4～6周猪流行性腹泻中和抗 体、抗
3组分
份/头，
原均为阴性的妊娠母猪12头，随机分成4组，每组3头，第1、2、
别肌肉注射201001、201002、201003批猪流行性腹泻活疫苗各10头
第4组不进行注射作为对照组，观察至母猪产仔。
1.3.2对仔猪的超剂量试验取1日龄仔猪24头，随机分成4组，每
第1、2、3组分别口服201001批猪流行性腹泻活疫苗各10头份/
4组不进行口服作为对照组，观察14日。
2.结果
2.1单剂量试验结果免疫组3头妊娠母猪与对照组比较，采食、饮水、
2.2单剂量重复试验结果免疫组3头妊娠母猪与对照组比较，采食、
妊娠均未见异常，注射部位均未见不良反应。免疫组6头仔猪与对
较，吃乳、诱饲、粪便均未见异常。
2.3超剂量试验结果3批疫苗免疫组的9头妊娠母猪，采食、饮水、
未见异常，注射部位均未见不良反应。免疫组18头仔猪与对照组比
乳、诱饲、粪便均未见异常。
实施例3猪流行性腹泻活疫苗的效力试验
组6头，
头，第
妊娠产仔均未见异常，注射部位均未见不良反应。免疫组6头仔猪与对照
组比较，吃乳、诱饲、粪便均未见异常。
饮水、
照组比
妊娠均
较，吃
1.主动免疫试验
1.1材料和方法取产前4～6周妊娠母猪8头，随机分成2组，每组
4头，第1组颈部肌肉注射201001批猪流行性腹泻活疫苗，
作为对照组，母猪产仔后，3日龄、7日龄、14日龄、21日龄
头，随机分成2组，每组7头，均口服猪流行性腹泻强毒5ml，
仔猪的临床表现。
第2组不注射
仔猪各取14
观察攻毒后
1.2结果免疫母猪所产的仔猪，3日龄攻毒后，7头免疫仔猪哺乳、
粪便未见异常，均健活；7头对照仔猪攻毒后，7/7表现典型的猪流
泻症状，6/7死亡。7日龄攻毒后，免疫仔猪哺乳、精神、粪便未见
均健活；7头对照仔猪攻毒后，7/7表现典型的猪流行性腹泻症状，
亡。14日龄攻毒后，7头免疫仔猪采食、精神、粪便未见异常，均健
头对照仔猪攻毒后，7/7表现典型的猪流行性腹泻症状，6/7死亡。
龄攻毒后，7头免疫仔猪采食、精神、粪便未见异常，均健活；7头对
表2免疫母猪所产的仔猪攻毒保护率
照仔猪攻毒后，6/7表现典型的猪流行性腹泻症状，6/7死亡。
精神、
行性腹
异常，
6/7死
活；7
21日
攻毒日龄
免疫组攻毒保护率
3日龄 0/7 7/7 对照组攻毒保护率 7/7
7日龄 0/7
7/7
14日龄 0/7 7/7
21日龄 1/7
2.被动免疫试验
2.1材料和方法1-3日龄仔猪42头，随机分成2大组，每组21头，
颈部肌肉注射201001批猪流行性腹泻活疫苗，第2组不口服作为对
于免后7日、14日、21日各取14头，再随机分成2组，每组7头，
猪流行性腹泻强毒5ml，观察攻毒后仔猪的临床表现。
2.2结果免后7日攻毒后，7头免疫仔猪哺乳、精神、粪便未见异常，
均健活；7头对照仔猪攻毒后，7/7表现典型的猪流行性腹泻症状，6/7死
亡。免后14日攻毒后，7头免疫仔猪采食、精神、粪便未见异常，均健活；
7头对照仔猪攻毒后，7/7表现典型的猪流行性腹泻症状，6/7死亡。
21日攻毒后，7头免疫仔猪采食、精神、粪便未见异常，均健活；7
仔猪攻毒后，6/7表现典型的猪流行性腹泻症状，6/7死亡。
第1组
照组，
均口服
免后
头对照
表3主动免疫仔猪攻毒保护率
2.3疫苗的特异性检测
免疫实验的结果表明，本发明制备的疫苗能够有效的预防目前流行的
猪流行性腹泻病毒的侵染，效果与目前使用的猪流行性腹泻病毒疫苗的效
果相似。但对于SD10A1株的浸染的免疫能力上,本发明制备的疫苗具有更
高的免疫效力,推测是由SD10A1株及由SD10A1株传代获得的SD10株相
比于已有的猪流行性腹泻病毒的遗传差异导致的免疫的特异性。
2024年5月6日发(作者：功鸿煊)
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(21)申请号 CN2.8
(22)申请日 2014.03.07
(71)申请人 青岛易邦生物工程有限公司
地址 266114 山东省青岛市红岛经济区红岛街道泉大路东大洋社区岙东南路21号
(72)发明人 陶晓珊 刘蕾 韩乃君 申洪银 邹桂荣 邹敏 胡潇 范根成 孙健
(74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人 汤东凤
(51)
C12N7/04
C07K16/10
A61K39/215
A61P31/14
C12R1/93
(10)申请公布号 CN 103820399 A
(43)申请公布日 2014.05.28
权利要求说明书 说明书 幅图
(54)发明名称
一种猪流行性腹泻病毒及其应用
(57)摘要
本发明提供一种猪流行性腹泻病毒
SD10株,于2013年11月08日保藏于北京
市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院
中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生
物中心，保藏编号为：CGMCC No.8503。
与现有的病毒比较，本发明所筛选的猪流
行性腹泻病毒SD10株毒性低，免疫原性
好，制成的疫苗免疫后抗体产生快，产生
的抗体滴度高且维持时间长，保存期长，
免疫剂量小，在配种前进行免疫注射可使
怀孕母猪所产仔猪获得较好的被动免疫，
使仔猪产生坚强的免疫力，能够抵抗强毒
的攻击，提高仔猪的存活率。
法律状态
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.一种猪流行性腹泻病毒SD10株，其特征在于，所述的猪流行性腹泻
病毒SD10株于2013年11月08日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号
中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编
CGMCC No.8503。 号为：
2.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒SD10株，其特征在于，所述的
3.权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒SD10株用于制备预防猪流行性腹
4.权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒SD10株用于制备预防和治疗猪流
猪流行性腹泻病毒SD10株是由强度株经过传代后获得的。
泻的疫苗。
行性腹泻的抗体。
说 明 书
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒及其
背景技术
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻 病毒引
基本特
种高度
陆续发
巨大的
疫预防
猪传染
有必要
应用。
起的猪的一种高度接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻和食欲下降为
征，本病对不同年龄的猪均易感，尤其哺乳仔猪危害最严重，是一
接触性传染病。该病于1971年首发于英国，20世纪80年代初我国
生本病。近几年，全国猪流行性腹泻呈爆发流行，给养殖业造成了
经济损失。该病感染目前还没有有效的治疗方法，主要是以疫苗免
为主。目前，国外主要是韩国的弱毒苗，国内主要是哈兽研研制的
性胃肠炎、流行性腹泻灭活疫苗等，但临床应用效果较差。因此，
筛选出低毒，且保持高免疫原性的猪流行性腹泻病毒来制备疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪流行性腹泻病毒及其应用，即一种弱毒性，
本发明的猪流行性腹泻病毒SD10株（猪流行性腹泻病毒Porcine
且免疫原性好的猪流行性腹泻病毒，从而弥补现有技术的不足。
Epidemic Diarrhea Virus）,于2013年11月08日保藏于北京市朝阳区北
辰西路1号院3号中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物
中心，保藏编号为：CGMCC No.8503。
本发明的SD10株用于制备预防猪流行性腹泻的疫苗；
本发明的SD10株还用于制备抗体。
与现有的病毒比较，本发明所筛选的猪流行性腹泻病毒SD10株毒性低，
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的病毒株进行详细的描述。
实施例1：猪流行性腹泻病毒SD10株的筛选
1.1猪流行性腹泻病毒SD10株的分离和鉴定在进行流行病学调查 时，从
泻病毒
至第8
免疫原性好，制成的疫苗免疫后抗体产生快，产生的抗体滴度高且维持时
间长，保存期长，免疫剂量小，在配种前进行免疫注射可使怀孕母猪所产
仔猪获得较好的被动免疫，使仔猪产生坚强的免疫力，能够抵抗强毒的攻
击，提高仔猪的存活率。
山东莱西某猪场送检的腹泻猪小肠内容物中分离到一株猪流行性腹
（命名为SD10A1株），猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测阳性，盲传
代出现细胞病变，第16代出现规律、稳定的细胞病变，病毒含量≥
105.0TCID50/0.1ml，能够被抗猪流行性腹泻病毒特
代时，传代的病毒对3～5日龄健康未吃初乳仔
菌、支原体和外源病毒（猪瘟、猪细小病
与呼吸综合症、猪口蹄疫病毒）污染。将
性腹泻病毒
月08日保藏
种保藏管理委
异性血清中和，传至第121
猪安全，纯净，无细菌、霉
毒、牛病毒性腹泻病毒、猪繁殖
最终传代分离的SD10株（猪流行
Porcine Epidemic Diarrhea Virus）进行保藏，于2013年11
于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院中国微生物菌
员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.8503。
1.2本毒株接种母猪后，母猪未见流产、早产等不良反应，所产仔猪
泻发生。
1.3本发明毒株的病毒含量≥105.0TCID50/0.1ml。
1.4本发明毒株安全性好，对3～5日龄健康未吃初乳仔猪安全。
1.5本发明毒株病毒液与冻干保护剂混合，经冷冻真空干燥制备的疫
疫母猪后，所产仔猪能够100%抵抗强毒的攻击。
1.6克隆SD10株的ORF3基因,其全长为675bp,编码有224个氨基酸。
二、用筛选的SD10株制备疫苗
1.1疫苗的制备
1.2按照常规方法制备Vero细胞(Vero细胞购自美国ATCC)，生长液为
1.3取SD10株毒种（≥105.0TCID50/0.1ml）按1%接种长
势良好的Vero 细胞单层，置37℃吸附1.5小时，加含2%新生牛血清
含8%新生牛血清的MEM，培养细胞长成单层时接种SD10株病毒；
通过在NCBI中进行blastn分析，结果分离的ORF3基因与已报道的猪流行
性腹泻病毒的ORF3基因都存在3-5个氨基酸的差别。表明本发明所分离的
SD10株与已有的猪流行性腹泻病毒都存在遗传上的差异，为一新的病毒株。
苗，免
未有腹
MEM维持液继续培养；
1.4接毒后，每日观察2次，记录细胞病变情况，细胞病变达75%以上
时收获，反复冻融3次；
1.5取冻融后的病毒液测定病毒含量，每0.1ml病毒含量不低于
1.6将检验合格的细胞毒液与保护剂按常规方法制备成疫苗。
其中的保护剂可以为目前使用的任一种病毒疫苗用保护剂，例如蔗糖
为了提供疫苗的保存时间，本申请对疫苗的保护剂进行优化，最终制
酸
成的疫苗中包含有质量百分比浓度为5%的蔗糖、1%明胶和0.5%的酪蛋白
钠（将1ml疫苗视为1g）。通过添加上述的组分，可以使疫苗在长
还能保持活力。在4℃条件下放置180日，其效价基本不变，
其抗体阻断率稍有下降，但仍高于规定的标准；而用普通保护
品，在4℃条件下放置180日，其抗体效价基本上能达到规定
置360日后抗体效价下降很快，尤其720日后不可再使
处理。
牛奶冻干保护剂；以及蔗糖和明胶的保护剂其在疫苗中的质量百分比终浓
度分别为5%和1%。
105.0TCID50；
期保存后，
放置360日，
剂冻干的产
的标准，但放
用，只能按报废品
2.疫苗检验方法及结果
2.1性状检验3批活疫苗外观呈淡黄色海绵状疏松团块，加入稀释液
溶解，易与瓶壁脱离。
2.2无菌检验3批活疫苗按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进
均无菌生长。
后迅速
行检验，
2.3支原体检验3批活疫苗按照现行《中华人民共和国兽药典》附录
验，均无支原体生长。
2.4外源病毒检验3批活疫苗按照现行《中华人民共和国兽药典》附
检验，均无猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪细小病毒污染。
2.5剩余水分检验3批活疫苗按照现行《中华人民共和国兽药典》
行检验，剩余水分分别为2.5%、2.2%、2.4%。
2.6真空度检验3批活疫苗按照现行《中华人民共和国兽药典》附录
验，均呈紫色辉光。
2.7安全检验取猪流行性腹泻中和抗体、抗原均为阴性的3日龄仔猪
随机分成4组，每组5头，口服10头份疫苗，临床观察14日，均
活，未见不良反应发生。
2.8效力检验用细胞维持液将疫苗稀释为每1.0ml含1头份，再作
进行检
录进行
附录进
进行检
20头，
5/5健
10倍
系列稀释，取10-3、10-4、10-5、10-
64个稀释度，分别接种长势良好的
每个稀释度接种6孔，每孔0.1ml，同时设
Vero细胞（96孔细胞培养板），
细胞阴性对照孔。接种后，置37℃、含5%CO2培养72～96小
病变，出现CPE者判为感染，计算
为
时，观察细胞
TCID50。3批活疫苗每头份病毒含量分别
105.5TCID50、105.7TCID50、
105.5TCID50，均不低于
105.0TCID50。
表1：3批活疫苗检验结果
实施例2猪流行性腹泻活疫苗的安全试验
1.材料与方法
1.1单剂量试验
1.1.1对妊娠母猪的单剂量试验取产前4～6周猪流行性腹泻中和抗
原均为阴性的妊娠母猪6头，随机分成2组，每组3头，第1组肌
201001批猪流行性腹泻活疫苗1头份/头，第2组不进行注射作为
观察至母猪产仔。
1.1.2对仔猪的单剂量试验取1日龄仔猪12头，随机分成2组，每
第1组口服201001批猪流行性腹泻活疫苗1头份/头，第2组不
服作为对照组，观察14日。
1.2单剂量重复试验
1.2.1对妊娠母猪的单剂量重复试验取产前4～6周猪流行性腹泻中
抗原均为阴性的妊娠母猪6头，随机分成2组，每组3头，第1
注射201001批猪流行性腹泻活疫苗1头份/头，第2组不进行注射
免疫后2周第1组口服201001批猪流行性腹泻活疫苗1头份/头，
母猪产仔。
1.2.2对仔猪的单剂量重复试验取1日龄仔猪12头，随机分成2组，
头，第1组口服201001批猪流行性腹泻活疫苗1头份/头，第2组
口服作为对照组，免后2周第1组口服201001批猪流行性腹泻活疫
体、抗
肉注射
对照组，
组6头，
进行口
和抗体、
组肌肉
免疫，
观察至
每组6
不进行
苗1头
份/头，观察14日。
1.3超剂量试验
1.3.1对妊娠母猪的超剂量试验取产前4～6周猪流行性腹泻中和抗 体、抗
3组分
份/头，
原均为阴性的妊娠母猪12头，随机分成4组，每组3头，第1、2、
别肌肉注射201001、201002、201003批猪流行性腹泻活疫苗各10头
第4组不进行注射作为对照组，观察至母猪产仔。
1.3.2对仔猪的超剂量试验取1日龄仔猪24头，随机分成4组，每
第1、2、3组分别口服201001批猪流行性腹泻活疫苗各10头份/
4组不进行口服作为对照组，观察14日。
2.结果
2.1单剂量试验结果免疫组3头妊娠母猪与对照组比较，采食、饮水、
2.2单剂量重复试验结果免疫组3头妊娠母猪与对照组比较，采食、
妊娠均未见异常，注射部位均未见不良反应。免疫组6头仔猪与对
较，吃乳、诱饲、粪便均未见异常。
2.3超剂量试验结果3批疫苗免疫组的9头妊娠母猪，采食、饮水、
未见异常，注射部位均未见不良反应。免疫组18头仔猪与对照组比
乳、诱饲、粪便均未见异常。
实施例3猪流行性腹泻活疫苗的效力试验
组6头，
头，第
妊娠产仔均未见异常，注射部位均未见不良反应。免疫组6头仔猪与对照
组比较，吃乳、诱饲、粪便均未见异常。
饮水、
照组比
妊娠均
较，吃
1.主动免疫试验
1.1材料和方法取产前4～6周妊娠母猪8头，随机分成2组，每组
4头，第1组颈部肌肉注射201001批猪流行性腹泻活疫苗，
作为对照组，母猪产仔后，3日龄、7日龄、14日龄、21日龄
头，随机分成2组，每组7头，均口服猪流行性腹泻强毒5ml，
仔猪的临床表现。
第2组不注射
仔猪各取14
观察攻毒后
1.2结果免疫母猪所产的仔猪，3日龄攻毒后，7头免疫仔猪哺乳、
粪便未见异常，均健活；7头对照仔猪攻毒后，7/7表现典型的猪流
泻症状，6/7死亡。7日龄攻毒后，免疫仔猪哺乳、精神、粪便未见
均健活；7头对照仔猪攻毒后，7/7表现典型的猪流行性腹泻症状，
亡。14日龄攻毒后，7头免疫仔猪采食、精神、粪便未见异常，均健
头对照仔猪攻毒后，7/7表现典型的猪流行性腹泻症状，6/7死亡。
龄攻毒后，7头免疫仔猪采食、精神、粪便未见异常，均健活；7头对
表2免疫母猪所产的仔猪攻毒保护率
照仔猪攻毒后，6/7表现典型的猪流行性腹泻症状，6/7死亡。
精神、
行性腹
异常，
6/7死
活；7
21日
攻毒日龄
免疫组攻毒保护率
3日龄 0/7 7/7 对照组攻毒保护率 7/7
7日龄 0/7
7/7
14日龄 0/7 7/7
21日龄 1/7
2.被动免疫试验
2.1材料和方法1-3日龄仔猪42头，随机分成2大组，每组21头，
颈部肌肉注射201001批猪流行性腹泻活疫苗，第2组不口服作为对
于免后7日、14日、21日各取14头，再随机分成2组，每组7头，
猪流行性腹泻强毒5ml，观察攻毒后仔猪的临床表现。
2.2结果免后7日攻毒后，7头免疫仔猪哺乳、精神、粪便未见异常，
均健活；7头对照仔猪攻毒后，7/7表现典型的猪流行性腹泻症状，6/7死
亡。免后14日攻毒后，7头免疫仔猪采食、精神、粪便未见异常，均健活；
7头对照仔猪攻毒后，7/7表现典型的猪流行性腹泻症状，6/7死亡。
21日攻毒后，7头免疫仔猪采食、精神、粪便未见异常，均健活；7
仔猪攻毒后，6/7表现典型的猪流行性腹泻症状，6/7死亡。
第1组
照组，
均口服
免后
头对照
表3主动免疫仔猪攻毒保护率
2.3疫苗的特异性检测
免疫实验的结果表明，本发明制备的疫苗能够有效的预防目前流行的
猪流行性腹泻病毒的侵染，效果与目前使用的猪流行性腹泻病毒疫苗的效
果相似。但对于SD10A1株的浸染的免疫能力上,本发明制备的疫苗具有更
高的免疫效力,推测是由SD10A1株及由SD10A1株传代获得的SD10株相
比于已有的猪流行性腹泻病毒的遗传差异导致的免疫的特异性。