2024年5月7日发(作者：蹉新柔)
CRISPR(Cas9) System斑马鱼基因敲除-实验流程(张大伟)
1、 gRNA模板扩增：（以gRNA质粒为模板，扩增片段大小为100bp多）
40ul体系，利用保真性>= Extaq的酶扩增4管；
可以通过胶回收纯化扩增模板（四管过同一个回收柱子），或通过沉淀纯化（附件1）;
沉淀回收模板前，要进行利用5ul电泳检测是否扩增出目的条带；
以上模板皆用
20ul DEPC水
回溶(,反复洗柱子两次)。
2、 gRNA合成：
10ul
5Xtranscription
N(A/U/G/C)mix
template
T7 enzyme mix
2ul
4ul
3ul
1ul
反应温度37℃，时间3-4h。
3、 gRNA纯化
a. 加入1ul DNase I，37℃处理15min；
b. 加入1ul 0.5 M EDTA 8.0，65℃处理10min；
c. 加入57.5ul DEPC water 和 7.5ul 3M sodium Acetate solution(pH 5.2);
d. 加入等体积（即77ul） 酚氯仿（1:1 mix）；12000rpm，15min；
e. 吸取上部水相到新的PCR-tube，加入等体积氯仿，12000rpm，15min；
f. 重复操作e；
g. 收集水相到new-PCR-tube，加入2倍体积无水乙醇；-20℃沉淀至少30min；
h. 12000rpm，15min，去除液体，留下白色gRNA沉淀；
i. 70%乙醇洗3次（每次12000rpm，6min）；
j. 去除70%，自然干燥，10-20ul DEPC water溶解；-80℃保存。
注意
：以上为RNA操作，请使用灭菌未开封的tips and tubes，尽量不说话，避免RNA酶污
染。以上合成与纯化过程为KIT说明书翻译得到，如使用与本实验室不同KIT，请阅读相关
说明书。
4、 Cas9 template 准备 （酶切4h，40ul体系）
将zf-cas9-vector 线性化，即XbaI 单酶切；酶切2 tube，2.3或2.5ug/tube；过同一个胶
回收柱子；20ul DEPC water 回溶，洗涤柱子两边，-20℃保存。
5、 cas9-mRNA 合成
20ul（或10ul）根据需求量选择（减半）
Template 6ul
2XNTP/cap
10Xbuffer
T7 ENzyme
10ul
2ul
2ul
反应温度37℃，时间4.5h。
纯化：
A． 加入1ul DNase I，37℃处理15min；
B． 20ul反应体系，加入30ul LiCl；
C． 冰浴或-20℃沉淀至少30min；
D． 4℃,12000rpm,15min;
E． 100ul 70%乙醇 洗2次（每次12000rpm，6min）；
F． 10ul DEPC water溶解；-80℃保存。
注意：RNA样品根据每次用量的多少分装保存，避免反复冻融，降解。一般1ul/tube保存。
CRISPR(Cas9) System斑马鱼基因敲除-实验流程(张大伟)
6、 斑马鱼注射：
利用混合好的cas9与gRNA样品注射（混合后终浓度分别为300ng/ul 和 20ng/ul, 如果
注射效果不佳，可自行提高混合比例再次注射，最好不要超过500ng/ul 和80ng/ul）
7、 F0注射胚胎检测
准备：50mM NaOH、1 M Tris-HCl PH8.0；30% PAGE；5XTBE；10%APS；
5X TBE
Tris-base 54g
27.5g
硼酸
0.5 M EDTA (PH8.0) 20ml
1000ml
总体积定容
12% PAGE-gel：（两块）
30%
water
5XTBE
10%APS
TEMED
4ml
3.93ml
2ml
70ul
3.5ul
说明：其他所需溶液请自行查询《分子克隆》的配方。
8、 基因组提取及PCR
a. 8 embryos/Tube，加入80ul 50mM NaOH，95℃，40min；（可取3-5tubes）
b. 加入1/10体积 1 M Tris-HCl PH8.0；mix well，3000rpm，5min；
c. 取1ul 作为template，PCR扩增包含靶位点的基因片段；
d. 加6xloading buffer ，run 12% PAGE-gel；、
e. EB染色，凝胶成像仪拍照看条带结果；
f. 如果条带与WT存在差异，则说明敲除有效果；
9、 养鱼
将test有效果的靶位点对应的F0代斑马鱼饲养起来；
10、筛鱼
a.将成熟的F0代斑马鱼与WT mate，取其发育24h的胚胎test，方法同8；
b.将test有效果的靶位点对应的F1代斑马鱼饲养起来；
c．1个月大的幼鱼，剪尾鳍提基因组逐条test；（如图）
11、测序
PCR产物(胶块)直接测序；T-clone直接菌液测序；前者读峰图获得结果后者与标准序列
blast获得；具体如下例：（在标准序列上找到套峰之前的序列，读出套峰处的碱基，重叠套
峰上下写，最后将套峰处标准序列（序列1）找到，其他碱基组合即为序列2；比较后得出
碱基缺失情况。）T-clone sequence获得单一序列（有野生型sequence及mutant sequence，
与网上序列blast后，有碱基缺失的即为突变情况）
CRISPR(Cas9) System斑马鱼基因敲除-实验流程(张大伟)
12、后续筛鱼及传代（标准程序）
A:F0 X WT F1 B: F1 X WT
C:F2 X WT F3 D:F3 X F3
注：step 12的传代都是要通过剪尾鳍test传代的。
F2
观察表型
2024年5月7日发(作者：蹉新柔)
CRISPR(Cas9) System斑马鱼基因敲除-实验流程(张大伟)
1、 gRNA模板扩增：（以gRNA质粒为模板，扩增片段大小为100bp多）
40ul体系，利用保真性>= Extaq的酶扩增4管；
可以通过胶回收纯化扩增模板（四管过同一个回收柱子），或通过沉淀纯化（附件1）;
沉淀回收模板前，要进行利用5ul电泳检测是否扩增出目的条带；
以上模板皆用
20ul DEPC水
回溶(,反复洗柱子两次)。
2、 gRNA合成：
10ul
5Xtranscription
N(A/U/G/C)mix
template
T7 enzyme mix
2ul
4ul
3ul
1ul
反应温度37℃，时间3-4h。
3、 gRNA纯化
a. 加入1ul DNase I，37℃处理15min；
b. 加入1ul 0.5 M EDTA 8.0，65℃处理10min；
c. 加入57.5ul DEPC water 和 7.5ul 3M sodium Acetate solution(pH 5.2);
d. 加入等体积（即77ul） 酚氯仿（1:1 mix）；12000rpm，15min；
e. 吸取上部水相到新的PCR-tube，加入等体积氯仿，12000rpm，15min；
f. 重复操作e；
g. 收集水相到new-PCR-tube，加入2倍体积无水乙醇；-20℃沉淀至少30min；
h. 12000rpm，15min，去除液体，留下白色gRNA沉淀；
i. 70%乙醇洗3次（每次12000rpm，6min）；
j. 去除70%，自然干燥，10-20ul DEPC water溶解；-80℃保存。
注意
：以上为RNA操作，请使用灭菌未开封的tips and tubes，尽量不说话，避免RNA酶污
染。以上合成与纯化过程为KIT说明书翻译得到，如使用与本实验室不同KIT，请阅读相关
说明书。
4、 Cas9 template 准备 （酶切4h，40ul体系）
将zf-cas9-vector 线性化，即XbaI 单酶切；酶切2 tube，2.3或2.5ug/tube；过同一个胶
回收柱子；20ul DEPC water 回溶，洗涤柱子两边，-20℃保存。
5、 cas9-mRNA 合成
20ul（或10ul）根据需求量选择（减半）
Template 6ul
2XNTP/cap
10Xbuffer
T7 ENzyme
10ul
2ul
2ul
反应温度37℃，时间4.5h。
纯化：
A． 加入1ul DNase I，37℃处理15min；
B． 20ul反应体系，加入30ul LiCl；
C． 冰浴或-20℃沉淀至少30min；
D． 4℃,12000rpm,15min;
E． 100ul 70%乙醇 洗2次（每次12000rpm，6min）；
F． 10ul DEPC water溶解；-80℃保存。
注意：RNA样品根据每次用量的多少分装保存，避免反复冻融，降解。一般1ul/tube保存。
CRISPR(Cas9) System斑马鱼基因敲除-实验流程(张大伟)
6、 斑马鱼注射：
利用混合好的cas9与gRNA样品注射（混合后终浓度分别为300ng/ul 和 20ng/ul, 如果
注射效果不佳，可自行提高混合比例再次注射，最好不要超过500ng/ul 和80ng/ul）
7、 F0注射胚胎检测
准备：50mM NaOH、1 M Tris-HCl PH8.0；30% PAGE；5XTBE；10%APS；
5X TBE
Tris-base 54g
27.5g
硼酸
0.5 M EDTA (PH8.0) 20ml
1000ml
总体积定容
12% PAGE-gel：（两块）
30%
water
5XTBE
10%APS
TEMED
4ml
3.93ml
2ml
70ul
3.5ul
说明：其他所需溶液请自行查询《分子克隆》的配方。
8、 基因组提取及PCR
a. 8 embryos/Tube，加入80ul 50mM NaOH，95℃，40min；（可取3-5tubes）
b. 加入1/10体积 1 M Tris-HCl PH8.0；mix well，3000rpm，5min；
c. 取1ul 作为template，PCR扩增包含靶位点的基因片段；
d. 加6xloading buffer ，run 12% PAGE-gel；、
e. EB染色，凝胶成像仪拍照看条带结果；
f. 如果条带与WT存在差异，则说明敲除有效果；
9、 养鱼
将test有效果的靶位点对应的F0代斑马鱼饲养起来；
10、筛鱼
a.将成熟的F0代斑马鱼与WT mate，取其发育24h的胚胎test，方法同8；
b.将test有效果的靶位点对应的F1代斑马鱼饲养起来；
c．1个月大的幼鱼，剪尾鳍提基因组逐条test；（如图）
11、测序
PCR产物(胶块)直接测序；T-clone直接菌液测序；前者读峰图获得结果后者与标准序列
blast获得；具体如下例：（在标准序列上找到套峰之前的序列，读出套峰处的碱基，重叠套
峰上下写，最后将套峰处标准序列（序列1）找到，其他碱基组合即为序列2；比较后得出
碱基缺失情况。）T-clone sequence获得单一序列（有野生型sequence及mutant sequence，
与网上序列blast后，有碱基缺失的即为突变情况）
CRISPR(Cas9) System斑马鱼基因敲除-实验流程(张大伟)
12、后续筛鱼及传代（标准程序）
A:F0 X WT F1 B: F1 X WT
C:F2 X WT F3 D:F3 X F3
注：step 12的传代都是要通过剪尾鳍test传代的。
F2
观察表型