你的位置：首页 > IT圈 > 大刍草SAMS1基因克隆与生物信息学分析

大刍草SAMS1基因克隆与生物信息学分析

IT圈 admin 2024-05-28 57浏览 0评论

2024年5月28日发(作者：畅闲静)

基因组学与应用生物学，2020年，第39卷，第12期，第5660-5668页

研究报告

Research

Report

大刍草

&4MS7

基因克隆与生物信息学分析

张玉荣1杨雅舒1申圣圣1王陆军2郭虹霞2邓妍2王创云2•杨利艳”

1山西师范大学生命科学学院，临汾，041004; 2山西省农业科学院作物科学研究所，太原，030031

* 共同通信作者,*************;**********************

摘要

-腺苷甲硫氨酸合成酶(&4

)基因催化甲硫氨酸和

合成

-腺苷甲硫氨酸，这是目前研究发

现的体内

-腺苷甲硫氨酸(

)合成的唯一途径，从

基因在植物生长发育、新陈代谢以及逆境胁迫响应

过程中有着十分重要的作用。本研究对大刍草&4

/基因进行了克隆，并利用生物信息学工具分

析了

BtSAMSl

蛋白及与其基因序列相似性超过85%的7种其他物种

SAMS

蛋白。结果显示,&

7基因

全长1 185

,编码394个氨基酸残基，是位于细胞质中的稳定亲水性蛋白。二级结构主要由无规则卷曲组

成，比例大于50%。从三级结构模型来看，蛋白质的结构为四聚体。其他7种蛋白质与

BtSAMSl

蛋白在理化

性质及结构中都存在较高的相似性，表明

关键词大刍草

AMS

蛋白具有高度保守性。

,基因克隆，生物信息学

Cloning and Bioinformatics Analysis of SAMS1 Gene in Balsas Teosinte

Zhang

Yurong

Yang

Yashu

Shen

Shengsheng

Wang

Lujun

Guo

Hongxia

Deng

Yan

Wang

Chuangyun

030031

*Co-correspondingauthors,*************;**********************

DOI: 10.13417/.039.005660

Abstract

S-Adenosylmethionine

Synthase

(

Yang

Liyan

1 School of Life Sciences, Shanxi Normal University, Linfen, 041004; 2 Institute of Crop Science, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan,

SAMS

)

gene

catalyzes

the

synthesis

S-Adenosylmethionine

with

thionine

and

ATP

substrate

which

the

only

way

synthesize

S-Adenosylmethionine

(

SAM

)

vivo

SAMS

plays

important

role

plant

growth

and

development

metabolism

and

stress

response

this

study

the

SAMS

gene

Balsas

teosinte

{

BtSAMSl

)

was

cloned

and

the

BtSAMSl

protein

and

other

SAMS

proteins

from

species

were

analyzed

with

bioinformatics

tool

The

results

showed

that

BtSAMSl

was

1 185

encoding

394

amino

acid

residues

and

the

protein

was

stable

hydrophilic

whose

sequences

are

than

85%

similar

BtSAMS

protein

located

cytoplasm

Its

secondary

structure

mainly

composed

irregular

curls

and

the

proportion

than

50%.

According

the

tertiary

structure

model

the

structure

protein

tetramer

The

other

seven

proteins

are

highly

similar

BtSAMSl

proteins

their

physical

and

chemical

properties

and

structures

which

indicates

that

SAMS

proteins

are

highly

conserved

Keywords

Balsas

teosinte

SAMS

Gene

cloning

Bioinformatics

大会草

（Zea

mays

ssp

rig

)为禾本科植实验证明，大会草是现代栽培玉米的最直接的野生近

物蜀黍属的一年生草本植物。系统进化分析以及分子缘种(

Matsnolcaetal

.,2002)。大刍草有许多优良性状，

基金项目：本研究由山西省重点研发计划项目

(201703D22100

卜

、院士工作站项目

(TYYSZ201707)

、公益性行业

(

农业)科研专

项

(201503124)

、院农业科技创新研究课题

(YCX2018404)

和三晋学者支持计划专项

(2090101

)共同资助

引用格式

：Zhang Y.R.，Yang Y.S.，Shen S.S., Wang LJ” Guo H.X_, Deng Y.，Wang C.Y” and Yang L.Y., 2020, Cloning and bioin-

formatics analysis

of SA MSI

gene clone in Balsas teosinte, Jiyinzuxue Yu Yingyong Shengwuxue (Genomics and Applied Biology), 39

(12): 5660-5668 (

张玉荣，杨雅舒，申圣圣，王陆军，郭虹霞，邓妍，王创云，杨利艳

,2020,

大刍草从

/基因克隆与生物信息学分

析，基因组学与应用生物学，

39(12): 5660-5668)

大刍草基因克隆与生物信息学分析5661

如耐盐、抗病虫害

(Bemal

.，2015)，是玉米遗传改

结合，从而调节

DNA

、

RNA

和蛋白质的生物合成，有

良的珍贵种质资源。在前期对大刍草响应粘虫的研究

促进生长、稳定膜结构、延缓衰老和增强抗逆性的作

中，发现

_腺昔甲硫氨酸合成酶1(8-3(^1105>^111611^0- 用。王欣(2007)以不同品种白菜进行抗虫性分析时发

nine

synthase

SAMS

1)基因表达量在粘虫取食后显著

现白菜的抗虫性强弱与腐胺含量呈正相关，抗虫品种

上调，因此推测其可能参与了对害虫的防御响应。本

腐胺含量高，感虫材料腐胺含量偏低，而多胺的其他

研究克隆获得了大刍草&4

7基因，并对&4

7的

两个成分亚精胺和精胺的含量与抗虫性之间无规律

生物信息学进行了分析。

性。张志春(2009)发现多胺对小菜蛾嗅觉相关蛋白基

-腺苷甲硫氨酸合成酶(

S-adenosylmethionine

因表达量存在影响，且交配前后的小菜蛾对精胺、亚

synthase

S/l

)基因以甲硫氨酸(

Met

)与

ATP

为底物

精胺、腐胺均存在显著的趋避行为。

催化合成

-腺苷甲硫氨酸(

SAM

)，这是目前研究发

乙烯是一种植物激素，参与植株的各个生命周期

现的体内

-腺苷甲硫氨酸(

SAM

)合成的唯一途径

生长发育以及各种应激反应，包括细胞伸展、果实成

(Mato

.，1997)。

SAM

在植物生理代谢中发挥着

熟、叶片脱落、花衰老、病原体侵染、机械创伤、盐胁

重要的作用，它在甲基转移酶(

)的作用下为

DNA

、

迫和低温胁迫等。当植物遭受生物胁迫，如病原体、虫

蛋白质提供甲基基团，参与转硫过程从而合成谷胱

害时，能加速乙烯生物合成速率，导致乙烯释放速率

甘肽，也是转氨丙基过程中合成多胺的前体分子，还参

增加，并且诱导多种植物病程相关蛋白基因的表达，

与乙烯的分子合成(图1)，这些物质均与植物的抗虫

对植物抗病原防御有非常重要的作用

(Ohtsubo

响应有关。

1999)。番茄被黄单胞菌侵染时，乙烯释放量和乙烯

多胺是一类具有生物活性的低分子脂肪族含氮

合成关键基因

0 (1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化

碱,普遍存在于植物的根、茎、叶、花、果实、种子、块

酶)表达量增加，但在甲基杆菌和黄单胞菌同时侵染

茎和胚中，其主要合成前体是精氨酸、赖氨酸和甲硫

时，乙烯释放量和

ACO

基因表达量降低

(Yim

.，

氨酸(

Paiketal

.，1975)。多胺在生理

值下以多聚阳

2014),即不同的生物胁迫对乙烯合成量和合成关键

离子状态存在的，极易与带负电荷的核酸和蛋白质相

基因表达量存在不同影响。

胱硫醚裂解酶

亚精胺.精胺

Spermidine, spermidine

图

1 SAM

的代谢途径

Figure 1 Metabolic pathway of SAM

5662 基因组学与应用生物学

研究发现，在乙烯信号传导途径中,

EIN

2蛋白对

激发乙烯相关的防卫反应是必需的。

Liu

等

poll

)报

道，拟南芥

EIN

2功能缺失突变体在病原菌侵染或害

虫侵染时，其生长发育比对照组矮小。

Kettles

等(2013)

发现乙烯

EIN

2突变体植株上蚜虫虫口数较多，蚜虫

对突变体植株偏好性强于普通植株，说明乙烯相关防

卫信号通路对于植物抗虫性有一定的调控作用。

本研究将通过生物信息学的方法对大刍草

/及与其序列相似性大于85%的其他7个

基因的氨基酸组成，疏水性，亚细胞定位，二级

结构以及三级结构等进行预测和分析,为进一步探索

基因的功能提供理论依据。

10 000 bp

8 000 bp

6 000 bp

(KK) bp

4 000 bp

3 500 bp

3 000 bp

2 500 bp

2 000 bp

500

1 200 bp

1 (KH) bp

900

S00 bp

700 bp

600

500 bp

400 bp

3(H) bp

200 bp

100 bp

图

份基因全长克隆

Figure 3 Full-length cloning of

BtSA MSI

SbSAMSl

关系较近，与

PpSAMS

丨关系最远。

1.3

BtSAMSl

tSAMSl

蛋白结构的分析

蛋白的一级结构和理化性质分析

1结果与分析

1.1

/&4

1.3.1

7基因的克隆

将所提取的

以1%的琼脂糖凝胶进行检测

蛋白质的基本性质主要包括其相对分子质量、等

电点和氨基酸组成等(蒋彦，2003,清华大学出版社，

.1-255)。利用在线程序

ProtParam

对

(图2)，并使用超微量紫外分光光度计对

cDNA

CDS

进行浓

8个

SAMS

度定量测定，其中

260/

280均在1.9〜2.1之间。以

为模板，利用设计好的引物对份&4

7基因

进行巢氏

PCR

克隆扩增，获得基因

CDS

,之后

基因

CDS

蛋白质理化性质进行预测分析(表1),结果表明，价-

S/l

将

BtS

lMSV

序列上传至

NCBI,GenBank

/、

2 这 8 个

S/l

基因的等

电点均小于6,因此为酸性氨基酸从主要氨基酸组成

登录号为

894430。巢氏

产物以1%的琼脂糖

看出，8种蛋白质中均是甘氨酸

Gly

含量最高。这8个

蛋白质的不稳定系数均小于40,均为稳定蛋白，平均

凝胶进行检测，出现一条单一的条带(图

即均为亲水性蛋白。

基因片段采用柱式

DNA

胶回收试剂盒回收纯化，

亲水系数都为负值，

之后将其与

PMD

-18

载体连接转化后进行菌落

1.3.2

SAMS

蛋白的疏水性分析

PCR

鉴定，送往上海生工进行测序，测序结果与及-

/基因序列一致(图4)。

tSAMSl

利用

ExPASy

分析氨基酸序列的疏水性,对氨基

酸序列进行疏水性分析采用

Kyte

Doolittle

方法。观

1.2

的同源性分析及系统发育树的构建

ncbi

njm

nih

gov

/)的

Blast

察疏水峰值和亲水峰值的氨基酸所长的百分率，疏

水峰值大于0的氨基酸所占的比例超过50%,可以认

为氨基酸合成的整个蛋白质表现出疏水性，反之为亲

水性。由平均亲水系数可得，8个

SAMS

蛋白均为亲水

蛋白，其中

，PdSAMS

1平均亲水系数最小

,BdSAMS

的平均亲水系数最大，说明

BdSAMSl

dSAMSl

通过

NCBI

(

https

://

比对，这7个不同物种的

基因与及

7基因

序列相似性不低于85%。利用

MEGA

5.0构建系统发

育树（图5),这8个不同&4

ZmSAMSI

基因中，

BtSAMSl

与

属于一个分支，亲缘关系最近。其次，与

的亲水性最强，

的亲水性最弱(图6)。

蛋白亚细胞定位分析

1.3.3

SAMS

利用在线程序

对8种

SAMS

蛋白进行

亚细胞定位分析(表2),这8种蛋白质均主要在细胞

质中发挥其作用。对8种蛋白质进行信号肽和跨膜结

构域进行检测，发现这8种蛋白质既不是分泌蛋白，

也不是膜蛋白，它在细胞中合成，这和亚细胞定位分

析结果一致，表明其主要功能场所为细胞质。

图

2 RNA

的检测

Figure 2 Detection of RNA

1.3.4

SAMS

蛋白的二级结构预测

蛋白质的二级结构是指蛋白质多肽链本身的折

大刍草基因克隆与生物信息学分析5663

|||||||||^|

|||||||||||

||1|||

|||||||

|||||

||||||||

||1|||||

||||||

图

4 BtSAMSl

的菌落

PCR

鉴定

Figure 4 Identification of BtSAMSl by colony PCR amplificaion

表

1 SAMS

蛋白质的理化性质分析

Table 1 Analysis of physical and chemical properties of SAMS proteins

蛋白名称

分子量

(kD)

理论等电点

主要氨基酸

(％)

不稳定系数

脂肪系数

平均亲水性

Protein

Molecular

Theoretical pi

Amino acid (%)

Instability

AliphaticGrand average of

name

weight (kD)

index

hydropathicity

BtSAMSl

42 776.485.57

Gly (9.6) Val (9.1) Ala (8.1) 22.63

83.12-0.229

Asp (8.1) Thr (7.1)Lys (6.9)

ZmSAMSl

42 772.475.59

Gly (9.6) Val (9.1) Ala (8.1)

23.74

81.14

-0.250

Asp (7.9) Thr (7.4) Lys (6.9)

SiSAMSl

48 163.88

5.98

Gly (8.8) Ala (8.6) Val (8.1) 26.74

83.39-0.243

Asp (7.5) Leu (7.0) Thr (7.0)

SbSAMSl

42 785.505.50

Gly (9.6) Val (9.1) Ala (8.1) 24.0682.13

-0.237

Asp (8.1) Thr (7.1) Lys (6.9)

BdSAMSl

42 776.585.52

Giy (9.6) Ala (8.4) Asp (8.4)

23.25

84.39-0.205

Val (8.1) lie (7.4) Thr (7.4)

PdSAMSl

43 368.08

5.68

Gly (9.1) Val (9.1) Asp (7.9) 24.61

79.39

-0.356

Thr (7.6) Ala (7.4)

PpSAMSl

43 222.125.60

Gly (9.7) Val(8.4) Thr (7.9)

25.04

78.12-0.322

Asp (7.6) Lys (7.4) Ala (7.1)

ObSAMS2

43 970.735.37

Gly (9.5) Asp (8.0) Ala (7.7)

28.72

79.53-0.306

Thr (7.5) Glu (6.7)

1001— BtSAMSl

L. ZmSAMSl

的排布位置。蛋白质的结构决定功能，因此预测和分

94 I------------- SbSAMAl

析蛋白质的三级结构对理解其结构与功能之间的关

I-------------------------- ObSAMS2

〇

l-------------- SiSAMSl

系有重大作用(汪家政和范明，2000)。通过在线程序

_________*----------------------------------- BdSAMSl

99l----------------------------------------------------------------------------- PdSAMSl

SWISS

MODEL

对这8种蛋白质的三维结构进行模拟

---------------------------------------------------------------------------------------------PpSAMSl

构建。这8种蛋白质的三维结构较为相似，表明

SAMS

0.02

蛋白具有较高的保守性,也进一步说明这些蛋白质的

图

5 SdWS7

基因的系统发育树

功能也具有一定的相似性(图8)。

Figure 5 Phylogenetic tree of

BtSAMSl

gene

讨论

叠和盘绕的方式，主要有

-螺旋、延伸链、无规则卷

曲三种形式,可利用

SOPMA

对其进行预测分析(表3)。

本研究对大刍草

7基因进行了克隆，获得

结果显示,8种蛋白质均是无规则卷曲所占比例最

了该基因的

CDS

序列。通过对同源性较高的8种

高。由8个

SAMS

蛋白二级结构预测结果(图7)可见，

SAMS

分析表明，

BtSAMSl

与

ZmSAMSl

属于一个

这8种蛋白质的二级结构具有较高的相似性，由此我

分支，亲缘关系最为接近。8种蛋白质的亲水值都为

们可以推断,

SAMS

蛋白的二级结构是比较保守的。

负值，均为容易接近水分子的水溶性蛋白，主要功能

BtSAMSl

与

ZmSAMSl

两者发生二级结构的氨基

场所为细胞质。对大肠杆菌

SAMS

蛋白结构研究发

酸残基位置最为接近，与

SbSAMSl

的氨基酸残基位

现，其蛋白质结构为六方体，由4个相同亚基组成：

置也比较接近^

两个亚基聚合成类似球形的二聚体，两个二聚体聚合

蛋白质的三级结构是指整条肽链中全部氨基酸

形成一个四聚体。每个二聚体都有两个活性位点，这

残基的相对空间位置，即肽链中所有原子在三维空间

两个活性位点位于两亚基之间。

5664基因组学与应用生物学

位置

Position

位置

Position

-Hphob. / Kyte & Doolittle

位置

Position

Hphob. / Kyle & Doolittle

位置

Position

位置

Position

位置

Position

• Hphob. / Kytc & Doolittle

Hphob. / Kyle & Doolittle

C/3

图

6 8

种

SAMS

蛋白疏水性预测分析

ft: A: BtSAMSl; B: ZmSAMSl; C: SiSAMSl; D: SbSAMSl; E: BdSAMSl; F: PdSAMSl; G: PpSAMSl; H: ObSAMS2

Figure 6 Prediction and analysis of hydrophobicity of 8 SAMS proteins

Note: A: BtSAMSl; B: ZmSAMSl; C: SiSAMSl; D: SbSAMSl; E: BdSAMSl; F: PdSAMSl; G: PpSAMSl; H: 0bSAMS2

表

2 8

种

SAMS

蛋白的亚细胞定位

Table 2 Subcellular localization of 8 SAMS protein

蛋白名称

Protein

name

BtSAMSl

ZmSAM 1

SiSAMSl

SbSAMSI

BdSAMSl

PdSAMSl

PpSAMSl

ObSAM2

域，

端结构域)组成，这三个域对称折叠成一个伪三超家族。二级结构主要由无规则卷曲组成，比例均大

倍的结构。对这8个蛋白质的保守结构域进行检测，发于50%。从三级结构模型来看，这8种蛋白质的结构

-1

位置

Position

位置

Position

细胞质

Cytoplasmic

细胞骨架

Cytoskeletal

细胞核

Nuclear

过氧化物酶体

Peroxisomal

线粒体

Mitochondrial

内质网

Endoplasmic

reticulum

56.5

69.6

56.5

65.2

52.2

56.5

17.4

13.0

17.4

13.0

17.4

13.0

4.3

17.4

13.0

17.4

21.7

17.4

21.7

17.4

4.3

每个亚基都是由3个域(

端结构域，中间结构现都拥有典型的

PLN

02243结构域，属于

PLN

02243

大刍草

SAMS

/基因克隆与生物信息学分析5665

表

3 8

种

SAMS

蛋白质的二级结构预测

Table 3 Prediction of secondary structure of 8 SAMS proteins

蛋白名称

螺旋

(％)

延伸链

(％)

无规则卷曲

(％)

ProteinAlpha helix (%)ExtendedRandom coil (%)

namestrand (%)

BtSAMSl24.1123.10

52.79

ZmSAMSl

23.6022.5953.81

SiSAMSl25.11

21.27

53.62

SbSAMSl24.3723.10

52.54

BdSAMS 124.6223.10

52.28

PdSAMS 1

22.5922.3455.08

PpSAMSl

28.24

20.61

51.15

ObSAMS223.6322.14

54.23

_ HI ■ ■

■，

丨

T^^

0 50 100 150 200 250 300 350

1 ■ill

■!

llhlBl H

i i

■liNl f

0 50 100 150 200 250 300 350

图

个蛋白质的三维结构

A: BtSAMSl; B: ZmSAMSl; C: SiSAMSl; D: SbSAMSl; E:

iniftn

"_十

BdSAMSl; F: PdSAMSl; G: PpSAMSl; H: ObSAMS2

0 50 100 150 200 250 300 353500 400

Figure 8 Three-dimensional structure of 8 proteins

Note: A: BtSAMSl; B: ZmSAMSl; C: SiSAMSl; D: SbSAMSl;

E: BdSAMSl; F: PdSAMSl; G: PpSAMSl; H: ObSAMS2

i ll

! >i

0 50

100

150 200 250 300 350

均为四聚体，表明

SAMS

蛋白结构具有保守性，这也

符合

Takusagawa

等（1996)的研究，即大多数

SAMS

蛋白质都是作为四聚体存在的。

0 50 100 150 200 250 300 350

近年来，

SAMS

基因己经在多个物种中发现

(Izhaki

etal

.，1995),植物体内存在多种类型的

SAMS

编码

基因

(Thomas

and

Surdin

, 1987)，它们的表达方式不

100

150 200 250 300 350

同，在植物代谢中也发挥着不同的生理功能。玉米数

据库中有4个

基因，

SAMS

家族基因在不同的

I 1 llhlt |4f-.

植物组织中表达量不同，根茎中的表达高于叶片中，

0 50 100 150 200 250 300 350

其中

SAMS

1、

SAMS

2、

SAMS

4的表达量在盐胁迫下

降低,

SAMS

3表达量在盐胁迫下几乎不发生变化(朱

♦■ItiB ■! iBliiif-w-4-

晶莹等,2011)。拟南芥

SAMS

家族中也存在4个成员

0 50 100 150 200 250 300 350

(Peleman

., 1989

; 1989

;

Goto

., 2002;

Mao

图

7 SAMS

蛋白的二级结构

., 2015)，它们的氨基酸序列相似程度接近90%,但其

注：中线：延伸链；短线：无规则卷曲；长线：

螺旋；

A: Bt-

生理功能不尽相同

(Shen

and

Tarczynski

., 2002;

Lin

SAMS1; B: ZmSAMSl; C: SiSAMSl; D: SbSAMSl; E: Bd-

dermayr

., 2006)。

SAMS1; F: PdSAMSl; G: PpSAMSl; H: ObSAMS2

SAMS

1、

SAMS

2、

SAMS

3在植物所有组织中均

Figure 7 Secondary structure of SAMS proteins

Note: Median: Extended strand; Stub: Random coil; Long-line: Al

有表达，而

SAMS

4主要在花粉中发挥作用

(Chen

pha helix ; A: BtSAMSl; B: ZmSAMSl; C: SiSAMSl; D: SbSA-

.，2016)。

SAMS

家族这4个成员在植株细胞内可以

MS1; E: BdSAMS 1; F: PdSAMS 1; G: PpS AMS 1; H: ObSAMS2

形成同源物或异源物。

Meng

等(2018)证明

SAMS

3的

5666基因组学与应用生物学

启动子可以驱动

SAM

翻译表达

，SAMS

1、

植株相似。但

SAMS

1、

SAMS

2、

SAMS

4的

CDNA

2、

SAMS

4的表达量与对照

步骤提取大刍草叶片的总

RNA

,以1%的琼脂糖凝胶

电泳以及超微量分光光度计检测

3.4引物设计

的质量。

1、

AMS

2、

SAMS

4的启动子对

3的

cDNA

翻译表达有抑制，

3的表达

量低于对照植株，即

SAMS

3的表达模式与其他三个

利用引物设计软件

(Primer

Premier

5.0)设计

BtSAMSl

巢氏

PCR

的两

成员不同。烟草中目前发现两种

/1/

基因，

的反转引物(3'

adaptor

)，

对引物(5.3’

oute

、5.3'

inner

;

2),利用设计好的弓丨

在不同条件下两种

基因的表达量不同。

用乙烯利处理烟草,

SAMS

1在植株叶片中有表

物进行反转录以及

PCR

扩增目的基因片段，利用

达，

SAMS

2在植株中几乎没有表达。

SAMS

1对氧化

胁迫及盐胁迫不敏感，但对乙烯利和高温胁迫很敏

感,

SAMS

2受氧化胁迫、盐胁迫、高温以及乙烯利显

著诱导，可见

SAMS

1和

SAMS

2在表达模式上存在

较大的差异，这表明二者在功能上可能存在分工的不

同，它们可能从不同代谢途径来提高植物的抗逆能力

(余涛等，2004),因而分离

-腺苷甲硫氨酸合成酶基

因并分析其表达对于理解其在植物生长发育和逆境

胁迫中的作用具有重要意义。

目前，对大刍草基因的功能研究尚未见

诸报道，作为玉米遗传改良的珍贵种质资源，对大刍

草中基因的克隆及生物信息学的分析，将为后

续了解

MMS

基因的功能及在植物防御中的利用提

供有用的信息。

3材料与方法

3.1实验材料

大刍草种子(

Packet

#42833，

45-6

)由

威斯康星州立大学遗传系知

Doebley

教授赠送。

菌株与载体：大肠杆菌

Top

10,克隆载体

-18

。

3.2序列来源

通过

NCBI

(

https

://

www

ncbi

nlm

nih

gov

/)的

BLA

比对，选择与份基因序列相似性超过 85% 的

不同植物的

IA/S

基因，并下载其氨基酸序列：玉米

(Zea

map

) (

ZmSAMSl

)

_001139395.2,谷子(

Se/oWa

fca

)(

SiSAMSl

)

_004968603.3,尚梁(5〇厂§/*1<77)6/-

〇")

) (

SbSAMSl

)

021456550.1

，

二穗短柄草咖-

chypodium

distachyon

)

(

BdSAMSl

)

_010232547.3 >

小立碗蘇(/%；^(；〇；7!"广6//(1/)〇^?«)(卩口8八1181)?(11_02-

4505267.1，海率(

PdSAMSl

)

008802422.3,短花药野生稻

(Oryza

rac

/!_

yan

) (

SAMS

_006644063.2。

3.3大刍草叶片总

RNA

提取

采用

Trizol

提取试剂盒(上海生工)，根据试剂盒

-18

的通用引物(

，

)进行菌落

PCR

鉴定(表4)。

表

引物序列

Table 4 Primer sequence

名称

序列

(5’-3')

Name Sequence (5’-3

’）

3'adaptor GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGG

CATGACAGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTT

5.3'outer GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC

5.3'inner GCTACGTAACGGCATGACAGTG

FI GC ACC AAG ACG A AC ATGGTGATGGT

F2 AAGGCGAGCGTGGACTACGAGAAGA

F(M13+) TGTAAAACGACGGCCAGT

R(M13 ) CAGGAAACAGCTATGACC

3.5

cDNA

的合成

反应步骤为先在0.2

PCR

管中加入以下试

剂：5

jxLtotal

RNA

, 1

随机引物，丨（

xLddH2

0,轻

轻混匀后离心3~5

,反应混合物在70°

温浴5

min

后，冰浴2

min

。然后，短暂离心加入以下试剂:2

(xL

xFirst-Strand

Buffer

, 0.5

(xL

mmol

dNTP

,0.25

|xL

Rnase

inhibitor

, 0.25

Reverse

Transcrip

tase

,总体系为10

。轻轻混匀后短暂离心，在

PCR

仪上进行反转录反应，

cDNA

合成42°

持续6

min

，

°C

min

进行终止反应。

3.6巢氏

PCR

的扩增

以3'

adaptor

为反转引物的

cDNA

为模板，第1轮

的反应体系包括:7

V«y

酶 0.2 (

，2

Buffer

112.5 #，

dNTP

(2.5

mmol

，上下引物各 0.5 (

,模板

pLL

ddH

:0补足至25

jxL

。第2轮以第一轮

PCR

扩

增产物为模板，反应体系包括

/酶0.5

jjl

，2

Buffer

(xLdNTP

(2.5

mmol

) 8 |

,上下引物各

jjl

,模板1

ddH

20补足至50(

。

PCR

仪设置程

序为95°

预变性3

min

,94°

变性30

,58°

退火30

72°

延伸90

，33个循环，72°

延伸7

min

。

PCR

扩增

产物以1 %琼脂糖凝胶进行检测，扮基因片段

大刍草&4

/基因克隆与生物信息学分析5667

使用柱式

DNA

胶回收试剂盒(上海生工)进行回收。

tages for fall armyworm larvae from feeding on maize rela

tive to its ancestor balsas teosinte may not be reflected in their

mother's host choice, Entomol. Exp. Appl., 155(3): 206-217

Chen Y., Zou T., and McCormick S., 2016, S-Adenosylmethionine

synthetase3 is important for pollen tube growth, Plant Physi

ol., 172(1): 244-253

Goto D.B., Ogi M., Kijima F., Kumagai T., Werven F., Onouchi

H., and Naito S., 2002, A single-nucleotide mutation in a

3.7

目的基因的转化连接

将回收到的基因片段与PMD18-T载

体进行连接，构成重组质粒DNA(PMD18_T:SAMS),

在16°C连接过夜。然后将重组DNA转化到

感受态细胞中，将细菌涂布于含有IPTG(100mmol/L)

和X-gal (20 mg/mL)的氨苄青霉素固体培养基上，

于37

°C

倒置培养过夜。

3.8

菌落PCR的鉴定

第二天挑取单菌落进行摇菌，提质粒

DNA

进行

PCR

鉴定。反应体系为 10

Buffer

2.5 (

, 酶

0.2 |

jLL，dNTP

(10

mmol

) 0.5 (

，模板 1

,前后引

物均0.5

ddH

20 19.8 |

,总体系为25 |

。反应程

序设置为94°(：预变性3〇1丨11，941：变性3〇5,55°(：退

火3〇8,72°(：延伸6〇8,25个循环,72°0延伸1〇111丨11。将

PCR

反应产物送上海生工进行测序。

3.9

生物信息学分析

8个SAMS蛋白质的氨基酸序列组成及编码蛋

白的理化性质采用

ProtParam

在线工具完成，系统进化

树使用MEGA 5.0软件构建，疏水性分析、亚细胞定位、

信号肽、跨膜域检测分别使用

expasy

、

psort、Signal

、

TMHMM在线程序完成,蛋白质二级及三级结构的预

测利用

Prabi

和

Swiss

model

等在线工具完成。

作者贡献

张玉荣是本研宄的实验设计者和实验研究的执

行人；张玉荣和杨雅舒完成数据分析,论文初稿的写

作；张玉荣、申圣圣、王陆军、郭虹霞和邓妍参与实验

设计，试验结果分析;杨利艳和王创云是项目的构思

者及负责人,指导实验设计、数据分析、论文写作与修

改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由山西省重点研发计划项目(201703D-

221001-2)、院士工作站项目

（

TYYSZ201707

)、

公益

性行业(农业)科研专项(201503124

)、

院农业科技创新

研究课题(YCX2018404)和三晋学者支持计划专项

(2090101)资助。

参考文献

Bemal J.S., Melancon J.E., and Salzman K., 2015, Clear advan

gene encoding S-adenosylmethionine synthetase is associat

ed with methionine over-accumulation phenotype in

Ara-

bidopsis thaliana,

Genes Genet. Syst., 77(2): 89-95

Izhaki A., Shoseyov O., and Weiss D., 1995, A petunia cDNA

encoding S-adenosylmethionine synthetase, Plant Physiol.,

108(2): 841-842

Kettles G.J., Drurey C., Schoonbeek H.J., Andy J., Maule A.J.,

and Hogenhout S.A., 2013, Resistance of

Arabidopsis tha-

liana to

the green peach aphid,

Myzus persicae,

involves ca-

malexin and is regulated by microRNAs, New Phytol., 198

(4): 1178-119

Lindermayr C., Saalbach G., Bahnweg G., and Dumer J., 2006,

Differential inhibition of Arabidopsis methionine adenosyl-

transferases by protein S-nitrosylation, J. Biol. Chem., 281

(7): 4285-4291

Liu R.X., Chen L., Jia Z.H., Lti B.B., Shi H.J., Shao W.L., and

Dong H.S., 2011, Transcription factor AtMYB44 regulates

induced expression of the

ETHYLENE INSENSITIVE2

gene

Arabidopsis

responding to a harpin protein, Mol. Plant

Microbe Interact., 24(3): 377-389

Mao D.D., Yu F., Li J., Van de Poel B., Tan D., Li J.L., Liu Y.Q.,

Li X.H., Dong M.Q., Chen L.B., Li D.P., Luan S., 2015,

FERONIA receptor kinase interacts with S-adenosylme

thionine synthetase and suppresses S-adenosylmethionine

production and ethylene biosynthesis in Arabidopsis, Plant

Cell Environ., 38(12): 2566-2574

Mato J.M., Alvarez L., Ortiz P., and Pajares M.A., 1997, S-ade-

nosylhomocysteine synthesis: molecular mechanisms and

implications, PPharmacol. Ther., 73(3): 265-280

Matsuoka Y., Vigouroux Y., Goodman M.M., Sanchez G.J., Buc

kler E., and Doebley J., 2002, A single domestication for

maize shown by multilocus microsatellite genotyping, Proc.

Natl. Acad Sci. USA, 99(9): 6080-6084

Meng J.J., Wang L.S., Wang J.Y., Zhao X.W., Cheng J.K., Yu W.

X., Dan J., Qing J., and Gong Z.Z., 2018, Methionine adeno-

syltransferase4 mediates DNA and histone methylation,

Plant Physiol., 177(2): 652-670

Ohtsubo N., Mitsuhara I., Koga M., Seo S., and Ohashi Y., 1999,

Ethylene promotes the necrotic lesion formation and basic

PR gene expression in TMV-infected tobacco, Plant Cell

5668基因组学与应用生物学

Physiol., 40(8): 808-817

Paik W.K., Lee H.W., and Kim S., 1975, Non-enzymatic methyla-

tion of proteins with S-adenosyl-L-methionine, FEBS Lett,

58(1-2): 39-42

Peleman J., Boerjan W., Engler G., Seurinck J., Botterman J., Al-

liotte T., Van Montagu M., and Inz^ D., 1989a, Strong cellular

pre- ference in the expression of a housekeeping gene of

A ra-

22-13 (

王欣，

2007

,白菜对小菜蛾抗性的评价方法及抗

虫机理研究，硕士学位论文，中国农业科学院，导师：李

锡香，吴青君，

pp.22-31)

Yu T., Zhi L.F., Peng L., Li Y.S., and Zhu Y.G., 2004, Cloning

and characterization of a novel S-adenosyl-L-methionine

synthase gene in tobacco, Wuhan Zhiwuxue Yanjiu (Journal

of Wuhan Botanical Research), 22(4): 277-283 (

余涛，支立峰，

bi- dopsis thaliana

encoding S-adenosylmethionine syn

thetase, Plant Cell, 1(1): 81-93

Peleman J., Saito K., Cottyn B., Engler G., Seurinck J., Van

Montagu M., and Inz^ D., 1989b, Structure and expression

analyses of the S-adenosylmethionine synthetase gene fam

ily in

Arabidopsis thaliana,

Gene, 84(2): 359-369

Shen B., Li C., and Tarczynski M.C., 2002, High free-methionine

and decreased lignin content result from a mutation in the

彭论

李阳生，朱英国，

2004,

烟草中一条新的

_腺苷甲硫

氨酸合成酶基因的克隆及表达分析，武汉植物学研究

，22

(4): 277-283

Yim W.J., Kim K.Y., Lee Y.W., Sundaram S.P., Lee Y., and Sa

T.M., 2014, Real time expression of ACC oxidase and

PR-protein genes mediated by

Methylobacterium

spp. in

tomato plants challenged with

Xanthomonas campestris

pv.

vesicatoria, J. Plant Physiol, 171(12): 1064-1075

Zhu J.Y., Wang H.Y., Zhang Y.M., and Yu A.L., 2011, Differen

tial expression of maize S-adenosylmethionine synthase gene

family members during salt stress. He- nongxue Bao (Acta

Agriculturae Nucleatae Sinica), 25(3): 427-431 (

朱晶莖，王

Arabidopsis

S-adenosyl-lmethionine synthetase 3 gene, Plant

J., 29(3): 371-380

Takusagawa F., Kamitori S., Misaki S., and Markham G.D., 1996,

Crystal structure of S-adenosylmethionine synthetase, J. Bi

ol. Chem., 271(1): 136-147

Thomas D., and Surdin K.Y., 1987, SAMS1, the structure gene

for one of the S-adenosylmethionine synthetases in Saccha-

romyces cerevisiae sequence and expression, J. Biol. Chem.,

262(34): 16704-16709

Wang X., 2007, Study on evaluation methods and the mechanism of

resistance of Chinese cabbage to diamondback moth

(Plu-

寒玉，张晏萌，余爱丽，

201

，玉米

-腺苷甲硫氨酸合成酶

基因家族成员在盐胁迫条件下的差异表达，核农学报，

25(3): 427-431)

Zhang Z.C., 2009, The effect on olfactory of diamondback moth,

PiuteUa xylostella of

polyamines, Dissertation for Ph.D.,

Huazhong Agricultural University, Supervisors: Zhang G.

A., and Wang M.Q., pp.54-72 (

张志春，

2009

,多胺对小菜

tella xylostella),

Thesis for M.S., Chinese Academy of Agri

cultural Sciences, Supervisors: Li X.X., and Wu Q.J., pp.

蛾嗅觉影响机制的研究，博士学位论文，华中农业大学，

导师：张国安，王满囷，

pp.54-72)

2024年5月28日发(作者：畅闲静)

基因组学与应用生物学，2020年，第39卷，第12期，第5660-5668页

研究报告

Research

Report

大刍草

&4MS7

基因克隆与生物信息学分析

张玉荣1杨雅舒1申圣圣1王陆军2郭虹霞2邓妍2王创云2•杨利艳”

1山西师范大学生命科学学院，临汾，041004; 2山西省农业科学院作物科学研究所，太原，030031

* 共同通信作者,*************;**********************

摘要

-腺苷甲硫氨酸合成酶(&4

)基因催化甲硫氨酸和

合成

-腺苷甲硫氨酸，这是目前研究发

现的体内

-腺苷甲硫氨酸(

)合成的唯一途径，从

基因在植物生长发育、新陈代谢以及逆境胁迫响应

过程中有着十分重要的作用。本研究对大刍草&4

/基因进行了克隆，并利用生物信息学工具分

析了

BtSAMSl

蛋白及与其基因序列相似性超过85%的7种其他物种

SAMS

蛋白。结果显示,&

7基因

全长1 185

,编码394个氨基酸残基，是位于细胞质中的稳定亲水性蛋白。二级结构主要由无规则卷曲组

成，比例大于50%。从三级结构模型来看，蛋白质的结构为四聚体。其他7种蛋白质与

BtSAMSl

蛋白在理化

性质及结构中都存在较高的相似性，表明

关键词大刍草

AMS

蛋白具有高度保守性。

,基因克隆，生物信息学

Cloning and Bioinformatics Analysis of SAMS1 Gene in Balsas Teosinte

Zhang

Yurong

Yang

Yashu

Shen

Shengsheng

Wang

Lujun

Guo

Hongxia

Deng

Yan

Wang

Chuangyun

030031

*Co-correspondingauthors,*************;**********************

DOI: 10.13417/.039.005660

Abstract

S-Adenosylmethionine

Synthase

(

Yang

Liyan

1 School of Life Sciences, Shanxi Normal University, Linfen, 041004; 2 Institute of Crop Science, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan,

SAMS

)

gene

catalyzes

the

synthesis

S-Adenosylmethionine

with

thionine

and

ATP

substrate

which

the

only

way

synthesize

S-Adenosylmethionine

(

SAM

)

vivo

SAMS

plays

important

role

plant

growth

and

development

metabolism

and

stress

response

this

study

the

SAMS

gene

Balsas

teosinte

{

BtSAMSl

)

was

cloned

and

the

BtSAMSl

protein

and

other

SAMS

proteins

from

species

were

analyzed

with

bioinformatics

tool

The

results

showed

that

BtSAMSl

was

1 185

encoding

394

amino

acid

residues

and

the

protein

was

stable

hydrophilic

whose

sequences

are

than

85%

similar

BtSAMS

protein

located

cytoplasm

Its

secondary

structure

mainly

composed

irregular

curls

and

the

proportion

than

50%.

According

the

tertiary

structure

model

the

structure

protein

tetramer

The

other

seven

proteins

are

highly

similar

BtSAMSl

proteins

their

physical

and

chemical

properties

and

structures

which

indicates

that

SAMS

proteins

are

highly

conserved

Keywords

Balsas

teosinte

SAMS

Gene

cloning

Bioinformatics

大会草

（Zea

mays

ssp

rig

)为禾本科植实验证明，大会草是现代栽培玉米的最直接的野生近

物蜀黍属的一年生草本植物。系统进化分析以及分子缘种(

Matsnolcaetal

.,2002)。大刍草有许多优良性状，

基金项目：本研究由山西省重点研发计划项目

(201703D22100

卜

、院士工作站项目

(TYYSZ201707)

、公益性行业

(

农业)科研专

项

(201503124)

、院农业科技创新研究课题

(YCX2018404)

和三晋学者支持计划专项

(2090101

)共同资助

引用格式

：Zhang Y.R.，Yang Y.S.，Shen S.S., Wang LJ” Guo H.X_, Deng Y.，Wang C.Y” and Yang L.Y., 2020, Cloning and bioin-

formatics analysis

of SA MSI

gene clone in Balsas teosinte, Jiyinzuxue Yu Yingyong Shengwuxue (Genomics and Applied Biology), 39

(12): 5660-5668 (

张玉荣，杨雅舒，申圣圣，王陆军，郭虹霞，邓妍，王创云，杨利艳

,2020,

大刍草从

/基因克隆与生物信息学分

析，基因组学与应用生物学，

39(12): 5660-5668)

大刍草基因克隆与生物信息学分析5661

如耐盐、抗病虫害

(Bemal

.，2015)，是玉米遗传改

结合，从而调节

DNA

、

RNA

和蛋白质的生物合成，有

良的珍贵种质资源。在前期对大刍草响应粘虫的研究

促进生长、稳定膜结构、延缓衰老和增强抗逆性的作

中，发现

_腺昔甲硫氨酸合成酶1(8-3(^1105>^111611^0- 用。王欣(2007)以不同品种白菜进行抗虫性分析时发

nine

synthase

SAMS

1)基因表达量在粘虫取食后显著

现白菜的抗虫性强弱与腐胺含量呈正相关，抗虫品种

上调，因此推测其可能参与了对害虫的防御响应。本

腐胺含量高，感虫材料腐胺含量偏低，而多胺的其他

研究克隆获得了大刍草&4

7基因，并对&4

7的

两个成分亚精胺和精胺的含量与抗虫性之间无规律

生物信息学进行了分析。

性。张志春(2009)发现多胺对小菜蛾嗅觉相关蛋白基

-腺苷甲硫氨酸合成酶(

S-adenosylmethionine

因表达量存在影响，且交配前后的小菜蛾对精胺、亚

synthase

S/l

)基因以甲硫氨酸(

Met

)与

ATP

为底物

精胺、腐胺均存在显著的趋避行为。

催化合成

-腺苷甲硫氨酸(

SAM

)，这是目前研究发

乙烯是一种植物激素，参与植株的各个生命周期

现的体内

-腺苷甲硫氨酸(

SAM

)合成的唯一途径

生长发育以及各种应激反应，包括细胞伸展、果实成

(Mato

.，1997)。

SAM

在植物生理代谢中发挥着

熟、叶片脱落、花衰老、病原体侵染、机械创伤、盐胁

重要的作用，它在甲基转移酶(

)的作用下为

DNA

、

迫和低温胁迫等。当植物遭受生物胁迫，如病原体、虫

蛋白质提供甲基基团，参与转硫过程从而合成谷胱

害时，能加速乙烯生物合成速率，导致乙烯释放速率

甘肽，也是转氨丙基过程中合成多胺的前体分子，还参

增加，并且诱导多种植物病程相关蛋白基因的表达，

与乙烯的分子合成(图1)，这些物质均与植物的抗虫

对植物抗病原防御有非常重要的作用

(Ohtsubo

响应有关。

1999)。番茄被黄单胞菌侵染时，乙烯释放量和乙烯

多胺是一类具有生物活性的低分子脂肪族含氮

合成关键基因

0 (1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化

碱,普遍存在于植物的根、茎、叶、花、果实、种子、块

酶)表达量增加，但在甲基杆菌和黄单胞菌同时侵染

茎和胚中，其主要合成前体是精氨酸、赖氨酸和甲硫

时，乙烯释放量和

ACO

基因表达量降低

(Yim

.，

氨酸(

Paiketal

.，1975)。多胺在生理

值下以多聚阳

2014),即不同的生物胁迫对乙烯合成量和合成关键

离子状态存在的，极易与带负电荷的核酸和蛋白质相

基因表达量存在不同影响。

胱硫醚裂解酶

亚精胺.精胺

Spermidine, spermidine

图

1 SAM

的代谢途径

Figure 1 Metabolic pathway of SAM

5662 基因组学与应用生物学

研究发现，在乙烯信号传导途径中,

EIN

2蛋白对

激发乙烯相关的防卫反应是必需的。

Liu

等

poll

)报

道，拟南芥

EIN

2功能缺失突变体在病原菌侵染或害

虫侵染时，其生长发育比对照组矮小。

Kettles

等(2013)

发现乙烯

EIN

2突变体植株上蚜虫虫口数较多，蚜虫

对突变体植株偏好性强于普通植株，说明乙烯相关防

卫信号通路对于植物抗虫性有一定的调控作用。

本研究将通过生物信息学的方法对大刍草

/及与其序列相似性大于85%的其他7个

基因的氨基酸组成，疏水性，亚细胞定位，二级

结构以及三级结构等进行预测和分析,为进一步探索

基因的功能提供理论依据。

10 000 bp

8 000 bp

6 000 bp

(KK) bp

4 000 bp

3 500 bp

3 000 bp

2 500 bp

2 000 bp

500

1 200 bp

1 (KH) bp

900

S00 bp

700 bp

600

500 bp

400 bp

3(H) bp

200 bp

100 bp

图

份基因全长克隆

Figure 3 Full-length cloning of

BtSA MSI

SbSAMSl

关系较近，与

PpSAMS

丨关系最远。

1.3

BtSAMSl

tSAMSl

蛋白结构的分析

蛋白的一级结构和理化性质分析

1结果与分析

1.1

/&4

1.3.1

7基因的克隆

将所提取的

以1%的琼脂糖凝胶进行检测

蛋白质的基本性质主要包括其相对分子质量、等

电点和氨基酸组成等(蒋彦，2003,清华大学出版社，

.1-255)。利用在线程序

ProtParam

对

(图2)，并使用超微量紫外分光光度计对

cDNA

CDS

进行浓

8个

SAMS

度定量测定，其中

260/

280均在1.9〜2.1之间。以

为模板，利用设计好的引物对份&4

7基因

进行巢氏

PCR

克隆扩增，获得基因

CDS

,之后

基因

CDS

蛋白质理化性质进行预测分析(表1),结果表明，价-

S/l

将

BtS

lMSV

序列上传至

NCBI,GenBank

/、

2 这 8 个

S/l

基因的等

电点均小于6,因此为酸性氨基酸从主要氨基酸组成

登录号为

894430。巢氏

产物以1%的琼脂糖

看出，8种蛋白质中均是甘氨酸

Gly

含量最高。这8个

蛋白质的不稳定系数均小于40,均为稳定蛋白，平均

凝胶进行检测，出现一条单一的条带(图

即均为亲水性蛋白。

基因片段采用柱式

DNA

胶回收试剂盒回收纯化，

亲水系数都为负值，

之后将其与

PMD

-18

载体连接转化后进行菌落

1.3.2

SAMS

蛋白的疏水性分析

PCR

鉴定，送往上海生工进行测序，测序结果与及-

/基因序列一致(图4)。

tSAMSl

利用

ExPASy

分析氨基酸序列的疏水性,对氨基

酸序列进行疏水性分析采用

Kyte

Doolittle

方法。观

1.2

的同源性分析及系统发育树的构建

ncbi

njm

nih

gov

/)的

Blast

察疏水峰值和亲水峰值的氨基酸所长的百分率，疏

水峰值大于0的氨基酸所占的比例超过50%,可以认

为氨基酸合成的整个蛋白质表现出疏水性，反之为亲

水性。由平均亲水系数可得，8个

SAMS

蛋白均为亲水

蛋白，其中

，PdSAMS

1平均亲水系数最小

,BdSAMS

的平均亲水系数最大，说明

BdSAMSl

dSAMSl

通过

NCBI

(

https

://

比对，这7个不同物种的

基因与及

7基因

序列相似性不低于85%。利用

MEGA

5.0构建系统发

育树（图5),这8个不同&4

ZmSAMSI

基因中，

BtSAMSl

与

属于一个分支，亲缘关系最近。其次，与

的亲水性最强，

的亲水性最弱(图6)。

蛋白亚细胞定位分析

1.3.3

SAMS

利用在线程序

对8种

SAMS

蛋白进行

亚细胞定位分析(表2),这8种蛋白质均主要在细胞

质中发挥其作用。对8种蛋白质进行信号肽和跨膜结

构域进行检测，发现这8种蛋白质既不是分泌蛋白，

也不是膜蛋白，它在细胞中合成，这和亚细胞定位分

析结果一致，表明其主要功能场所为细胞质。

图

2 RNA

的检测

Figure 2 Detection of RNA

1.3.4

SAMS

蛋白的二级结构预测

蛋白质的二级结构是指蛋白质多肽链本身的折

大刍草基因克隆与生物信息学分析5663

|||||||||^|

|||||||||||

||1|||

|||||||

|||||

||||||||

||1|||||

||||||

图

4 BtSAMSl

的菌落

PCR

鉴定

Figure 4 Identification of BtSAMSl by colony PCR amplificaion

表

1 SAMS

蛋白质的理化性质分析

Table 1 Analysis of physical and chemical properties of SAMS proteins

蛋白名称

分子量

(kD)

理论等电点

主要氨基酸

(％)

不稳定系数

脂肪系数

平均亲水性

Protein

Molecular

Theoretical pi

Amino acid (%)

Instability

AliphaticGrand average of

name

weight (kD)

index

hydropathicity

BtSAMSl

42 776.485.57

Gly (9.6) Val (9.1) Ala (8.1) 22.63

83.12-0.229

Asp (8.1) Thr (7.1)Lys (6.9)

ZmSAMSl

42 772.475.59

Gly (9.6) Val (9.1) Ala (8.1)

23.74

81.14

-0.250

Asp (7.9) Thr (7.4) Lys (6.9)

SiSAMSl

48 163.88

5.98

Gly (8.8) Ala (8.6) Val (8.1) 26.74

83.39-0.243

Asp (7.5) Leu (7.0) Thr (7.0)

SbSAMSl

42 785.505.50

Gly (9.6) Val (9.1) Ala (8.1) 24.0682.13

-0.237

Asp (8.1) Thr (7.1) Lys (6.9)

BdSAMSl

42 776.585.52

Giy (9.6) Ala (8.4) Asp (8.4)

23.25

84.39-0.205

Val (8.1) lie (7.4) Thr (7.4)

PdSAMSl

43 368.08

5.68

Gly (9.1) Val (9.1) Asp (7.9) 24.61

79.39

-0.356

Thr (7.6) Ala (7.4)

PpSAMSl

43 222.125.60

Gly (9.7) Val(8.4) Thr (7.9)

25.04

78.12-0.322

Asp (7.6) Lys (7.4) Ala (7.1)

ObSAMS2

43 970.735.37

Gly (9.5) Asp (8.0) Ala (7.7)

28.72

79.53-0.306

Thr (7.5) Glu (6.7)

1001— BtSAMSl

L. ZmSAMSl

的排布位置。蛋白质的结构决定功能，因此预测和分

94 I------------- SbSAMAl

析蛋白质的三级结构对理解其结构与功能之间的关

I-------------------------- ObSAMS2

〇

l-------------- SiSAMSl

系有重大作用(汪家政和范明，2000)。通过在线程序

_________*----------------------------------- BdSAMSl

99l----------------------------------------------------------------------------- PdSAMSl

SWISS

MODEL

对这8种蛋白质的三维结构进行模拟

---------------------------------------------------------------------------------------------PpSAMSl

构建。这8种蛋白质的三维结构较为相似，表明

SAMS

0.02

蛋白具有较高的保守性,也进一步说明这些蛋白质的

图

5 SdWS7

基因的系统发育树

功能也具有一定的相似性(图8)。

Figure 5 Phylogenetic tree of

BtSAMSl

gene

讨论

叠和盘绕的方式，主要有

-螺旋、延伸链、无规则卷

曲三种形式,可利用

SOPMA

对其进行预测分析(表3)。

本研究对大刍草

7基因进行了克隆，获得

结果显示,8种蛋白质均是无规则卷曲所占比例最

了该基因的

CDS

序列。通过对同源性较高的8种

高。由8个

SAMS

蛋白二级结构预测结果(图7)可见，

SAMS

分析表明，

BtSAMSl

与

ZmSAMSl

属于一个

这8种蛋白质的二级结构具有较高的相似性，由此我

分支，亲缘关系最为接近。8种蛋白质的亲水值都为

们可以推断,

SAMS

蛋白的二级结构是比较保守的。

负值，均为容易接近水分子的水溶性蛋白，主要功能

BtSAMSl

与

ZmSAMSl

两者发生二级结构的氨基

场所为细胞质。对大肠杆菌

SAMS

蛋白结构研究发

酸残基位置最为接近，与

SbSAMSl

的氨基酸残基位

现，其蛋白质结构为六方体，由4个相同亚基组成：

置也比较接近^

两个亚基聚合成类似球形的二聚体，两个二聚体聚合

蛋白质的三级结构是指整条肽链中全部氨基酸

形成一个四聚体。每个二聚体都有两个活性位点，这

残基的相对空间位置，即肽链中所有原子在三维空间

两个活性位点位于两亚基之间。

5664基因组学与应用生物学

位置

Position

位置

Position

-Hphob. / Kyte & Doolittle

位置

Position

Hphob. / Kyle & Doolittle

位置

Position

位置

Position

位置

Position

• Hphob. / Kytc & Doolittle

Hphob. / Kyle & Doolittle

C/3

图

6 8

种

SAMS

蛋白疏水性预测分析

ft: A: BtSAMSl; B: ZmSAMSl; C: SiSAMSl; D: SbSAMSl; E: BdSAMSl; F: PdSAMSl; G: PpSAMSl; H: ObSAMS2

Figure 6 Prediction and analysis of hydrophobicity of 8 SAMS proteins

Note: A: BtSAMSl; B: ZmSAMSl; C: SiSAMSl; D: SbSAMSl; E: BdSAMSl; F: PdSAMSl; G: PpSAMSl; H: 0bSAMS2

表

2 8

种

SAMS

蛋白的亚细胞定位

Table 2 Subcellular localization of 8 SAMS protein

蛋白名称

Protein

name

BtSAMSl

ZmSAM 1

SiSAMSl

SbSAMSI

BdSAMSl

PdSAMSl

PpSAMSl

ObSAM2

域，

端结构域)组成，这三个域对称折叠成一个伪三超家族。二级结构主要由无规则卷曲组成，比例均大

倍的结构。对这8个蛋白质的保守结构域进行检测，发于50%。从三级结构模型来看，这8种蛋白质的结构

-1

位置

Position

位置

Position

细胞质

Cytoplasmic

细胞骨架

Cytoskeletal

细胞核

Nuclear

过氧化物酶体

Peroxisomal

线粒体

Mitochondrial

内质网

Endoplasmic

reticulum

56.5

69.6

56.5

65.2

52.2

56.5

17.4

13.0

17.4

13.0

17.4

13.0

4.3

17.4

13.0

17.4

21.7

17.4

21.7

17.4

4.3

每个亚基都是由3个域(

端结构域，中间结构现都拥有典型的

PLN

02243结构域，属于

PLN

02243

大刍草

SAMS

/基因克隆与生物信息学分析5665

表

3 8

种

SAMS

蛋白质的二级结构预测

Table 3 Prediction of secondary structure of 8 SAMS proteins

蛋白名称

螺旋

(％)

延伸链

(％)

无规则卷曲

(％)

ProteinAlpha helix (%)ExtendedRandom coil (%)

namestrand (%)

BtSAMSl24.1123.10

52.79

ZmSAMSl

23.6022.5953.81

SiSAMSl25.11

21.27

53.62

SbSAMSl24.3723.10

52.54

BdSAMS 124.6223.10

52.28

PdSAMS 1

22.5922.3455.08

PpSAMSl

28.24

20.61

51.15

ObSAMS223.6322.14

54.23

_ HI ■ ■

■，

丨

T^^

0 50 100 150 200 250 300 350

1 ■ill

■!

llhlBl H

i i

■liNl f

0 50 100 150 200 250 300 350

图

个蛋白质的三维结构

A: BtSAMSl; B: ZmSAMSl; C: SiSAMSl; D: SbSAMSl; E:

iniftn

"_十

BdSAMSl; F: PdSAMSl; G: PpSAMSl; H: ObSAMS2

0 50 100 150 200 250 300 353500 400

Figure 8 Three-dimensional structure of 8 proteins

Note: A: BtSAMSl; B: ZmSAMSl; C: SiSAMSl; D: SbSAMSl;

E: BdSAMSl; F: PdSAMSl; G: PpSAMSl; H: ObSAMS2

i ll

! >i

0 50

100

150 200 250 300 350

均为四聚体，表明

SAMS

蛋白结构具有保守性，这也

符合

Takusagawa

等（1996)的研究，即大多数

SAMS

蛋白质都是作为四聚体存在的。

0 50 100 150 200 250 300 350

近年来，

SAMS

基因己经在多个物种中发现

(Izhaki

etal

.，1995),植物体内存在多种类型的

SAMS

编码

基因

(Thomas

and

Surdin

, 1987)，它们的表达方式不

100

150 200 250 300 350

同，在植物代谢中也发挥着不同的生理功能。玉米数

据库中有4个

基因，

SAMS

家族基因在不同的

I 1 llhlt |4f-.

植物组织中表达量不同，根茎中的表达高于叶片中，

0 50 100 150 200 250 300 350

其中

SAMS

1、

SAMS

2、

SAMS

4的表达量在盐胁迫下

降低,

SAMS

3表达量在盐胁迫下几乎不发生变化(朱

♦■ItiB ■! iBliiif-w-4-

晶莹等,2011)。拟南芥

SAMS

家族中也存在4个成员

0 50 100 150 200 250 300 350

(Peleman

., 1989

; 1989

;

Goto

., 2002;

Mao

图

7 SAMS

蛋白的二级结构

., 2015)，它们的氨基酸序列相似程度接近90%,但其

注：中线：延伸链；短线：无规则卷曲；长线：

螺旋；

A: Bt-

生理功能不尽相同

(Shen

and

Tarczynski

., 2002;

Lin

SAMS1; B: ZmSAMSl; C: SiSAMSl; D: SbSAMSl; E: Bd-

dermayr

., 2006)。

SAMS1; F: PdSAMSl; G: PpSAMSl; H: ObSAMS2

SAMS

1、

SAMS

2、

SAMS

3在植物所有组织中均

Figure 7 Secondary structure of SAMS proteins

Note: Median: Extended strand; Stub: Random coil; Long-line: Al

有表达，而

SAMS

4主要在花粉中发挥作用

(Chen

pha helix ; A: BtSAMSl; B: ZmSAMSl; C: SiSAMSl; D: SbSA-

.，2016)。

SAMS

家族这4个成员在植株细胞内可以

MS1; E: BdSAMS 1; F: PdSAMS 1; G: PpS AMS 1; H: ObSAMS2

形成同源物或异源物。

Meng

等(2018)证明

SAMS

3的

5666基因组学与应用生物学

启动子可以驱动

SAM

翻译表达

，SAMS

1、

植株相似。但

SAMS

1、

SAMS

2、

SAMS

4的

CDNA

2、

SAMS

4的表达量与对照

步骤提取大刍草叶片的总

RNA

,以1%的琼脂糖凝胶

电泳以及超微量分光光度计检测

3.4引物设计

的质量。

1、

AMS

2、

SAMS

4的启动子对

3的

cDNA

翻译表达有抑制，

3的表达

量低于对照植株，即

SAMS

3的表达模式与其他三个

利用引物设计软件

(Primer

Premier

5.0)设计

BtSAMSl

巢氏

PCR

的两

成员不同。烟草中目前发现两种

/1/

基因，

的反转引物(3'

adaptor

)，

对引物(5.3’

oute

、5.3'

inner

;

2),利用设计好的弓丨

在不同条件下两种

基因的表达量不同。

用乙烯利处理烟草,

SAMS

1在植株叶片中有表

物进行反转录以及

PCR

扩增目的基因片段，利用

达，

SAMS

2在植株中几乎没有表达。

SAMS

1对氧化

胁迫及盐胁迫不敏感，但对乙烯利和高温胁迫很敏

感,

SAMS

2受氧化胁迫、盐胁迫、高温以及乙烯利显

著诱导，可见

SAMS

1和

SAMS

2在表达模式上存在

较大的差异，这表明二者在功能上可能存在分工的不

同，它们可能从不同代谢途径来提高植物的抗逆能力

(余涛等，2004),因而分离

-腺苷甲硫氨酸合成酶基

因并分析其表达对于理解其在植物生长发育和逆境

胁迫中的作用具有重要意义。

目前，对大刍草基因的功能研究尚未见

诸报道，作为玉米遗传改良的珍贵种质资源，对大刍

草中基因的克隆及生物信息学的分析，将为后

续了解

MMS

基因的功能及在植物防御中的利用提

供有用的信息。

3材料与方法

3.1实验材料

大刍草种子(

Packet

#42833，

45-6

)由

威斯康星州立大学遗传系知

Doebley

教授赠送。

菌株与载体：大肠杆菌

Top

10,克隆载体

-18

。

3.2序列来源

通过

NCBI

(

https

://

www

ncbi

nlm

nih

gov

/)的

BLA

比对，选择与份基因序列相似性超过 85% 的

不同植物的

IA/S

基因，并下载其氨基酸序列：玉米

(Zea

map

) (

ZmSAMSl

)

_001139395.2,谷子(

Se/oWa

fca

)(

SiSAMSl

)

_004968603.3,尚梁(5〇厂§/*1<77)6/-

〇")

) (

SbSAMSl

)

021456550.1

，

二穗短柄草咖-

chypodium

distachyon

)

(

BdSAMSl

)

_010232547.3 >

小立碗蘇(/%；^(；〇；7!"广6//(1/)〇^?«)(卩口8八1181)?(11_02-

4505267.1，海率(

PdSAMSl

)

008802422.3,短花药野生稻

(Oryza

rac

/!_

yan

) (

SAMS

_006644063.2。

3.3大刍草叶片总

RNA

提取

采用

Trizol

提取试剂盒(上海生工)，根据试剂盒

-18

的通用引物(

，

)进行菌落

PCR

鉴定(表4)。

表

引物序列

Table 4 Primer sequence

名称

序列

(5’-3')

Name Sequence (5’-3

’）

3'adaptor GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGG

CATGACAGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTT

5.3'outer GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC

5.3'inner GCTACGTAACGGCATGACAGTG

FI GC ACC AAG ACG A AC ATGGTGATGGT

F2 AAGGCGAGCGTGGACTACGAGAAGA

F(M13+) TGTAAAACGACGGCCAGT

R(M13 ) CAGGAAACAGCTATGACC

3.5

cDNA

的合成

反应步骤为先在0.2

PCR

管中加入以下试

剂：5

jxLtotal

RNA

, 1

随机引物，丨（

xLddH2

0,轻

轻混匀后离心3~5

,反应混合物在70°

温浴5

min

后，冰浴2

min

。然后，短暂离心加入以下试剂:2

(xL

xFirst-Strand

Buffer

, 0.5

(xL

mmol

dNTP

,0.25

|xL

Rnase

inhibitor

, 0.25

Reverse

Transcrip

tase

,总体系为10

。轻轻混匀后短暂离心，在

PCR

仪上进行反转录反应，

cDNA

合成42°

持续6

min

，

°C

min

进行终止反应。

3.6巢氏

PCR

的扩增

以3'

adaptor

为反转引物的

cDNA

为模板，第1轮

的反应体系包括:7

V«y

酶 0.2 (

，2

Buffer

112.5 #，

dNTP

(2.5

mmol

，上下引物各 0.5 (

,模板

pLL

ddH

:0补足至25

jxL

。第2轮以第一轮

PCR

扩

增产物为模板，反应体系包括

/酶0.5

jjl

，2

Buffer

(xLdNTP

(2.5

mmol

) 8 |

,上下引物各

jjl

,模板1

ddH

20补足至50(

。

PCR

仪设置程

序为95°

预变性3

min

,94°

变性30

,58°

退火30

72°

延伸90

，33个循环，72°

延伸7

min

。

PCR

扩增

产物以1 %琼脂糖凝胶进行检测，扮基因片段

大刍草&4

/基因克隆与生物信息学分析5667

使用柱式

DNA

胶回收试剂盒(上海生工)进行回收。

tages for fall armyworm larvae from feeding on maize rela

tive to its ancestor balsas teosinte may not be reflected in their

mother's host choice, Entomol. Exp. Appl., 155(3): 206-217

Chen Y., Zou T., and McCormick S., 2016, S-Adenosylmethionine

synthetase3 is important for pollen tube growth, Plant Physi

ol., 172(1): 244-253

Goto D.B., Ogi M., Kijima F., Kumagai T., Werven F., Onouchi

H., and Naito S., 2002, A single-nucleotide mutation in a

3.7

目的基因的转化连接

将回收到的基因片段与PMD18-T载

体进行连接，构成重组质粒DNA(PMD18_T:SAMS),

在16°C连接过夜。然后将重组DNA转化到

感受态细胞中，将细菌涂布于含有IPTG(100mmol/L)

和X-gal (20 mg/mL)的氨苄青霉素固体培养基上，

于37

°C

倒置培养过夜。

3.8

菌落PCR的鉴定

第二天挑取单菌落进行摇菌，提质粒

DNA

进行

PCR

鉴定。反应体系为 10

Buffer

2.5 (

, 酶

0.2 |

jLL，dNTP

(10

mmol

) 0.5 (

，模板 1

,前后引

物均0.5

ddH

20 19.8 |

,总体系为25 |

。反应程

序设置为94°(：预变性3〇1丨11，941：变性3〇5,55°(：退

火3〇8,72°(：延伸6〇8,25个循环,72°0延伸1〇111丨11。将

PCR

反应产物送上海生工进行测序。

3.9

生物信息学分析

8个SAMS蛋白质的氨基酸序列组成及编码蛋

白的理化性质采用

ProtParam

在线工具完成，系统进化

树使用MEGA 5.0软件构建，疏水性分析、亚细胞定位、

信号肽、跨膜域检测分别使用

expasy

、

psort、Signal

、

TMHMM在线程序完成,蛋白质二级及三级结构的预

测利用

Prabi

和

Swiss

model

等在线工具完成。

作者贡献

张玉荣是本研宄的实验设计者和实验研究的执

行人；张玉荣和杨雅舒完成数据分析,论文初稿的写

作；张玉荣、申圣圣、王陆军、郭虹霞和邓妍参与实验

设计，试验结果分析;杨利艳和王创云是项目的构思

者及负责人,指导实验设计、数据分析、论文写作与修

改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由山西省重点研发计划项目(201703D-

221001-2)、院士工作站项目

（

TYYSZ201707

)、

公益

性行业(农业)科研专项(201503124

)、

院农业科技创新

研究课题(YCX2018404)和三晋学者支持计划专项

(2090101)资助。

参考文献

Bemal J.S., Melancon J.E., and Salzman K., 2015, Clear advan

gene encoding S-adenosylmethionine synthetase is associat

ed with methionine over-accumulation phenotype in

Ara-

bidopsis thaliana,

Genes Genet. Syst., 77(2): 89-95

Izhaki A., Shoseyov O., and Weiss D., 1995, A petunia cDNA

encoding S-adenosylmethionine synthetase, Plant Physiol.,

108(2): 841-842

Kettles G.J., Drurey C., Schoonbeek H.J., Andy J., Maule A.J.,

and Hogenhout S.A., 2013, Resistance of

Arabidopsis tha-

liana to

the green peach aphid,

Myzus persicae,

involves ca-

malexin and is regulated by microRNAs, New Phytol., 198

(4): 1178-119

Lindermayr C., Saalbach G., Bahnweg G., and Dumer J., 2006,

Differential inhibition of Arabidopsis methionine adenosyl-

transferases by protein S-nitrosylation, J. Biol. Chem., 281

(7): 4285-4291

Liu R.X., Chen L., Jia Z.H., Lti B.B., Shi H.J., Shao W.L., and

Dong H.S., 2011, Transcription factor AtMYB44 regulates

induced expression of the

ETHYLENE INSENSITIVE2

gene

Arabidopsis

responding to a harpin protein, Mol. Plant

Microbe Interact., 24(3): 377-389

Mao D.D., Yu F., Li J., Van de Poel B., Tan D., Li J.L., Liu Y.Q.,

Li X.H., Dong M.Q., Chen L.B., Li D.P., Luan S., 2015,

FERONIA receptor kinase interacts with S-adenosylme

thionine synthetase and suppresses S-adenosylmethionine

production and ethylene biosynthesis in Arabidopsis, Plant

Cell Environ., 38(12): 2566-2574

Mato J.M., Alvarez L., Ortiz P., and Pajares M.A., 1997, S-ade-

nosylhomocysteine synthesis: molecular mechanisms and

implications, PPharmacol. Ther., 73(3): 265-280

Matsuoka Y., Vigouroux Y., Goodman M.M., Sanchez G.J., Buc

kler E., and Doebley J., 2002, A single domestication for

maize shown by multilocus microsatellite genotyping, Proc.

Natl. Acad Sci. USA, 99(9): 6080-6084

Meng J.J., Wang L.S., Wang J.Y., Zhao X.W., Cheng J.K., Yu W.

X., Dan J., Qing J., and Gong Z.Z., 2018, Methionine adeno-

syltransferase4 mediates DNA and histone methylation,

Plant Physiol., 177(2): 652-670

Ohtsubo N., Mitsuhara I., Koga M., Seo S., and Ohashi Y., 1999,

Ethylene promotes the necrotic lesion formation and basic

PR gene expression in TMV-infected tobacco, Plant Cell

5668基因组学与应用生物学

Physiol., 40(8): 808-817

Paik W.K., Lee H.W., and Kim S., 1975, Non-enzymatic methyla-

tion of proteins with S-adenosyl-L-methionine, FEBS Lett,

58(1-2): 39-42

Peleman J., Boerjan W., Engler G., Seurinck J., Botterman J., Al-

liotte T., Van Montagu M., and Inz^ D., 1989a, Strong cellular

pre- ference in the expression of a housekeeping gene of

A ra-

22-13 (

王欣，

2007

,白菜对小菜蛾抗性的评价方法及抗

虫机理研究，硕士学位论文，中国农业科学院，导师：李

锡香，吴青君，

pp.22-31)

Yu T., Zhi L.F., Peng L., Li Y.S., and Zhu Y.G., 2004, Cloning

and characterization of a novel S-adenosyl-L-methionine

synthase gene in tobacco, Wuhan Zhiwuxue Yanjiu (Journal

of Wuhan Botanical Research), 22(4): 277-283 (

余涛，支立峰，

bi- dopsis thaliana

encoding S-adenosylmethionine syn

thetase, Plant Cell, 1(1): 81-93

Peleman J., Saito K., Cottyn B., Engler G., Seurinck J., Van

Montagu M., and Inz^ D., 1989b, Structure and expression

analyses of the S-adenosylmethionine synthetase gene fam

ily in

Arabidopsis thaliana,

Gene, 84(2): 359-369

Shen B., Li C., and Tarczynski M.C., 2002, High free-methionine

and decreased lignin content result from a mutation in the

彭论

李阳生，朱英国，

2004,

烟草中一条新的

_腺苷甲硫

氨酸合成酶基因的克隆及表达分析，武汉植物学研究

，22

(4): 277-283

Yim W.J., Kim K.Y., Lee Y.W., Sundaram S.P., Lee Y., and Sa

T.M., 2014, Real time expression of ACC oxidase and

PR-protein genes mediated by

Methylobacterium

spp. in

tomato plants challenged with

Xanthomonas campestris

pv.

vesicatoria, J. Plant Physiol, 171(12): 1064-1075

Zhu J.Y., Wang H.Y., Zhang Y.M., and Yu A.L., 2011, Differen

tial expression of maize S-adenosylmethionine synthase gene

family members during salt stress. He- nongxue Bao (Acta

Agriculturae Nucleatae Sinica), 25(3): 427-431 (

朱晶莖，王

Arabidopsis

S-adenosyl-lmethionine synthetase 3 gene, Plant

J., 29(3): 371-380

Takusagawa F., Kamitori S., Misaki S., and Markham G.D., 1996,

Crystal structure of S-adenosylmethionine synthetase, J. Bi

ol. Chem., 271(1): 136-147

Thomas D., and Surdin K.Y., 1987, SAMS1, the structure gene

for one of the S-adenosylmethionine synthetases in Saccha-

romyces cerevisiae sequence and expression, J. Biol. Chem.,

262(34): 16704-16709

Wang X., 2007, Study on evaluation methods and the mechanism of

resistance of Chinese cabbage to diamondback moth

(Plu-

寒玉，张晏萌，余爱丽，

201

，玉米

-腺苷甲硫氨酸合成酶

基因家族成员在盐胁迫条件下的差异表达，核农学报，

25(3): 427-431)

Zhang Z.C., 2009, The effect on olfactory of diamondback moth,

PiuteUa xylostella of

polyamines, Dissertation for Ph.D.,

Huazhong Agricultural University, Supervisors: Zhang G.

A., and Wang M.Q., pp.54-72 (

张志春，

2009

,多胺对小菜

tella xylostella),

Thesis for M.S., Chinese Academy of Agri

cultural Sciences, Supervisors: Li X.X., and Wu Q.J., pp.

蛾嗅觉影响机制的研究，博士学位论文，华中农业大学，

导师：张国安，王满囷，

pp.54-72)