2024年5月27日发(作者：汲浩荡)
山西农业科学2019，47（3）：413-417
doi:10.3969/.1002-2481.2019.03.26
JournalofShanxiAgriculturalSciences
丹霞苹果纯合基因型株系形态学分析
石江鹏
1
袁张春芬
2
袁邓舒
2
袁侯丽媛
3
袁肖蓉
2
袁李芙蓉
1
袁董艳辉
3
袁聂园军
4
袁曹秋芬
1袁3
（1.山西大学生物工程学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院果树研究所，山西太原030031；
3.山西省农业科学院生物技术研究中心，山西太原030031；4.山西省农业科学院农业资源与经济研究所，山西太原030031）
摘要院丹霞苹果花药培养获得来自不同花粉粒的纯合基因型株系，这些纯合基因型株系的叶片形态特征、根系
苹果花药培养试管苗与供体
形态特征等具有差异性，选育出具有优良性状的株系对苹果种质创新具有重要意义
。
探究
丹霞苹果纯合基因型株系的移栽条件是进行新种质试管苗相比更加脆弱，在移栽过程中不容易存活
。因此，
以
8个丹霞苹果纯合基因型株系为材料，
叶片形态特征，选出具
选育的关键性一步
。
通过观察分析根系生长特性
、
结果表明，根数、叶长度、叶
有优良性状的株系，同时筛选再生株系的移栽条件
。
丹霞苹果纯合基因型株系的根长
、
叶宽度、叶长度、叶
宽度、叶柄长度、叶缘、叶色等表现出明显差异，DH3-3，DH3-4，DH3-8株系的根系生长状态
，
丹霞
苹果纯合基因型株系直接移栽的植株生长状态良好
。
柄长度显著优于其他株系
；
形态学分析
关键词院丹霞苹果；花药培养；纯合基因型
；
中图分类号院S661.1文献标识码院A文章编号院1002-2481（2019）03-0413-05
MorphologicalCharacteristicsAnalysisofDanxiaAppleHomozygousGenotypeLines
SHIJiangpeng
1
，ZHANGChunfen
2
，DENGShu
2
，HOULiyuan
3
，XIAORong
2
，LIFurong
1
，
3
DONGYanhui
3
，NIEYuanjun
4
，CAOQiufen
1，
ShanxiUniversity，Taiyuan030006，China；uteofPomology，ShanxiAcademyofAgricultural
（
eofBiologicalEngineering，
Sciences，Taiyuan030031，China；chCenterofBiotechnology，ShanxiAcademyofAgriculturalSciences，Taiyuan030031，
China；uteofAgriculturalResourcesandEconomy，ShanxiAcademyofAgriculturalSciences，Taiyuan030031，China
）
Abstract：Homozygousgenotypelinescomefromdifferentpollengrainscanbeobtainedbyappleantherculture,andleafandroot
morphologicalcharacteristicsofthesehomozygouslinesisdifferent,sotheselineswithgoodtraitsforapplegermplasminnovationhave
ttubeseedlingofappleanthercultureismorefragilethanthoseofdonor,itisdifficultytoremainsalivein
akeysteptoexploretransplantconditionsofDanxiaappleantherculturetube-plantsforbreeding
work,ntheobservationand
analysisrootgrowthcharacteristicsandleafmorphology,weselectedlineswithgoodcharacters,andthesuitabletransplantconditions.
ThemorphologicalfeaturesofultsshowthatDanxia
applehomozygousgenotypeslinescanbetransplantedinthefieldgrowedwell.
Keywords：Danxiaapple；antherculture；homozygousgenotype；morphologicalanalysis
大多数温带水果的特
苹果为温带水果的一种，
童期长达
5～7d，点是育种周期长
，
高度杂合且异
花授粉，通过传统育种手段改变性状遗传信息需要
花费大量的时间，育种目标也具有随机性
[1]
。单倍体
育种是现代育种的一项重要手段，通过雄核离体培
养（花药培养、花粉培养）和雌核离体培养（未授粉
子房或胚珠、辐照花粉培养等）等方法诱导产生具
再利用秋水仙素诱导
有单套染色体的单倍体植株
，
收稿日期院2018-10-22
（
Double等方法进行染色体加倍形成双单倍体
扩大
Haploid，DH）纯合再生株系，可提高育种效率
、
亲本选择范围、减少基因重组数量
[2]
。单倍体和双单
倍体作为基础研究材料，在突变的研究中可用于筛
选隐性突变体，可以提高遗传分析、图谱构建、基因
定位的效率及降低基因组测序成本
[3]
。单倍体育种
丰富了种质资源，加快了育种进程，在科学研究中
具有重要意义
[4]
。
基金项目院国家自然科学基金项目
（
31372033）；山西省国际合作项目
（
201603D421001）；山西省青年科技研究基金项目
（
2016zyzx35）（201502115，201701D221168）；山西省农业科学院种业发展专项
作者简介院石江鹏（1992-），女，山西忻州人，硕士，研究方向：苹果种质资源创新。张春芬同为第一作者。曹秋芬为通信作者。
窑413窑
山西农业科学2019年第47卷第3期
果树花药培养开始于20世纪70年代，目前已
在梨
[5]
、枣
[6]
、柑橘
[7]
、草莓
[8]
等多种植物中获得了成功
元帅苹果花药
应用
。
1981年，国内获得了黄太平
、
培养再生植株
[9-10]
。TSUKUNI等
[11]
和OKADA等
[12]
成
利用
SSR分子标功获得苹果花药培养再生植株后
，
并对纯合再生株系进行
记技术检测再生植株来源，
苹果
形态学观察
。
H魻FER等
[13]
经过多年研究得出
，
花药培养所得纯合再生植株与杂合供体相比结实
率较低，且形态特征发生了改变
。在此基础上，
DH3-2，DH3-3，DH3-4，DH3-5，DH3-6，DH3-7，
DH3-8株系为材料
[16]
。
1.2
1.2.1
试验方法
根系的诱导及测定从继代组培苗中选取
（
1/2生长旺盛的再生植株接种于生根诱导培养基
MS＋2.0mg/LIBA＋2％蔗糖＋0.6％琼脂）。
每个株
（
25℃3000lx；系接种15株，置于温室光照培养光
照14h，黑暗10h；相对湿度70％），40d后选取5个
观察并测
植株用镊子挑选出培养基中的全部根系
，
ZHANG等
[14]
研究发现，处于单核晚期或双核早期
的小孢子可显著提高苹果花药培养胚状体诱导率
，
对花药进行4℃低温预处理20～30d，胚状体诱导
率呈上升趋势
。罗慧珍等
[15]
通过转录组测序的方法
分析低温诱导对苹果花药基因的调控
，结果表明，
蔗糖、淀粉生物合成、植物激素信号转导相关基因
的表达变化是影响小孢子获得胚性潜能的关键。
温
鑫等
[16]
利用流式细胞仪对苹果花药离体培养获得
再生植株进行倍性分析
，再选用苹果
SSR（HIDRAS）
标记鉴定再生植株基因型
，经检测，再生株系全部
为纯合基因型，包括单倍体
、二倍体、四倍体。
国内外有关苹果花药培养的研究不断发展
，但
关于苹果花药培养再生植株移栽技术的相关研究
报道尚未得到大量有效的验证，因此探究苹果花药
培养试管苗的移栽条件可以更好地选出优良的苹
果新种质。
本研究以丹霞苹果花药培养的8个纯合再生
株系为材料
[16-18]
，每个纯合再生植株均由不同的花
粉粒分化而来，因此，不同的株系根系生长状态、叶
片形态特征具有差异性。通过对每个株系试管苗的
根系生长特性、叶片形态特征进行观察分析，选出
具有优良性状的株系，对苹果种质资源创新具有重
要意义
。
1材料和方法
1.1试验材料
采集山西省农业科学院果树研究所苹果基地
的丹霞苹果品种的健壮花蕾，
将其经低温预处理、
消毒，在无菌操作台中将花药接种于胚状体诱导培
养基
（
N6＋2.0～3.0mg/L6-BA＋0～0.15mg/L
NAA），
于
25℃在恒温培养箱暗培养
。将长至
1cm
左右的胚状体转入胚状体分化培养基
（
MS＋1.0～
5.0mg/L6-BA＋0.1～0.3mg/LIBA＋3％蔗糖＋0.6％
琼脂
），
20d左右分化出幼芽。经继代培养获得再
生植株
[1]
。本研究以丹霞苹果纯合基因型DH3-1，
窑414窑
定根的长度和根的数量
，拍照记录。
1.2.2叶片性状的观察及测定从生根试管苗中
选取叶片充分展开和成熟的植株
（茎中部叶片），每
个株系取5个植株，每株选取3个叶片，每个株系
共测量15个叶片。将叶片用清水洗干净后铺平放
入含有滤纸的自封袋中，注明株系号
。测量每个叶
片的叶长度、叶宽度（最大叶宽度
）、叶柄长度。计算
叶形指数（
叶长度
/叶宽度）。观察叶色
、叶缘变异，
并拍照。观察记载方法参照
《果树种质资源描述符
：
记载项目及评价标准
》
[19]
进行
。
1.2.3再生植株移栽技术研究选择生根培养基
上生长茁壮的苗，即叶色浓绿，根系发达，以在组培
瓶中株高较高的为佳。将组培苗进行炼苗，炼苗方
法设2个处理，分别为开盖后直接移栽和温室中闭
盖放置5～7d，开盖加入蒸馏水放置2～3d后移
栽，每个处理5个植株。移栽时先把基质（草炭∶蛭
石∶珍珠盐为1∶1∶1）装至盆的4/5，将取出的试
管苗在清水中洗净根部残留的琼脂后移栽进基质
中，立即用清水浇透，并罩上透明杯，注明移栽日期
和株系号。置于光照培养箱，15d后去掉透明杯，每
周浇一次营养液（1/2MS＋2mg/LIBA）。
1.3数据统计分析
采用MicrosoftExcel2010软件进行原始数据
整理和统计分析
，使用
SPSS20.0软件对不同处理
进行多重比较、单因素方差分析
，显著性水平设定
为琢＝0.05，图表中所有数据均为3个重复的平均
数±标准误
。
2结果与分析
2.1不同株系根系形态特征分析
通过对丹霞苹果纯合基因型株系的根系形态
进行分析
（表
1、图1），结果表明
，
DH3-8，DH3-4株
系的根数、根长显著高于其他6个株系
（
P＜0.05），
根长分别为26.53，27.70cm，根数分别为39.00，
51.67个（
图
1-A，B）；DH3-1，DH3-3，DH3-6株系的
石江鹏等：丹霞苹果纯合基因型株系形态学分析
根长、根数无显著差异
（
P＞0.05），
与
DH3-4，DH3-8
相比显著减小
，根长为
16.67～20.50cm，根数为
13.33～15.33个（
图
1-C～E）；DH3-2，DH3-5，DH3-7
株系的根长、根
数与其他
5个株系相比显著较小
（P＜0.05）（
图
1-F～H），其中，DH3-7株系根长
、根
数最小，
分别为
7.67cm，4.33个（
图
1-H）。可见
，
丹
霞苹果纯合基因型8个株系的根系形态特征具有
差异性，DH3-4，DH3-8株系根的生长状态较好
。
表1丹霞苹果纯合基因型株系根系形态特征
株系
根长/cm根数/个
DH3-1
16.67±1.75b13.33±0.83b
DH3-2
9.07±1.15a7.67±0.83a
DH3-3
20.50±1.33b14.33±1.48b
DH3-4
26.53±1.02c39.00±1.53c
DH3-5
10.17±0.91a6.67±0.83a
DH3-6
19.13±1.56b15.33±0.83b
DH3-7
7.67±0.75a4.33±0.83a
DH3-8
27.70±1.18c51.67±1.87d
注：同列不同小写字母表示同一形态不同株系间差异显著（P＜
0.05）。
表
2同
。
2.2不同株系叶片形态特征分析
从表2可以看出，丹霞苹果纯合基因型株系的
叶片形态特征如叶片宽度、叶片长度、叶柄长度具
有明显差异，DH3-3，DH3-4株系的叶片宽度较宽，
分别为1.90，1.73cm（图2-A，B），显著宽于其他株
系
；
DH3-8，DH3-1，DH3-6，DH3-5株系间叶片宽
度无差异
（图
2-C～F），但显著宽于DH3-2株系
，
DH3-2株系叶片宽度仅为1.00cm（
图
2-H）。DH3-7
株系的叶片长度显著较短
，为
1.83cm（
图
2-G），
但
与其他7个株系的叶片长度未达到差异显著水平
。
不同株系具有不同的叶柄长度
，
DH3-3，DH3-8株
系的叶柄长度较长
，分别为
1.30，1.37cm（
图
2-A，
C），DH3-2株系的叶柄长显著最短
，为
0.47cm（
图
2-
H）。叶形指数在不同株系间表现差异显著
，
DH3-6
株系的叶形指数显著较大
，表明叶片为窄长形（图
2-
E），DH3-3株系的叶形指数显著最小
，表明叶片呈
阔圆形
（图
2-A），DH3-1，DH3-5株系的叶形指数
差异不显著，二者的叶片形状相似
（图
2-D，F）。
表2丹霞苹果纯合基因型株系叶片形态特征比较
株系
叶宽/cm叶长/cm叶柄长/cm叶形指数
DH3-1
1.43±0.53c2.50±0.64b1.00±0.46bc1.74±1.20cd
DH3-2
1.00±0.46a1.90±0.46ab0.47±0.39a1.90±1.00e
DH3-3
1.90±0.46d2.20±0.52a1.30±0.46de1.12±1.15a
DH3-4
1.73±0.63d2.33±0.59ab1.17±0.54cd
1.35±0.94b
DH3-5
1.23±0.54abc2.17±0.67ab0.50±0.46a1.76±1.26d
DH3-6
1.20±0.59abc2.67±0.67b0.83±0.39b
2.22±1.15g
DH3-7
1.13±0.39ab1.83±0.54ab0.60±0.46a
1.62±1.38c
DH3-8
1.30±0.46bc
2.73±0.63b
1.37±0.54e
2.10±1.36f
叶缘、叶色、叶片形状等的变异，
不同的株系表
现不一致
。
DH3-3株系叶基为楔形
（图
2-A），
DH3-4株系为宽楔形
（图
2-B），
而
DH3-6株系的
叶基为偏斜
（图
2-E）；从叶尖来看
，
DH3-4，DH3-7
株系的叶尖为锐尖
（图
2-B，G），DH3-3，DH3-8，
DH3-6株系的为渐尖
（图
2-A，C，E），DH3-1，
DH3-5株系为突尖
（图
2-D，F），DH3-2株系叶尖
呈撕裂状
（图
2-H）；分析每个株系的叶片形状
，
DH3-3，DH3-4株系叶片形状为卵形
（图
2-A，B），
DH3-8，DH3-1，DH3-6，DH3-5，DH3-7为椭圆形
图2-C～G），DH3-2为畸形叶片
（图
2-H）；不同株
系叶缘锯齿的变异也表现出多样性，DH3-3株系为
圆齿状
（图
2-A），DH3-8，DH3-6株系为锯齿状
（图
2-C，E），DH3-4，DH3-2株系为重锯齿状
（图
2-B，
H）；就叶色而言，DH3-3，DH3-4，DH3-1株系叶色
较深（图2-A，B，D）。
综上所述，DH3-3，DH3-4，DH3-8株系的叶片
宽度、长度、叶柄长度优于其他株系，所以，DH3-3，
DH3-4，DH3-8株系的综合性状较好。丹霞苹果纯
合基因型株系的叶基、叶尖、叶片形状、叶缘、叶色
具有差异性，就叶片的形态而言，每个株系均具有
窑415窑
（
山西农业科学2019年第47卷第3期
唯一性。
2.3再生植株移栽分析
丹霞苹果纯合基因型株系移栽过程如图3所
示。温室中闭盖放置5～7d，开盖加入蒸馏水放置
（图
3-A）2～3d，植株在炼苗过程中死亡，没有株系
（图
3-B，成活。开盖后直接移栽植株生长状态较好
的根数最多、根
长最长，
DH3-1，DH3-3，DH3-6株
系的根长、根数次之
。
DH3-3，DH3-4，DH3-8株系
不同株
的叶片宽度、长度、叶柄长度优于其他株系
。
如
系的叶缘、叶色、叶片形状等也存在差异，其中，
叶色较
DH3-3株系叶基为楔形、叶片形状为卵形
、
叶
深、叶缘锯齿为圆齿状
；
DH3-4株系叶基宽楔形
、
C），
有
3个株系成活，
成活率达到
37.50％。
3讨论
苹果花药培养是指将发育到一定阶段的花药
在消毒处理后接种到人工培养基上
，花药培养获得
单倍体植株有2种途径：一是花药改变原来的发育
过程直接形成胚状体，经培养后形成再生植株
（胚
胎发生系统）；二是诱导花药增殖形成愈伤组织，再
诱导分化成胚状体，继而形成单倍体植株（器官发
生途径）。由于受花粉壁等体细胞的干扰，所以通过
花药培养技术获得的再生植株可能是杂合植株，因
此，花药培养再生植株需要经同工酶、S等位基因、
分子标记等方法进行纯合性鉴定。H魻FER等
[20]
选用
磷酸葡萄糖异构酶（PGI）、苹果酸脱氢酶（MDH）对
苹果花药培养再生植株进行同工酶分析，经鉴定获
得的植株均为单倍体来源。SSR分子标记法目前应
用较为广泛
，
H魻FER等
[13]
通过SSR标记证明，Piri-
na，Rene苹果花药培养再生新种质的纯合性。温鑫
等
[16]
利用来自HISDAS的130个SSR标记对嘎啦、
丹霞、富士3个苹果品种的花药培养再生植株进行
PCR，筛选出可区分再生植株为纯合基因型的SSR
标记。本研究丹霞的8个花药培养再生植株经SSR
鉴定均为纯合基因型
[16-17]
。
VANWYNSBERGHE等
[21]
研究表明，
苹果花药
来源纯合基因型株系生长较慢
，部分品系发生异常
分枝，花粉发芽率差
，果实显著变小。
H魻FER等
[20]
研
究发现，与供体植株相比，
苹果花药来源的植株移
栽到田间后树和花的形态学发生改变
。本研究中，
丹霞苹果纯合基因型8个株系的根系形态特征
、叶
片形态特征表现出明显差异。DH3-4，DH3-8株系
窑416窑
尖为锐尖，叶片形状为卵形
、叶色较深、叶缘锯齿为
重锯齿状
；
DH3-8株系叶基为楔形、
叶尖为渐尖，叶
片形状为椭圆形、叶缘为锯齿状
。苹果花药来源株系
表型多样性可能是由于潜在隐性基因表达
，每个株
系含有不同的基因型，进而表现出不同的性状
[20]
。
本研究进行炼苗时采用2种方法，分别为开盖
后直接移栽和温室中闭盖放置5～7d，开盖加入蒸
馏水后放置2～3d移栽。其中，开盖后直接移栽成
活株系为3株，成活率达到37.50％；温室中闭盖放
置5～7d，开盖加入蒸馏水后放置2～3d移栽
，成
活率为0。开盖后直接移栽比开盖放置2～3d后移
栽成活率高，可能是由于开盖放置2～3d的过程
中，瓶盖去掉后叶片水分严重散失而导致植株很快
枯萎，若只将盖拧松而不全部去掉
，培养基霉菌繁
殖致使植株死亡。开盖后直接移栽到含有草炭
、蛭
石、珍珠盐的基质中，然后在刚移栽的植株外罩上
透明杯，可以避免霉菌繁殖
，减少植株水分散失。谢
璇等
[22]
以红富士苹果组培苗为试材
，采用水培炼苗
的方法，即将组培苗闭瓶培养在改良的霍格兰德营
养液中（霍格兰德配方用量减少1/2
[23]
），室内自然
光下培养14d后，再用改良的霍格兰德全营养液开
瓶炼苗21d后移栽，这种方法提高了移栽成活率。
也有研究表明，水培炼苗可避免培养基干裂、霉菌
过多繁殖，锻炼组培苗根系的吸水能力，使移栽成
活率提高
[24-25]
。
4结论
丹霞苹果花药培养获得的8个纯合基因型株
系中，DH3-3，DH3-4，DH3-8株系优于同一品种其
他株系（根系较长、数量较多
，叶片宽度、长度、叶柄
长度较长
）。
丹霞苹果纯合基因型株系的叶缘
、叶
色、叶尖、叶基、叶片形状表现出明显差异。丹霞苹
果纯合基因型株系不经过炼苗而直接移栽植株生
长状态更好
。
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窑417窑
2024年5月27日发(作者：汲浩荡)
山西农业科学2019，47（3）：413-417
doi:10.3969/.1002-2481.2019.03.26
JournalofShanxiAgriculturalSciences
丹霞苹果纯合基因型株系形态学分析
石江鹏
1
袁张春芬
2
袁邓舒
2
袁侯丽媛
3
袁肖蓉
2
袁李芙蓉
1
袁董艳辉
3
袁聂园军
4
袁曹秋芬
1袁3
（1.山西大学生物工程学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院果树研究所，山西太原030031；
3.山西省农业科学院生物技术研究中心，山西太原030031；4.山西省农业科学院农业资源与经济研究所，山西太原030031）
摘要院丹霞苹果花药培养获得来自不同花粉粒的纯合基因型株系，这些纯合基因型株系的叶片形态特征、根系
苹果花药培养试管苗与供体
形态特征等具有差异性，选育出具有优良性状的株系对苹果种质创新具有重要意义
。
探究
丹霞苹果纯合基因型株系的移栽条件是进行新种质试管苗相比更加脆弱，在移栽过程中不容易存活
。因此，
以
8个丹霞苹果纯合基因型株系为材料，
叶片形态特征，选出具
选育的关键性一步
。
通过观察分析根系生长特性
、
结果表明，根数、叶长度、叶
有优良性状的株系，同时筛选再生株系的移栽条件
。
丹霞苹果纯合基因型株系的根长
、
叶宽度、叶长度、叶
宽度、叶柄长度、叶缘、叶色等表现出明显差异，DH3-3，DH3-4，DH3-8株系的根系生长状态
，
丹霞
苹果纯合基因型株系直接移栽的植株生长状态良好
。
柄长度显著优于其他株系
；
形态学分析
关键词院丹霞苹果；花药培养；纯合基因型
；
中图分类号院S661.1文献标识码院A文章编号院1002-2481（2019）03-0413-05
MorphologicalCharacteristicsAnalysisofDanxiaAppleHomozygousGenotypeLines
SHIJiangpeng
1
，ZHANGChunfen
2
，DENGShu
2
，HOULiyuan
3
，XIAORong
2
，LIFurong
1
，
3
DONGYanhui
3
，NIEYuanjun
4
，CAOQiufen
1，
ShanxiUniversity，Taiyuan030006，China；uteofPomology，ShanxiAcademyofAgricultural
（
eofBiologicalEngineering，
Sciences，Taiyuan030031，China；chCenterofBiotechnology，ShanxiAcademyofAgriculturalSciences，Taiyuan030031，
China；uteofAgriculturalResourcesandEconomy，ShanxiAcademyofAgriculturalSciences，Taiyuan030031，China
）
Abstract：Homozygousgenotypelinescomefromdifferentpollengrainscanbeobtainedbyappleantherculture,andleafandroot
morphologicalcharacteristicsofthesehomozygouslinesisdifferent,sotheselineswithgoodtraitsforapplegermplasminnovationhave
ttubeseedlingofappleanthercultureismorefragilethanthoseofdonor,itisdifficultytoremainsalivein
akeysteptoexploretransplantconditionsofDanxiaappleantherculturetube-plantsforbreeding
work,ntheobservationand
analysisrootgrowthcharacteristicsandleafmorphology,weselectedlineswithgoodcharacters,andthesuitabletransplantconditions.
ThemorphologicalfeaturesofultsshowthatDanxia
applehomozygousgenotypeslinescanbetransplantedinthefieldgrowedwell.
Keywords：Danxiaapple；antherculture；homozygousgenotype；morphologicalanalysis
大多数温带水果的特
苹果为温带水果的一种，
童期长达
5～7d，点是育种周期长
，
高度杂合且异
花授粉，通过传统育种手段改变性状遗传信息需要
花费大量的时间，育种目标也具有随机性
[1]
。单倍体
育种是现代育种的一项重要手段，通过雄核离体培
养（花药培养、花粉培养）和雌核离体培养（未授粉
子房或胚珠、辐照花粉培养等）等方法诱导产生具
再利用秋水仙素诱导
有单套染色体的单倍体植株
，
收稿日期院2018-10-22
（
Double等方法进行染色体加倍形成双单倍体
扩大
Haploid，DH）纯合再生株系，可提高育种效率
、
亲本选择范围、减少基因重组数量
[2]
。单倍体和双单
倍体作为基础研究材料，在突变的研究中可用于筛
选隐性突变体，可以提高遗传分析、图谱构建、基因
定位的效率及降低基因组测序成本
[3]
。单倍体育种
丰富了种质资源，加快了育种进程，在科学研究中
具有重要意义
[4]
。
基金项目院国家自然科学基金项目
（
31372033）；山西省国际合作项目
（
201603D421001）；山西省青年科技研究基金项目
（
2016zyzx35）（201502115，201701D221168）；山西省农业科学院种业发展专项
作者简介院石江鹏（1992-），女，山西忻州人，硕士，研究方向：苹果种质资源创新。张春芬同为第一作者。曹秋芬为通信作者。
窑413窑
山西农业科学2019年第47卷第3期
果树花药培养开始于20世纪70年代，目前已
在梨
[5]
、枣
[6]
、柑橘
[7]
、草莓
[8]
等多种植物中获得了成功
元帅苹果花药
应用
。
1981年，国内获得了黄太平
、
培养再生植株
[9-10]
。TSUKUNI等
[11]
和OKADA等
[12]
成
利用
SSR分子标功获得苹果花药培养再生植株后
，
并对纯合再生株系进行
记技术检测再生植株来源，
苹果
形态学观察
。
H魻FER等
[13]
经过多年研究得出
，
花药培养所得纯合再生植株与杂合供体相比结实
率较低，且形态特征发生了改变
。在此基础上，
DH3-2，DH3-3，DH3-4，DH3-5，DH3-6，DH3-7，
DH3-8株系为材料
[16]
。
1.2
1.2.1
试验方法
根系的诱导及测定从继代组培苗中选取
（
1/2生长旺盛的再生植株接种于生根诱导培养基
MS＋2.0mg/LIBA＋2％蔗糖＋0.6％琼脂）。
每个株
（
25℃3000lx；系接种15株，置于温室光照培养光
照14h，黑暗10h；相对湿度70％），40d后选取5个
观察并测
植株用镊子挑选出培养基中的全部根系
，
ZHANG等
[14]
研究发现，处于单核晚期或双核早期
的小孢子可显著提高苹果花药培养胚状体诱导率
，
对花药进行4℃低温预处理20～30d，胚状体诱导
率呈上升趋势
。罗慧珍等
[15]
通过转录组测序的方法
分析低温诱导对苹果花药基因的调控
，结果表明，
蔗糖、淀粉生物合成、植物激素信号转导相关基因
的表达变化是影响小孢子获得胚性潜能的关键。
温
鑫等
[16]
利用流式细胞仪对苹果花药离体培养获得
再生植株进行倍性分析
，再选用苹果
SSR（HIDRAS）
标记鉴定再生植株基因型
，经检测，再生株系全部
为纯合基因型，包括单倍体
、二倍体、四倍体。
国内外有关苹果花药培养的研究不断发展
，但
关于苹果花药培养再生植株移栽技术的相关研究
报道尚未得到大量有效的验证，因此探究苹果花药
培养试管苗的移栽条件可以更好地选出优良的苹
果新种质。
本研究以丹霞苹果花药培养的8个纯合再生
株系为材料
[16-18]
，每个纯合再生植株均由不同的花
粉粒分化而来，因此，不同的株系根系生长状态、叶
片形态特征具有差异性。通过对每个株系试管苗的
根系生长特性、叶片形态特征进行观察分析，选出
具有优良性状的株系，对苹果种质资源创新具有重
要意义
。
1材料和方法
1.1试验材料
采集山西省农业科学院果树研究所苹果基地
的丹霞苹果品种的健壮花蕾，
将其经低温预处理、
消毒，在无菌操作台中将花药接种于胚状体诱导培
养基
（
N6＋2.0～3.0mg/L6-BA＋0～0.15mg/L
NAA），
于
25℃在恒温培养箱暗培养
。将长至
1cm
左右的胚状体转入胚状体分化培养基
（
MS＋1.0～
5.0mg/L6-BA＋0.1～0.3mg/LIBA＋3％蔗糖＋0.6％
琼脂
），
20d左右分化出幼芽。经继代培养获得再
生植株
[1]
。本研究以丹霞苹果纯合基因型DH3-1，
窑414窑
定根的长度和根的数量
，拍照记录。
1.2.2叶片性状的观察及测定从生根试管苗中
选取叶片充分展开和成熟的植株
（茎中部叶片），每
个株系取5个植株，每株选取3个叶片，每个株系
共测量15个叶片。将叶片用清水洗干净后铺平放
入含有滤纸的自封袋中，注明株系号
。测量每个叶
片的叶长度、叶宽度（最大叶宽度
）、叶柄长度。计算
叶形指数（
叶长度
/叶宽度）。观察叶色
、叶缘变异，
并拍照。观察记载方法参照
《果树种质资源描述符
：
记载项目及评价标准
》
[19]
进行
。
1.2.3再生植株移栽技术研究选择生根培养基
上生长茁壮的苗，即叶色浓绿，根系发达，以在组培
瓶中株高较高的为佳。将组培苗进行炼苗，炼苗方
法设2个处理，分别为开盖后直接移栽和温室中闭
盖放置5～7d，开盖加入蒸馏水放置2～3d后移
栽，每个处理5个植株。移栽时先把基质（草炭∶蛭
石∶珍珠盐为1∶1∶1）装至盆的4/5，将取出的试
管苗在清水中洗净根部残留的琼脂后移栽进基质
中，立即用清水浇透，并罩上透明杯，注明移栽日期
和株系号。置于光照培养箱，15d后去掉透明杯，每
周浇一次营养液（1/2MS＋2mg/LIBA）。
1.3数据统计分析
采用MicrosoftExcel2010软件进行原始数据
整理和统计分析
，使用
SPSS20.0软件对不同处理
进行多重比较、单因素方差分析
，显著性水平设定
为琢＝0.05，图表中所有数据均为3个重复的平均
数±标准误
。
2结果与分析
2.1不同株系根系形态特征分析
通过对丹霞苹果纯合基因型株系的根系形态
进行分析
（表
1、图1），结果表明
，
DH3-8，DH3-4株
系的根数、根长显著高于其他6个株系
（
P＜0.05），
根长分别为26.53，27.70cm，根数分别为39.00，
51.67个（
图
1-A，B）；DH3-1，DH3-3，DH3-6株系的
石江鹏等：丹霞苹果纯合基因型株系形态学分析
根长、根数无显著差异
（
P＞0.05），
与
DH3-4，DH3-8
相比显著减小
，根长为
16.67～20.50cm，根数为
13.33～15.33个（
图
1-C～E）；DH3-2，DH3-5，DH3-7
株系的根长、根
数与其他
5个株系相比显著较小
（P＜0.05）（
图
1-F～H），其中，DH3-7株系根长
、根
数最小，
分别为
7.67cm，4.33个（
图
1-H）。可见
，
丹
霞苹果纯合基因型8个株系的根系形态特征具有
差异性，DH3-4，DH3-8株系根的生长状态较好
。
表1丹霞苹果纯合基因型株系根系形态特征
株系
根长/cm根数/个
DH3-1
16.67±1.75b13.33±0.83b
DH3-2
9.07±1.15a7.67±0.83a
DH3-3
20.50±1.33b14.33±1.48b
DH3-4
26.53±1.02c39.00±1.53c
DH3-5
10.17±0.91a6.67±0.83a
DH3-6
19.13±1.56b15.33±0.83b
DH3-7
7.67±0.75a4.33±0.83a
DH3-8
27.70±1.18c51.67±1.87d
注：同列不同小写字母表示同一形态不同株系间差异显著（P＜
0.05）。
表
2同
。
2.2不同株系叶片形态特征分析
从表2可以看出，丹霞苹果纯合基因型株系的
叶片形态特征如叶片宽度、叶片长度、叶柄长度具
有明显差异，DH3-3，DH3-4株系的叶片宽度较宽，
分别为1.90，1.73cm（图2-A，B），显著宽于其他株
系
；
DH3-8，DH3-1，DH3-6，DH3-5株系间叶片宽
度无差异
（图
2-C～F），但显著宽于DH3-2株系
，
DH3-2株系叶片宽度仅为1.00cm（
图
2-H）。DH3-7
株系的叶片长度显著较短
，为
1.83cm（
图
2-G），
但
与其他7个株系的叶片长度未达到差异显著水平
。
不同株系具有不同的叶柄长度
，
DH3-3，DH3-8株
系的叶柄长度较长
，分别为
1.30，1.37cm（
图
2-A，
C），DH3-2株系的叶柄长显著最短
，为
0.47cm（
图
2-
H）。叶形指数在不同株系间表现差异显著
，
DH3-6
株系的叶形指数显著较大
，表明叶片为窄长形（图
2-
E），DH3-3株系的叶形指数显著最小
，表明叶片呈
阔圆形
（图
2-A），DH3-1，DH3-5株系的叶形指数
差异不显著，二者的叶片形状相似
（图
2-D，F）。
表2丹霞苹果纯合基因型株系叶片形态特征比较
株系
叶宽/cm叶长/cm叶柄长/cm叶形指数
DH3-1
1.43±0.53c2.50±0.64b1.00±0.46bc1.74±1.20cd
DH3-2
1.00±0.46a1.90±0.46ab0.47±0.39a1.90±1.00e
DH3-3
1.90±0.46d2.20±0.52a1.30±0.46de1.12±1.15a
DH3-4
1.73±0.63d2.33±0.59ab1.17±0.54cd
1.35±0.94b
DH3-5
1.23±0.54abc2.17±0.67ab0.50±0.46a1.76±1.26d
DH3-6
1.20±0.59abc2.67±0.67b0.83±0.39b
2.22±1.15g
DH3-7
1.13±0.39ab1.83±0.54ab0.60±0.46a
1.62±1.38c
DH3-8
1.30±0.46bc
2.73±0.63b
1.37±0.54e
2.10±1.36f
叶缘、叶色、叶片形状等的变异，
不同的株系表
现不一致
。
DH3-3株系叶基为楔形
（图
2-A），
DH3-4株系为宽楔形
（图
2-B），
而
DH3-6株系的
叶基为偏斜
（图
2-E）；从叶尖来看
，
DH3-4，DH3-7
株系的叶尖为锐尖
（图
2-B，G），DH3-3，DH3-8，
DH3-6株系的为渐尖
（图
2-A，C，E），DH3-1，
DH3-5株系为突尖
（图
2-D，F），DH3-2株系叶尖
呈撕裂状
（图
2-H）；分析每个株系的叶片形状
，
DH3-3，DH3-4株系叶片形状为卵形
（图
2-A，B），
DH3-8，DH3-1，DH3-6，DH3-5，DH3-7为椭圆形
图2-C～G），DH3-2为畸形叶片
（图
2-H）；不同株
系叶缘锯齿的变异也表现出多样性，DH3-3株系为
圆齿状
（图
2-A），DH3-8，DH3-6株系为锯齿状
（图
2-C，E），DH3-4，DH3-2株系为重锯齿状
（图
2-B，
H）；就叶色而言，DH3-3，DH3-4，DH3-1株系叶色
较深（图2-A，B，D）。
综上所述，DH3-3，DH3-4，DH3-8株系的叶片
宽度、长度、叶柄长度优于其他株系，所以，DH3-3，
DH3-4，DH3-8株系的综合性状较好。丹霞苹果纯
合基因型株系的叶基、叶尖、叶片形状、叶缘、叶色
具有差异性，就叶片的形态而言，每个株系均具有
窑415窑
（
山西农业科学2019年第47卷第3期
唯一性。
2.3再生植株移栽分析
丹霞苹果纯合基因型株系移栽过程如图3所
示。温室中闭盖放置5～7d，开盖加入蒸馏水放置
（图
3-A）2～3d，植株在炼苗过程中死亡，没有株系
（图
3-B，成活。开盖后直接移栽植株生长状态较好
的根数最多、根
长最长，
DH3-1，DH3-3，DH3-6株
系的根长、根数次之
。
DH3-3，DH3-4，DH3-8株系
不同株
的叶片宽度、长度、叶柄长度优于其他株系
。
如
系的叶缘、叶色、叶片形状等也存在差异，其中，
叶色较
DH3-3株系叶基为楔形、叶片形状为卵形
、
叶
深、叶缘锯齿为圆齿状
；
DH3-4株系叶基宽楔形
、
C），
有
3个株系成活，
成活率达到
37.50％。
3讨论
苹果花药培养是指将发育到一定阶段的花药
在消毒处理后接种到人工培养基上
，花药培养获得
单倍体植株有2种途径：一是花药改变原来的发育
过程直接形成胚状体，经培养后形成再生植株
（胚
胎发生系统）；二是诱导花药增殖形成愈伤组织，再
诱导分化成胚状体，继而形成单倍体植株（器官发
生途径）。由于受花粉壁等体细胞的干扰，所以通过
花药培养技术获得的再生植株可能是杂合植株，因
此，花药培养再生植株需要经同工酶、S等位基因、
分子标记等方法进行纯合性鉴定。H魻FER等
[20]
选用
磷酸葡萄糖异构酶（PGI）、苹果酸脱氢酶（MDH）对
苹果花药培养再生植株进行同工酶分析，经鉴定获
得的植株均为单倍体来源。SSR分子标记法目前应
用较为广泛
，
H魻FER等
[13]
通过SSR标记证明，Piri-
na，Rene苹果花药培养再生新种质的纯合性。温鑫
等
[16]
利用来自HISDAS的130个SSR标记对嘎啦、
丹霞、富士3个苹果品种的花药培养再生植株进行
PCR，筛选出可区分再生植株为纯合基因型的SSR
标记。本研究丹霞的8个花药培养再生植株经SSR
鉴定均为纯合基因型
[16-17]
。
VANWYNSBERGHE等
[21]
研究表明，
苹果花药
来源纯合基因型株系生长较慢
，部分品系发生异常
分枝，花粉发芽率差
，果实显著变小。
H魻FER等
[20]
研
究发现，与供体植株相比，
苹果花药来源的植株移
栽到田间后树和花的形态学发生改变
。本研究中，
丹霞苹果纯合基因型8个株系的根系形态特征
、叶
片形态特征表现出明显差异。DH3-4，DH3-8株系
窑416窑
尖为锐尖，叶片形状为卵形
、叶色较深、叶缘锯齿为
重锯齿状
；
DH3-8株系叶基为楔形、
叶尖为渐尖，叶
片形状为椭圆形、叶缘为锯齿状
。苹果花药来源株系
表型多样性可能是由于潜在隐性基因表达
，每个株
系含有不同的基因型，进而表现出不同的性状
[20]
。
本研究进行炼苗时采用2种方法，分别为开盖
后直接移栽和温室中闭盖放置5～7d，开盖加入蒸
馏水后放置2～3d移栽。其中，开盖后直接移栽成
活株系为3株，成活率达到37.50％；温室中闭盖放
置5～7d，开盖加入蒸馏水后放置2～3d移栽
，成
活率为0。开盖后直接移栽比开盖放置2～3d后移
栽成活率高，可能是由于开盖放置2～3d的过程
中，瓶盖去掉后叶片水分严重散失而导致植株很快
枯萎，若只将盖拧松而不全部去掉
，培养基霉菌繁
殖致使植株死亡。开盖后直接移栽到含有草炭
、蛭
石、珍珠盐的基质中，然后在刚移栽的植株外罩上
透明杯，可以避免霉菌繁殖
，减少植株水分散失。谢
璇等
[22]
以红富士苹果组培苗为试材
，采用水培炼苗
的方法，即将组培苗闭瓶培养在改良的霍格兰德营
养液中（霍格兰德配方用量减少1/2
[23]
），室内自然
光下培养14d后，再用改良的霍格兰德全营养液开
瓶炼苗21d后移栽，这种方法提高了移栽成活率。
也有研究表明，水培炼苗可避免培养基干裂、霉菌
过多繁殖，锻炼组培苗根系的吸水能力，使移栽成
活率提高
[24-25]
。
4结论
丹霞苹果花药培养获得的8个纯合基因型株
系中，DH3-3，DH3-4，DH3-8株系优于同一品种其
他株系（根系较长、数量较多
，叶片宽度、长度、叶柄
长度较长
）。
丹霞苹果纯合基因型株系的叶缘
、叶
色、叶尖、叶基、叶片形状表现出明显差异。丹霞苹
果纯合基因型株系不经过炼苗而直接移栽植株生
长状态更好
。
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