2024年6月12日发(作者：漆雕睿哲)
多效价载体疫苗免疫大菱鲆效果评价
王秀华;周凌云;王玉娟;刘琴
【摘 要】采用注射与浸泡2种方法,对构建的多效价载体疫苗MVAV6203A-1进
行了免疫保护效果和血清效价的研究.结果显示,用多效价载体疫苗注射免疫大菱鲆
(Scophthalmus maximus),可同时获得对鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和嗜水气单
胞菌(Aeromonas hydrophila)的免疫保护效果,免疫相对保护率分别为80.6％和
77.0％；用ELISA方法测定血清效价的结果显示,免疫MVAV6203A-1后大菱鲆血
清效价最高达到2 048,均值为891,明显高于对照组的97；用多效价载体疫苗浸泡
免疫大菱鲆后,对鳗弧菌与嗜水气单胞菌的免疫相对保护率分别为62.2％和11.7％.
血清效价分析显示,实验组与对照组的均值均为64.上述结果表明,所构建的疫苗
MVAV6203A-1可有效提高大菱鲆对鳗弧菌和嗜水气单胞菌的免疫力,并且免疫和
攻毒的途径可能是影响免疫保护效果的因子.本研究旨在为鳗弧菌与嗜水气单胞菌
引起的鱼类疾病防治提供技术支撑.
【期刊名称】《中国水产科学》
【年(卷),期】2011(018)004
【总页数】6页(P918-923)
【关键词】多效价载体疫苗;大菱鲆;鳗弧菌;嗜水气单胞菌;免疫保护率;抗体效价
【作 者】王秀华;周凌云;王玉娟;刘琴
【作者单位】中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东青岛 266071;华东理工大
学,上海 200237;中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东青岛 266071;华东理工
大学,上海 200237
【正文语种】中 文
【中图分类】S96
细菌性疾病已成为危害水产养殖动物的主要病因[1],在所报道的鱼类病原菌中,鳗弧
菌(Vibrio anguillarum)与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是危害养殖鱼
类较重的 2种病原,该病原菌能够感染淡水及海水鱼类,并且在世界范围内流行 [2-
5]。为防治鱼类细菌病,许多国家已进行了鱼类细菌疫苗产品的开发[6],并已取得了
显著的效果[7]。中国鱼类疫苗产业起步晚,从 1993年至今,仅有 3个鱼类疫苗获得
渔药许可,而正式推广使用的国产商品化鱼用疫苗尚为空白。
针对鳗弧菌与嗜水气单胞菌引起的鱼类疾病,Zhou等[8]利用减毒的鳗弧菌为疫苗
载体,将嗜水气单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因导入疫苗载体中,构建了
抗鳗弧菌与嗜水气单胞菌的多效价载体疫苗,为评价该载体疫苗的免疫效果,本研究
从注射和浸泡免疫保护效果及血清效价等方面进行了评价分析。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料与饲育 实验用鱼为养殖大菱鲆,体长为 8.99～9.72 cm,购于海阳市
黄海水产有限公司。养殖用水为地下海水与淡水勾兑,盐度28,恒温17.5℃,pH 8.0。
实验鱼经暂养10 d后用于实验,免疫后流水养殖,日投喂配合饵料2次,日投饵量占
体质量的1.5%。
1.1.2 疫苗及毒株 按照 Zhou [8]的方法分别制备疫苗鳗弧菌减毒株
MVAV6203(空载体)疫苗和多效价载体疫苗MVAV6203A-1。攻毒用菌株,为鳗弧
菌MVM425和嗜水气单胞菌菌株LSA34。
1.1.3 抗大菱鲆IgM抗体 抗大菱鲆 IgM单克隆抗体(Product no:F08)购于英国
Aquatic Diagnostic Ltd。HRP标记的羊抗鼠 IgG(Lot#6117)购于天根生化科技
(北京)有限公司。
1.2 方法
1.2.1 免疫方法 疫苗免疫实验在山东潍坊实验点进行,养殖用水族箱为直径 1.0 m
的圆形玻璃钢桶(有效水体0.5 m3)。免疫分组及免疫剂量见表1。注射免疫组分别
使用了 MVAV6203A-1、MVAV6203和生理盐水,后二者作为对照;浸泡组使用了
MVAV6203A-1、 MVAV6203和海水,后二者亦为对照。注射免疫剂量为0.1
mL/尾,浸泡免疫的时间为30 min。
1.2.2 攻毒感染与免疫相对保护率 免疫30 d后,将受免鱼随机分成3个攻毒组,每
组18～22尾,分别用鳗弧菌MVM425和嗜水气单胞菌LSA34攻毒,经预实验确定,
攻毒用 MVM425和 LSA34浓度分别为 2×108 CFU/mL与 5×108 CFU/mL,注射
体积为0.1mL/尾。攻毒2周后,计算免疫相对保护率(RPS)。
1.2.3 血清采集 免疫 30 d后,各组取鱼 5尾,尾静脉采血。将采集的血液置于灭菌
的EP管中,4℃静置过夜,次日3 000 g 离心,移取血清、-20℃暂存待测。
1.2.4 血清效价ELISA检测 血清抗体效价检测参照抗体使用说明进行,具体步骤: 用
含 0.05%多聚赖氨酸的包被缓冲液(w/v)包被 96孔酶标板(50 µL/well),60 min后
低盐洗液洗板2次;每孔加入 100 µL MVM425细菌悬液(浓度 1.3×108 cell/mL)4℃
过夜;再向每孔加入 0.05%(v/v) 戊二醛PBS溶液50 µL/well,22℃放置20 min,之
后低盐洗液洗板3次,用250 µL 1%(w/v)的BSA封闭,22℃过夜,次日低盐洗液洗
板 3次;再分别向每孔中加入 100 µL不同稀释倍数的鱼血清与空白对照PBS,每个
稀释度作2个平行,22℃放置3 h后高盐洗液洗板5次;然后每孔加入100 µL再生
的抗大菱鲆IgM单抗,22℃放置1 h后,高盐洗液洗板5次;再向每孔中加入100 µL
1∶1 000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗,22℃放置60 min,用高盐洗液洗板5次;
之后每孔加入100 µL显色底物溶液,22℃显色 10 min;最后每孔加入 50 µL
H2SO4 (2 mol/L)终止反应,用酶标仪在450 nm处读OD值。 结果判定参照Kim
Thompson1) Aquatic Diagnostic Ltd.,Institute of Aquaculture University of
Stirling,Stirling,Scotland,FK9 4LA推荐的方法(2008 个人通信): 分析波长 450
nm 处样品(P)和空白对照(N)的OD值,计算P/N比值,P/N≥3.0时样品为阳性,P/N
＜3.0时样品为阴性。
1.2.5 血清平均效价的计算 按照加权法计算各平行样品的平均效价G,G=lg-
1(∑flgx/∑f)。
表1 免疫鱼实验分组、尾数和免疫剂量Tab.1 Design of immune groups,dose
of vaccine and number of immunized fish?
2 结果与分析
2.1 注射免疫组攻毒后的存活率及免疫相对保护率
图1是注射免疫 MVAV6203A-1和 MVAV 6203、且用MVM425攻毒后的大菱
鲆存活率,分别为84.6%和88.2%,均高于对照组的20%。图2是注射免疫各组大
菱鲆用LSA34攻毒2周后的存活率,分别为89.7%和66.7%,对照组仅为50%。图
3是MVAV6203A-1和MVAV6203注射免疫后的大菱鲆对MVM425与LSA34
的相对保护率,可见MVAV6203A-1组分别为80.6%和77.0%,MVAV 6203组分
别为85.3%、33.3%。
图1 注射免疫各组大菱鲆用MVM425攻毒,2周内的存活率Fig.1 Survival rate
of turbot in 2 weeks after challenged with larum virulent strain
MVM425 in zed groups
图2 注射免疫各组大菱鲆用LSA34攻毒,2周内的存活率Fig.2 Survival rate of
turbot in 2 weeks after challenged with hila virulent strain LSA34
in zed groups
图3 MVAV6203A-1与MVAV6203两和疫苗注射免疫大菱鲆30 d后,对
MVM425 和LSA34的相对保护率Fig.3 Relative percent survival(RPS) of
vaccines MVAV6203A-1 and MVAV6203 immunized turbot 30 d later by
t virulent strain larum MVM425 and hila LSA34
by nge
2.2 浸泡免疫组大菱鲆攻毒后的存活率及免疫相对保护率
如图 4所示,大菱鲆经浸泡免疫 30 d后,用MVM425攻毒感染 2周
后,MVAV6203A-1与MVAV6203组的存活率分别为63.0%、27.9%,均高于海水
对照组的存活率 10%;如图 5所示,用LSA34攻毒2周后,MVAV6203A-1与
MVAV6203组的存活率分别为 26.9%、18.0%;如图 6所示,MVAV6203A-1免疫
组对 MVM425及 LSA34的免疫保护率分别为 62.2%、11.7%,MVAV6203免疫
组对MVM425及LSA34的免疫保护率分别为25.3%、8.9%,。
2.3 血清效价
图4 浸泡免疫各组大菱鲆用MVM425攻毒，2周内的存活率Fig.4 Survival rate
of turbot in 2 weeks after challenged with larum virulent strain
MVM425 in immersion immunized groups
图5 浸泡免疫各组大菱鲆用LSA34攻毒，2周内的存活率Fig.5 Survival rate of
turbot in 2 weeks after challenged with hila virulent strain LSA34
in immersion immunized groups
对免疫 30天后的实验鱼血清进行抗体效价分析,结果显示,注射免疫
MVAV6203A-1、MVAV6203的两组鱼,其血清效价最高、分别为891与512,是
空白对照组的9和5倍;浸泡免疫各组的血清效价均为 64,疫苗组与对照组间没有
差别。各组血清抗体效价的检测结果见表2.
图6 MVAV6203A-1与MVAV6203两种疫苗浸泡免疫大菱鲆30 d后对
MVM425与LSA34的相对保护率Fig.6 RPS of vaccines MVAV6203A-1 and
MVAV6203 immunized turbot 30 d later by immersion against virulent
strain larum MVM425 and hila LSA34 by nge
3 讨论
海水养殖鱼类病原菌种类较多,应用单价疫苗进行鱼病免疫防治往往不能收到显著
的防病效果,因此研究开发多效价的疫苗产品,达到经过一次免疫可同时实现对多种
病原的免疫防治是未来疫苗研究的重要方向。本研究从免疫保护率与血清抗体效价
2个方面评价了多效价载体疫苗MVAV6203A-1的免疫效果,发现大菱鲆腹腔注射
免疫多效价载体疫苗 MVAV6203A-1后,不仅可获得对鳗弧菌的免疫保护
(PRS=80.2%),同时还获得了对嗜水气单胞菌的免疫保护(RPS=78.9%)。血清效价
检测发现,大菱鲆经 MVAV6203A-1免疫后,血清中抗体的平均效价是对照组的 9
倍,提示疫苗免疫后,鳗弧菌载体中导入的嗜水气单胞菌保护性抗原GAPDH蛋白被
鱼体免疫系统有效识别加工并提呈。
GAPDH在哺乳动物细胞内除了具有糖酵解功能外,还具有膜融合、微管成束、
DNA复制与修复等多种生物学功能[9],GAPHD也存在于革兰氏阳性与阴性细菌中
[10-11],在革兰氏阴性细菌中GAPHD高度保守,且同源性较高[12]。在病原微生物
中,GAPDH具有毒力因子作用[13]及免疫原性[14],研究者利用从迟缓爱德华氏菌
中分离出的GAPDH免疫牙鲆后,发现免疫后的牙鲆对鳗弧菌具有免疫保护效果
[11]。本实验中应用鳗弧菌空载体疫苗免疫大菱鲆时,对嗜水气单胞菌的免疫保护
率仅为 33.3%,推测该低的免疫保护效果可能是由于鳗弧菌空载体中的GAPDH发
挥了一定的免疫效果,而将嗜水气单胞菌 GAPHD基因导入鳗弧菌空载体后,其效果
得到显著提高(图3)。
表2 注射与浸泡免疫各组大菱鲆血清效价分析Tab.2 Antibody titer in plasma
of turbot in immersion immunized groups免疫方式way of
immunization疫苗组别vaccine group抗体效价范围(均值)scope of antibody
titer (mean)浸泡免疫immersion immunization 海水 sea water 32−128(64)注
射免疫intraperitoneal injection immunization 生理盐水normal saline
64−256(97)MVAV6203A-1 32−128(64)MVAV6203
32−128(64)MVAV6203A-1 256−2048(891)MVAV6203 512−512(512)
实验中应用多效价载体疫苗进行浸泡免疫时,免疫保护率低于注射组的免疫保护率,
类似结果在前人的研究中也有发现[15-16]。作者推测这种现象可能与攻毒感染的
评价方法有关,由于鱼类免疫系统中黏膜免疫相对独立于系统免疫之外 [17-18],浸
泡免疫时体表黏膜免疫系统鳃和皮肤发挥作用[19],浸泡免疫提高黏膜中抗体效价
优于口服与注射免疫[17],皮肤黏液中的抗体效价提高可以增强疫苗浸泡免疫的保
护效果[20]。注射免疫能够提高外周血液中的抗体效价,浸泡免疫不能(表2)。在攻
毒方式上,采用腹腔注射攻毒可使病原直接进入到鱼体内部,导致浸泡免疫后体表黏
膜中抗体的保护作用降低。由此可推测,采用注射攻毒的方法不能确切地反映浸泡
免疫的实际保护效果,在后续研究中也发现,浸泡疫苗免疫后采用浸泡攻毒获得的免
疫保护效果明显高于注射攻毒(待发表论文),在翘嘴鳜细菌浸泡疫苗研究结果中也有
得出相同的结论[21]。因此,在对疫苗进行免疫保护效果评价时,对采用的免疫与感
染途径需进行综合考虑,以获得疫苗的最佳评价效果。另外,本研究中浸泡免疫后,尚
未测试浸泡攻毒感染的免疫保护效果研究及黏膜中抗体效价,有待进一步的研究。
参考文献:
[1]Toranzo A E,Magariños B,Romalde J L.A review of the main bacterial fish
diseases in mariculture systems[J].Aquaculture,2005,246: 37-61.
[2]Toranzo A E,Barja J L.A review of the taxonomy and seroepizootiology of
vibrio anguillarum,with special reference to aquaculture in the Northwest
of Spain[J].Dis Aquat Org ,1990,9: 73–82.
[3]陈吉祥,李彩凤,颜显辉,等.大菱鲆病原鳗弧菌生物学及分子特征研究[J].高技术通
讯,2005,15(6): 92-96.
[4]Jiravanichpaisal P,Roos S,Edsman L,et al.A highly virulent
pathogen,Aeromonas hydrophila,from the freshwater crayfish Pacifastacus
leniusculus[J].J Invertebr Pathol,2009,10(1): 56-66.
[5]刘金玉,杨五名,李爱华,等.斑点叉尾 套肠症的病原学初步研究[J].水生生物学
报,2008,32(6): 824-831.
[6]Vinitnantharat S,Gravningen K,Greger vaccines[J].Adv Vet
Med,1999,41: 539-550.
[7]Sommerset I,Krossøy B,Biering E,et es for fish in
aquaculture[J].Expert Rev Vaccines,2005,4(1): 89-101.
[8]Zhou L Y,Wang X H,Liu Q,et al.A novel multivalent vaccine based on
secretary antigen-delivery induces protective immunity against Vibrio
anguillarum and Aeromonas hydrophila[J].J Biotechnol,2010,146: 25-30.
[9]Sirover M insights into an old protein: the functional diversity of
mammalian glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase[J].Biochim
Biophys Acta,1999,1432(2):159-184.
[10]Iddar A,Valverde F,Assobhei O,et read occurrence of non-
phosphorylating glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase among
gram-positive bacteria[J].Int Microbiol 2005,8: 251-258.
[11]Liu Y,Oshima S,Kawai aldehyde-3-phosphate dehydrogenase
of Edwardsiella tarda has protective antigenicity against Vibrio anguillarum
in Japanese flounder[J].Dis Aquat Org,2007,75: 217-220.
[12]Liu Y,Oshima S,Kurohara K,et e efficacy of recombinant
GAPDH of Edwardsiella tarda against edwardsiellosis[J].Microbiol
Immunol,2005,49: 605-612.
[13]Vijay P,Gursharan S eeping enzymes as virulence factors for
pathogens[J].J Med Microbiol,2003,293:391-401.
[14]朱洪伟,朱战波,崔玉东,等.金黄色葡萄球菌重组 GapC蛋白的 GAPDH 活性及
免疫原性分析[J].生物工程学报,2008,24(5): 754-759.
[15]Crosbie P B B,Nowak B responses of barramundi,Lates
calcarifer (Bloch),after administration of an experimental Vibrio harveyi
bacterin by intraperitoneal injection,anal intubation and immersion[J].J Fish
Dis,2004,27: 623–632.
[16]吴志鹏,王三英.三联疫苗对大黄鱼常见细菌性疾病免疫保护的实验研究[J].厦门
大学学报: 自然科学版,2004,43(1): 115-118.
[17]Xu Z,Chen C F,Mao Z J,et ion of serum and mucosal antibody
production and antibody secreting cells(ASCs) in large yellow croaker
(Pseudosciaena crocea) following vaccination with Vibrio harveyi via
different routes[J].Aquaculture,2009,287: 243–247.
[18]罗霞,潘厚军,巩华,等.鳜浸泡嗜水气单胞菌全菌疫苗后皮肤黏液抗体的变化[J].
中国水产科学,2007,14(5):824-828.
[19]Vervarcke S,Ollevier F,Kinget l response in African catfish
after administration of Vibrio anguillarum O2 antigens via different
routes[J].Fish Shellf Immunol,2005,18: 125-133.
[20]Esteve-Gassent M D,Nielsen M E,Amaro kinetics of antibody
production in mucus and serum of European eel(Anguilla anguilla L.) after
vaccination against Vibrio vulnificus: development of a new method for
antibody quantification in skin mucus[J].Fish Shellf Immunol,2003,15: 51–
61.
[21]陈昌福,李静,杨广,等.浸泡接种疫苗对翘嘴鳜细菌性烂鳃病的免疫效果[J].华中
农业大学学报,1996,15(1):52-55.
2024年6月12日发(作者：漆雕睿哲)
多效价载体疫苗免疫大菱鲆效果评价
王秀华;周凌云;王玉娟;刘琴
【摘 要】采用注射与浸泡2种方法,对构建的多效价载体疫苗MVAV6203A-1进
行了免疫保护效果和血清效价的研究.结果显示,用多效价载体疫苗注射免疫大菱鲆
(Scophthalmus maximus),可同时获得对鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和嗜水气单
胞菌(Aeromonas hydrophila)的免疫保护效果,免疫相对保护率分别为80.6％和
77.0％；用ELISA方法测定血清效价的结果显示,免疫MVAV6203A-1后大菱鲆血
清效价最高达到2 048,均值为891,明显高于对照组的97；用多效价载体疫苗浸泡
免疫大菱鲆后,对鳗弧菌与嗜水气单胞菌的免疫相对保护率分别为62.2％和11.7％.
血清效价分析显示,实验组与对照组的均值均为64.上述结果表明,所构建的疫苗
MVAV6203A-1可有效提高大菱鲆对鳗弧菌和嗜水气单胞菌的免疫力,并且免疫和
攻毒的途径可能是影响免疫保护效果的因子.本研究旨在为鳗弧菌与嗜水气单胞菌
引起的鱼类疾病防治提供技术支撑.
【期刊名称】《中国水产科学》
【年(卷),期】2011(018)004
【总页数】6页(P918-923)
【关键词】多效价载体疫苗;大菱鲆;鳗弧菌;嗜水气单胞菌;免疫保护率;抗体效价
【作 者】王秀华;周凌云;王玉娟;刘琴
【作者单位】中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东青岛 266071;华东理工大
学,上海 200237;中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东青岛 266071;华东理工
大学,上海 200237
【正文语种】中 文
【中图分类】S96
细菌性疾病已成为危害水产养殖动物的主要病因[1],在所报道的鱼类病原菌中,鳗弧
菌(Vibrio anguillarum)与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是危害养殖鱼
类较重的 2种病原,该病原菌能够感染淡水及海水鱼类,并且在世界范围内流行 [2-
5]。为防治鱼类细菌病,许多国家已进行了鱼类细菌疫苗产品的开发[6],并已取得了
显著的效果[7]。中国鱼类疫苗产业起步晚,从 1993年至今,仅有 3个鱼类疫苗获得
渔药许可,而正式推广使用的国产商品化鱼用疫苗尚为空白。
针对鳗弧菌与嗜水气单胞菌引起的鱼类疾病,Zhou等[8]利用减毒的鳗弧菌为疫苗
载体,将嗜水气单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因导入疫苗载体中,构建了
抗鳗弧菌与嗜水气单胞菌的多效价载体疫苗,为评价该载体疫苗的免疫效果,本研究
从注射和浸泡免疫保护效果及血清效价等方面进行了评价分析。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料与饲育 实验用鱼为养殖大菱鲆,体长为 8.99～9.72 cm,购于海阳市
黄海水产有限公司。养殖用水为地下海水与淡水勾兑,盐度28,恒温17.5℃,pH 8.0。
实验鱼经暂养10 d后用于实验,免疫后流水养殖,日投喂配合饵料2次,日投饵量占
体质量的1.5%。
1.1.2 疫苗及毒株 按照 Zhou [8]的方法分别制备疫苗鳗弧菌减毒株
MVAV6203(空载体)疫苗和多效价载体疫苗MVAV6203A-1。攻毒用菌株,为鳗弧
菌MVM425和嗜水气单胞菌菌株LSA34。
1.1.3 抗大菱鲆IgM抗体 抗大菱鲆 IgM单克隆抗体(Product no:F08)购于英国
Aquatic Diagnostic Ltd。HRP标记的羊抗鼠 IgG(Lot#6117)购于天根生化科技
(北京)有限公司。
1.2 方法
1.2.1 免疫方法 疫苗免疫实验在山东潍坊实验点进行,养殖用水族箱为直径 1.0 m
的圆形玻璃钢桶(有效水体0.5 m3)。免疫分组及免疫剂量见表1。注射免疫组分别
使用了 MVAV6203A-1、MVAV6203和生理盐水,后二者作为对照;浸泡组使用了
MVAV6203A-1、 MVAV6203和海水,后二者亦为对照。注射免疫剂量为0.1
mL/尾,浸泡免疫的时间为30 min。
1.2.2 攻毒感染与免疫相对保护率 免疫30 d后,将受免鱼随机分成3个攻毒组,每
组18～22尾,分别用鳗弧菌MVM425和嗜水气单胞菌LSA34攻毒,经预实验确定,
攻毒用 MVM425和 LSA34浓度分别为 2×108 CFU/mL与 5×108 CFU/mL,注射
体积为0.1mL/尾。攻毒2周后,计算免疫相对保护率(RPS)。
1.2.3 血清采集 免疫 30 d后,各组取鱼 5尾,尾静脉采血。将采集的血液置于灭菌
的EP管中,4℃静置过夜,次日3 000 g 离心,移取血清、-20℃暂存待测。
1.2.4 血清效价ELISA检测 血清抗体效价检测参照抗体使用说明进行,具体步骤: 用
含 0.05%多聚赖氨酸的包被缓冲液(w/v)包被 96孔酶标板(50 µL/well),60 min后
低盐洗液洗板2次;每孔加入 100 µL MVM425细菌悬液(浓度 1.3×108 cell/mL)4℃
过夜;再向每孔加入 0.05%(v/v) 戊二醛PBS溶液50 µL/well,22℃放置20 min,之
后低盐洗液洗板3次,用250 µL 1%(w/v)的BSA封闭,22℃过夜,次日低盐洗液洗
板 3次;再分别向每孔中加入 100 µL不同稀释倍数的鱼血清与空白对照PBS,每个
稀释度作2个平行,22℃放置3 h后高盐洗液洗板5次;然后每孔加入100 µL再生
的抗大菱鲆IgM单抗,22℃放置1 h后,高盐洗液洗板5次;再向每孔中加入100 µL
1∶1 000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗,22℃放置60 min,用高盐洗液洗板5次;
之后每孔加入100 µL显色底物溶液,22℃显色 10 min;最后每孔加入 50 µL
H2SO4 (2 mol/L)终止反应,用酶标仪在450 nm处读OD值。 结果判定参照Kim
Thompson1) Aquatic Diagnostic Ltd.,Institute of Aquaculture University of
Stirling,Stirling,Scotland,FK9 4LA推荐的方法(2008 个人通信): 分析波长 450
nm 处样品(P)和空白对照(N)的OD值,计算P/N比值,P/N≥3.0时样品为阳性,P/N
＜3.0时样品为阴性。
1.2.5 血清平均效价的计算 按照加权法计算各平行样品的平均效价G,G=lg-
1(∑flgx/∑f)。
表1 免疫鱼实验分组、尾数和免疫剂量Tab.1 Design of immune groups,dose
of vaccine and number of immunized fish?
2 结果与分析
2.1 注射免疫组攻毒后的存活率及免疫相对保护率
图1是注射免疫 MVAV6203A-1和 MVAV 6203、且用MVM425攻毒后的大菱
鲆存活率,分别为84.6%和88.2%,均高于对照组的20%。图2是注射免疫各组大
菱鲆用LSA34攻毒2周后的存活率,分别为89.7%和66.7%,对照组仅为50%。图
3是MVAV6203A-1和MVAV6203注射免疫后的大菱鲆对MVM425与LSA34
的相对保护率,可见MVAV6203A-1组分别为80.6%和77.0%,MVAV 6203组分
别为85.3%、33.3%。
图1 注射免疫各组大菱鲆用MVM425攻毒,2周内的存活率Fig.1 Survival rate
of turbot in 2 weeks after challenged with larum virulent strain
MVM425 in zed groups
图2 注射免疫各组大菱鲆用LSA34攻毒,2周内的存活率Fig.2 Survival rate of
turbot in 2 weeks after challenged with hila virulent strain LSA34
in zed groups
图3 MVAV6203A-1与MVAV6203两和疫苗注射免疫大菱鲆30 d后,对
MVM425 和LSA34的相对保护率Fig.3 Relative percent survival(RPS) of
vaccines MVAV6203A-1 and MVAV6203 immunized turbot 30 d later by
t virulent strain larum MVM425 and hila LSA34
by nge
2.2 浸泡免疫组大菱鲆攻毒后的存活率及免疫相对保护率
如图 4所示,大菱鲆经浸泡免疫 30 d后,用MVM425攻毒感染 2周
后,MVAV6203A-1与MVAV6203组的存活率分别为63.0%、27.9%,均高于海水
对照组的存活率 10%;如图 5所示,用LSA34攻毒2周后,MVAV6203A-1与
MVAV6203组的存活率分别为 26.9%、18.0%;如图 6所示,MVAV6203A-1免疫
组对 MVM425及 LSA34的免疫保护率分别为 62.2%、11.7%,MVAV6203免疫
组对MVM425及LSA34的免疫保护率分别为25.3%、8.9%,。
2.3 血清效价
图4 浸泡免疫各组大菱鲆用MVM425攻毒，2周内的存活率Fig.4 Survival rate
of turbot in 2 weeks after challenged with larum virulent strain
MVM425 in immersion immunized groups
图5 浸泡免疫各组大菱鲆用LSA34攻毒，2周内的存活率Fig.5 Survival rate of
turbot in 2 weeks after challenged with hila virulent strain LSA34
in immersion immunized groups
对免疫 30天后的实验鱼血清进行抗体效价分析,结果显示,注射免疫
MVAV6203A-1、MVAV6203的两组鱼,其血清效价最高、分别为891与512,是
空白对照组的9和5倍;浸泡免疫各组的血清效价均为 64,疫苗组与对照组间没有
差别。各组血清抗体效价的检测结果见表2.
图6 MVAV6203A-1与MVAV6203两种疫苗浸泡免疫大菱鲆30 d后对
MVM425与LSA34的相对保护率Fig.6 RPS of vaccines MVAV6203A-1 and
MVAV6203 immunized turbot 30 d later by immersion against virulent
strain larum MVM425 and hila LSA34 by nge
3 讨论
海水养殖鱼类病原菌种类较多,应用单价疫苗进行鱼病免疫防治往往不能收到显著
的防病效果,因此研究开发多效价的疫苗产品,达到经过一次免疫可同时实现对多种
病原的免疫防治是未来疫苗研究的重要方向。本研究从免疫保护率与血清抗体效价
2个方面评价了多效价载体疫苗MVAV6203A-1的免疫效果,发现大菱鲆腹腔注射
免疫多效价载体疫苗 MVAV6203A-1后,不仅可获得对鳗弧菌的免疫保护
(PRS=80.2%),同时还获得了对嗜水气单胞菌的免疫保护(RPS=78.9%)。血清效价
检测发现,大菱鲆经 MVAV6203A-1免疫后,血清中抗体的平均效价是对照组的 9
倍,提示疫苗免疫后,鳗弧菌载体中导入的嗜水气单胞菌保护性抗原GAPDH蛋白被
鱼体免疫系统有效识别加工并提呈。
GAPDH在哺乳动物细胞内除了具有糖酵解功能外,还具有膜融合、微管成束、
DNA复制与修复等多种生物学功能[9],GAPHD也存在于革兰氏阳性与阴性细菌中
[10-11],在革兰氏阴性细菌中GAPHD高度保守,且同源性较高[12]。在病原微生物
中,GAPDH具有毒力因子作用[13]及免疫原性[14],研究者利用从迟缓爱德华氏菌
中分离出的GAPDH免疫牙鲆后,发现免疫后的牙鲆对鳗弧菌具有免疫保护效果
[11]。本实验中应用鳗弧菌空载体疫苗免疫大菱鲆时,对嗜水气单胞菌的免疫保护
率仅为 33.3%,推测该低的免疫保护效果可能是由于鳗弧菌空载体中的GAPDH发
挥了一定的免疫效果,而将嗜水气单胞菌 GAPHD基因导入鳗弧菌空载体后,其效果
得到显著提高(图3)。
表2 注射与浸泡免疫各组大菱鲆血清效价分析Tab.2 Antibody titer in plasma
of turbot in immersion immunized groups免疫方式way of
immunization疫苗组别vaccine group抗体效价范围(均值)scope of antibody
titer (mean)浸泡免疫immersion immunization 海水 sea water 32−128(64)注
射免疫intraperitoneal injection immunization 生理盐水normal saline
64−256(97)MVAV6203A-1 32−128(64)MVAV6203
32−128(64)MVAV6203A-1 256−2048(891)MVAV6203 512−512(512)
实验中应用多效价载体疫苗进行浸泡免疫时,免疫保护率低于注射组的免疫保护率,
类似结果在前人的研究中也有发现[15-16]。作者推测这种现象可能与攻毒感染的
评价方法有关,由于鱼类免疫系统中黏膜免疫相对独立于系统免疫之外 [17-18],浸
泡免疫时体表黏膜免疫系统鳃和皮肤发挥作用[19],浸泡免疫提高黏膜中抗体效价
优于口服与注射免疫[17],皮肤黏液中的抗体效价提高可以增强疫苗浸泡免疫的保
护效果[20]。注射免疫能够提高外周血液中的抗体效价,浸泡免疫不能(表2)。在攻
毒方式上,采用腹腔注射攻毒可使病原直接进入到鱼体内部,导致浸泡免疫后体表黏
膜中抗体的保护作用降低。由此可推测,采用注射攻毒的方法不能确切地反映浸泡
免疫的实际保护效果,在后续研究中也发现,浸泡疫苗免疫后采用浸泡攻毒获得的免
疫保护效果明显高于注射攻毒(待发表论文),在翘嘴鳜细菌浸泡疫苗研究结果中也有
得出相同的结论[21]。因此,在对疫苗进行免疫保护效果评价时,对采用的免疫与感
染途径需进行综合考虑,以获得疫苗的最佳评价效果。另外,本研究中浸泡免疫后,尚
未测试浸泡攻毒感染的免疫保护效果研究及黏膜中抗体效价,有待进一步的研究。
参考文献:
[1]Toranzo A E,Magariños B,Romalde J L.A review of the main bacterial fish
diseases in mariculture systems[J].Aquaculture,2005,246: 37-61.
[2]Toranzo A E,Barja J L.A review of the taxonomy and seroepizootiology of
vibrio anguillarum,with special reference to aquaculture in the Northwest
of Spain[J].Dis Aquat Org ,1990,9: 73–82.
[3]陈吉祥,李彩凤,颜显辉,等.大菱鲆病原鳗弧菌生物学及分子特征研究[J].高技术通
讯,2005,15(6): 92-96.
[4]Jiravanichpaisal P,Roos S,Edsman L,et al.A highly virulent
pathogen,Aeromonas hydrophila,from the freshwater crayfish Pacifastacus
leniusculus[J].J Invertebr Pathol,2009,10(1): 56-66.
[5]刘金玉,杨五名,李爱华,等.斑点叉尾 套肠症的病原学初步研究[J].水生生物学
报,2008,32(6): 824-831.
[6]Vinitnantharat S,Gravningen K,Greger vaccines[J].Adv Vet
Med,1999,41: 539-550.
[7]Sommerset I,Krossøy B,Biering E,et es for fish in
aquaculture[J].Expert Rev Vaccines,2005,4(1): 89-101.
[8]Zhou L Y,Wang X H,Liu Q,et al.A novel multivalent vaccine based on
secretary antigen-delivery induces protective immunity against Vibrio
anguillarum and Aeromonas hydrophila[J].J Biotechnol,2010,146: 25-30.
[9]Sirover M insights into an old protein: the functional diversity of
mammalian glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase[J].Biochim
Biophys Acta,1999,1432(2):159-184.
[10]Iddar A,Valverde F,Assobhei O,et read occurrence of non-
phosphorylating glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase among
gram-positive bacteria[J].Int Microbiol 2005,8: 251-258.
[11]Liu Y,Oshima S,Kawai aldehyde-3-phosphate dehydrogenase
of Edwardsiella tarda has protective antigenicity against Vibrio anguillarum
in Japanese flounder[J].Dis Aquat Org,2007,75: 217-220.
[12]Liu Y,Oshima S,Kurohara K,et e efficacy of recombinant
GAPDH of Edwardsiella tarda against edwardsiellosis[J].Microbiol
Immunol,2005,49: 605-612.
[13]Vijay P,Gursharan S eeping enzymes as virulence factors for
pathogens[J].J Med Microbiol,2003,293:391-401.
[14]朱洪伟,朱战波,崔玉东,等.金黄色葡萄球菌重组 GapC蛋白的 GAPDH 活性及
免疫原性分析[J].生物工程学报,2008,24(5): 754-759.
[15]Crosbie P B B,Nowak B responses of barramundi,Lates
calcarifer (Bloch),after administration of an experimental Vibrio harveyi
bacterin by intraperitoneal injection,anal intubation and immersion[J].J Fish
Dis,2004,27: 623–632.
[16]吴志鹏,王三英.三联疫苗对大黄鱼常见细菌性疾病免疫保护的实验研究[J].厦门
大学学报: 自然科学版,2004,43(1): 115-118.
[17]Xu Z,Chen C F,Mao Z J,et ion of serum and mucosal antibody
production and antibody secreting cells(ASCs) in large yellow croaker
(Pseudosciaena crocea) following vaccination with Vibrio harveyi via
different routes[J].Aquaculture,2009,287: 243–247.
[18]罗霞,潘厚军,巩华,等.鳜浸泡嗜水气单胞菌全菌疫苗后皮肤黏液抗体的变化[J].
中国水产科学,2007,14(5):824-828.
[19]Vervarcke S,Ollevier F,Kinget l response in African catfish
after administration of Vibrio anguillarum O2 antigens via different
routes[J].Fish Shellf Immunol,2005,18: 125-133.
[20]Esteve-Gassent M D,Nielsen M E,Amaro kinetics of antibody
production in mucus and serum of European eel(Anguilla anguilla L.) after
vaccination against Vibrio vulnificus: development of a new method for
antibody quantification in skin mucus[J].Fish Shellf Immunol,2003,15: 51–
61.
[21]陈昌福,李静,杨广,等.浸泡接种疫苗对翘嘴鳜细菌性烂鳃病的免疫效果[J].华中
农业大学学报,1996,15(1):52-55.