2024年6月1日发(作者：玄思聪)
结构生物学技术综述｜MicroED、冷冻电镜SPA与X射线晶体
学是如何优势互补
结构生物学是以分子生物学，生物化学和生物物理学为基础的学科，研究对
象为生物大分子，如蛋白质和核酸等。目的是利用生物或物理手段来看清楚生物
大分子的精细形态，以阐述生物大分子行驶功能的机制，帮助生物学家更好的认
识生命活动的过程。而且，很多药物分子的作用靶点大多为蛋白质，所以结构生
物学在药物研发中起到重要指导作用，为机理研究到药物开发带来清晰的认识。
针对生物大分子中的蛋白质的研究，主要的研究手段有：核磁共振（nuclear
magnetic resonance，NMR）、X射线晶体学（X-ray crystallography）和冷冻电子
显微镜（cryo-electron microscope, cryo-EM）。核磁共振主要针对溶液中的、分子
量很小（约20kDa）的样品类型，最近几年已使用不多。近年来，也出现了一些
新技术，微晶电子衍射（MicroED）是一种利用冷冻电镜解析微小晶体结构的技
术，由于电子束与物质的作用远强于X射线，可以解析X射线晶体学难以处理
的纳米晶体结构。特别是对于以往难以培养单晶的蛋白样品来说，MicroED为结
构生物学家提供了一个前景广阔的新工具，弥补现有技术的不足。该技术被
《Science》杂志评为2018年十大突破技术之一。
X射线衍射——最富传统意义的结构解析方式
早在1895 年，伦琴（W. C. Roentgen）就发现了X射线。X射线的发现推动
了现代生物学的发展，甚至可以说对整个科学技术领域产生了极为深刻的影响。
1912 年，劳厄（M. V. Laue）与弗里德里希（W. Friedrich）以及伦琴的博士研究
生克里平（P. Knipping）利用 X 射线对硫酸铜晶体进行衍射实验，并在底片上
得到了一些粗大的、椭圆形的斑点，发现了 X 射线晶体衍射。而后，他们又对
ZnS、 PbS、 NaCl 等晶体进行 X 射线衍射实验，得到了清晰的四重对称衍射
图。劳厄还提出了 Laue 方程来描述晶体的 X 射线衍射。ZnS 晶体的 X 射线
衍射照片发表不久，布拉格（W. L. Bragg）重复此实验，并在1913年推导出了
X 射线衍射方程，即著名的布拉格方程。X 射线衍射的发现和劳厄方程以及布
拉格方程的建立标志着 X 射线晶体学的诞生。到1957年，X射线晶体学就解
析得到了第一个生物大分子——抹香鲸肌红蛋白的结构。而到现在为止，约有十
五万的生物大分子结构是利用X射线晶体学解析的。X 射线晶体学解析蛋白质
三维结构之所以发展如此迅速，主要是因为有以下几点优势：1. 能够达到很高的
分辨率，接近原子水平；2. 对蛋白质的大小和成份类型没有限制，所以无论是分
子量超大的多亚基复合物还是分子量很小的多肽，都能通过此方法得到理想结果。
但此方法必须有高质量的大尺寸晶体作为前提，所以其第二点优势同时是其限制
所在，得到质量较好的晶体对于分子量巨大或者结构柔性的对象来说往往较为困
难。
基于冷冻电子显微镜的单颗粒分析技术
近几十年，冷冻电子显微镜发展迅速，在结构生物学领域逐渐发挥出举足轻
重的作用。早在1939年，西门子公司制造了世界上第一台商业化的电子显微镜。
为了防止高真空及强烈的电子轰击对样品的破坏，人们用重金属染色或糖包埋的
方法处理样品。但由于都对样品进行了破坏性处理且都是在常温条件下进行观察，
所以分辨率都受到了限制。到1984年，J. Dubochet等人发展了冷冻生物样品的
方法并总结了得到玻璃态冰的方法
1,2
，这是最早的快速冷冻技术（cryo-freezing）
并开启了“冷冻” 电子显微镜时代。通过将生物大分子的溶液样品快速投入至冷
却到液氮温度的液态乙烷中，得到冰层厚度合适的冷冻样品，然后对冰层中均匀
分布的生物大分子颗粒进行拍照，得到上千张照片。通过算法对拍到的二维照片
进行分析，最终得到其结构，此方法称之为单颗粒分析技术（single particle
analysis）。近些年，随着直接电子探测相机（direct detection device, DDD）的出
现和各种数据处理软件的发展，冷冻电子显微镜解析的生物大分子三维结构所占
比例越来越大（见图1）。比如2020年3月发表在Science杂志的研究通过冷冻
电子显微镜单颗粒分析技术，确定了与胰高血糖素及不同类别的异源三聚体G蛋
白（G
s
或G
i1
）结合的人源胰高血糖素受体（GCGR）3.7 Å和3.9 Å的结构（见
图2）。该研究的多个结构与药理学数据相结合，为II型糖尿病和肥胖症的治疗
提供了重要见解
3
。
2024年6月1日发(作者：玄思聪)
结构生物学技术综述｜MicroED、冷冻电镜SPA与X射线晶体
学是如何优势互补
结构生物学是以分子生物学，生物化学和生物物理学为基础的学科，研究对
象为生物大分子，如蛋白质和核酸等。目的是利用生物或物理手段来看清楚生物
大分子的精细形态，以阐述生物大分子行驶功能的机制，帮助生物学家更好的认
识生命活动的过程。而且，很多药物分子的作用靶点大多为蛋白质，所以结构生
物学在药物研发中起到重要指导作用，为机理研究到药物开发带来清晰的认识。
针对生物大分子中的蛋白质的研究，主要的研究手段有：核磁共振（nuclear
magnetic resonance，NMR）、X射线晶体学（X-ray crystallography）和冷冻电子
显微镜（cryo-electron microscope, cryo-EM）。核磁共振主要针对溶液中的、分子
量很小（约20kDa）的样品类型，最近几年已使用不多。近年来，也出现了一些
新技术，微晶电子衍射（MicroED）是一种利用冷冻电镜解析微小晶体结构的技
术，由于电子束与物质的作用远强于X射线，可以解析X射线晶体学难以处理
的纳米晶体结构。特别是对于以往难以培养单晶的蛋白样品来说，MicroED为结
构生物学家提供了一个前景广阔的新工具，弥补现有技术的不足。该技术被
《Science》杂志评为2018年十大突破技术之一。
X射线衍射——最富传统意义的结构解析方式
早在1895 年，伦琴（W. C. Roentgen）就发现了X射线。X射线的发现推动
了现代生物学的发展，甚至可以说对整个科学技术领域产生了极为深刻的影响。
1912 年，劳厄（M. V. Laue）与弗里德里希（W. Friedrich）以及伦琴的博士研究
生克里平（P. Knipping）利用 X 射线对硫酸铜晶体进行衍射实验，并在底片上
得到了一些粗大的、椭圆形的斑点，发现了 X 射线晶体衍射。而后，他们又对
ZnS、 PbS、 NaCl 等晶体进行 X 射线衍射实验，得到了清晰的四重对称衍射
图。劳厄还提出了 Laue 方程来描述晶体的 X 射线衍射。ZnS 晶体的 X 射线
衍射照片发表不久，布拉格（W. L. Bragg）重复此实验，并在1913年推导出了
X 射线衍射方程，即著名的布拉格方程。X 射线衍射的发现和劳厄方程以及布
拉格方程的建立标志着 X 射线晶体学的诞生。到1957年，X射线晶体学就解
析得到了第一个生物大分子——抹香鲸肌红蛋白的结构。而到现在为止，约有十
五万的生物大分子结构是利用X射线晶体学解析的。X 射线晶体学解析蛋白质
三维结构之所以发展如此迅速，主要是因为有以下几点优势：1. 能够达到很高的
分辨率，接近原子水平；2. 对蛋白质的大小和成份类型没有限制，所以无论是分
子量超大的多亚基复合物还是分子量很小的多肽，都能通过此方法得到理想结果。
但此方法必须有高质量的大尺寸晶体作为前提，所以其第二点优势同时是其限制
所在，得到质量较好的晶体对于分子量巨大或者结构柔性的对象来说往往较为困
难。
基于冷冻电子显微镜的单颗粒分析技术
近几十年，冷冻电子显微镜发展迅速，在结构生物学领域逐渐发挥出举足轻
重的作用。早在1939年，西门子公司制造了世界上第一台商业化的电子显微镜。
为了防止高真空及强烈的电子轰击对样品的破坏，人们用重金属染色或糖包埋的
方法处理样品。但由于都对样品进行了破坏性处理且都是在常温条件下进行观察，
所以分辨率都受到了限制。到1984年，J. Dubochet等人发展了冷冻生物样品的
方法并总结了得到玻璃态冰的方法
1,2
，这是最早的快速冷冻技术（cryo-freezing）
并开启了“冷冻” 电子显微镜时代。通过将生物大分子的溶液样品快速投入至冷
却到液氮温度的液态乙烷中，得到冰层厚度合适的冷冻样品，然后对冰层中均匀
分布的生物大分子颗粒进行拍照，得到上千张照片。通过算法对拍到的二维照片
进行分析，最终得到其结构，此方法称之为单颗粒分析技术（single particle
analysis）。近些年，随着直接电子探测相机（direct detection device, DDD）的出
现和各种数据处理软件的发展，冷冻电子显微镜解析的生物大分子三维结构所占
比例越来越大（见图1）。比如2020年3月发表在Science杂志的研究通过冷冻
电子显微镜单颗粒分析技术，确定了与胰高血糖素及不同类别的异源三聚体G蛋
白（G
s
或G
i1
）结合的人源胰高血糖素受体（GCGR）3.7 Å和3.9 Å的结构（见
图2）。该研究的多个结构与药理学数据相结合，为II型糖尿病和肥胖症的治疗
提供了重要见解
3
。