2024年11月2日发(作者：锐冰心)
结核分枝杆菌分泌蛋白MPB64小鼠单克隆抗体制备、纯化
及鉴定
马荣;陈振;黑龙;赵志军;徐广贤;戈朝晖
【摘 要】目的 应用细胞融合技术制备和鉴定抗MPB64单克隆抗体.方法 采用重
组目的蛋白pET32a-MPB64(680bp)为免疫原,免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细
胞与小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞融合.间接ELISA法筛选分泌抗体的杂交瘤细胞,采用有
限稀释方法对所有筛选确认的阳性细胞株进行亚克隆,杂交瘤细胞诱导小鼠产生腹
水,再用蛋白G亲和层析法纯化抗体,通过间接ELISA、Western Blot鉴定该单克
隆抗体.结果 通过杂交瘤技术获得10株可稳定分泌抗MPB64单克隆抗体的细胞
株.以命名的“1A3”单抗细胞株进行腹水制备,经鉴定腹水效价＞1∶720000,经纯
化抗体效价约为1∶720000,抗体浓度2.15mg·mL-1.结论 成功制备和获得了抗
MPB64单克隆抗体的细胞株,为MPB64单克隆抗体制备和鉴定奠定了基础.
【期刊名称】《宁夏医科大学学报》
【年(卷),期】2015(037)009
【总页数】4页(P1013-1016)
【关键词】结核分枝杆菌;MPB64;单克隆抗体;杂交瘤技术
【作 者】马荣;陈振;黑龙;赵志军;徐广贤;戈朝晖
【作者单位】宁夏医科大学总医院骨科,银川750004;宁夏医科大学总医院骨科,银
川750004;宁夏医科大学总医院骨科,银川750004;宁夏医科大学总医院检验科,银
川750004;宁夏医科大学检验学院,银川750004;宁夏医科大学总医院骨科,银川
750004
【正文语种】中 文
【中图分类】R378.91+1
E-mail:**************
MPB64蛋白是结核杆菌合成的一种分泌性抗原，其相对分子量为24kDa，是结核
分枝杆菌复合群的一种标志蛋白。我们前期研究中成功构建的MPB64 基因核苷酸
序列测序结果与标准菌株H37RV 核苷酸(GenBank: AY208674．1)序列同源性为
98.36%[1]。免疫介导药物靶向作为一种新型的给药系统受到人们的重视[2]。因此,
制备特异性抗MPB64单克隆抗体，再将其与抗结核药物偶联则可制成免疫介导的
靶向制剂。本研究以构建并表达成功的MPB64蛋白为免疫原，采用细胞融合技术，
制备抗MPB64单克隆抗体，为后续单克隆抗体偶联载抗结核药物实现靶向治疗脊
柱结核奠定基础。
1.1 材料、试剂与仪器
1.1.1 试剂和仪器
重组质粒pET32a-MPB64、表达蛋白(pET32a)、表达载体(S748)由本实验室制备
保存。完全福氏佐剂(CFA)、不完全福氏佐剂(IFA)；山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP、
胎牛血清、DMEM、HAT均购于Sigma 公司；PEG 4000 购于Merck；HiTrap
protein G、硝酸纤维素膜购于美国Amersham 公司；蛋白Marker 购于美国
Fermentas公司；其他试剂为分析纯，国产试剂。超滤管(Millipore)；T-25培养
瓶(corning公司)；96、24孔培养板NEST公司；透析袋(BLUEBIRD)。 DEM-3
型自动洗板机(北京拓普分析仪器有限责任公司)；酶标仪(BIO-RAD 680)；二氧化
碳培养箱(SANYO)；HD-4层析工作站(上海沪西仪器厂)；层析柱(Phamacia)；蛋
白质电泳转移仪(Bio-Rad 公司)。
1.1.2 实验动物及细胞系
Balb/C小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司。Sp2/0细胞购自北京康为世纪
生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 动物免疫
按文献方法[3]取300μg·mL-1的结核分枝杆菌重组蛋白pET32a-MPB64 250μL,
与等体积的福氏完全佐剂混合并充分乳化后,背部皮下多点免疫5只雌性Balb/C
小鼠.每间隔3周加强免疫1次,加强免疫时改用福氏不完全佐剂,抗原量减半,福氏
不完全佐剂和注射途径同初次免疫。第二次加强免疫后第10天尾静脉取血测效价,
血清效价>1∶20000,已达融合标准。再经10d后，经脾内终加强免疫一次，注射
与初次免疫等剂量的抗原PBS溶液。5d后取小鼠脾细胞与SP2/ 0 细胞融合。细
胞融合、杂交瘤细胞筛选及克隆化均按文献[3]进行。
1.2.2 细胞融合
①细胞融合：采用PEG常规融合方法进行细胞融合。共铺5块板，第8天进行细
胞上清检测。
②融合筛选：于融合后的第3、6天换液处理，于融合后第7～14天筛选融合细胞：
采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)方法(详见1.2.5)对融合细胞上清筛选，经过两次
筛选，最终确认阳性细胞孔进行单克隆化。
1.2.3 阳性细胞株亚克隆及建株
采用有限稀释方法对所有筛选确认的阳性细胞株进行亚克隆，待细胞集落生长至显
微镜视野1/3时吸取上清进行筛选(方法详见1.2.5间接ELISA)；待亚克隆阳性率
达到100%时，正式建株，每株细胞冻存5支以上。
1.2.4 抗MPB64单克隆抗体Western blot纯化鉴定
取上清上样2μg经SDS一PAGE变性蛋白电泳后，转膜、丽春红染色、Western
blot封闭液Ⅱ封闭；孵育一抗，TBST洗膜5次后孵育二抗，再次洗膜后ECL
Western blot Kit高灵敏度化学发光检测试剂盒显色、曝光。
1.2.5 单克隆抗体细胞株的鉴定——间接ELISA
包被抗原，浓度2μg·mL-1，100μL/孔，4℃过夜，洗液洗涤3次。加150μL /孔
封闭液，37℃ 2h后，洗涤3次，拍干。置4℃冰箱保存备用。加待测样品血清或
纯化抗体或腹水，第一个孔1∶1000稀释，往下以1∶3的梯度倍比稀释，37℃
孵育30min，洗板4次，拍干。
细胞上清检测，吸取细胞上清100μL，加入对应的酶标板中，37℃孵育30min，
洗板4次，拍干。
取辣根酶标记的羊抗鼠IgG按1∶5000倍稀释后，100μL /孔，37℃孵育20至
30min,洗涤4次，拍干。1×TMB按100μL /孔加入，37℃显色15～30min。加
2M H2SO450μL /孔终止反应。读数时以450nm单波长测定各孔OD值，以与
阴性对照孔OD值的比值(P/N)大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界
点。筛选阳性细胞时，P/N>2.1的判别为阳性细胞；1
被浓度后再次检测，P/N>2.1的仍判为阳性。效价以P/N<2.1的血清或纯化抗体
或腹水的最大稀释倍数表示。
1.2.6 杂交瘤细胞株腹水制备及腹水效价检测
取10只BALB/C小鼠，每只注射0.5mL石蜡油，7d后取“1A3”融合阳性率达
100%的杂交瘤细胞重悬于无血清培养基中，按1×106个细胞/0.5mL/只量注射石
蜡小鼠，注射细胞约7～14d后收集腹水。间接ELISA方法测定腹水效价并及时
冻存。腹水效价检测详见步骤同1.2.5。
1.2.7 腹水纯化及抗体效价检测
用Binding Buffer平衡protein G亲和柱至基线平稳；将腹水样品上柱，收集流
穿液；将流穿液再次上柱，继续平衡至基线平稳。加入Eluting Buffer洗脱，收
集洗脱峰。用0.01M, pH7.2 PBS透析收集的洗脱峰，使纯化后的抗体保存在
0.01M, pH7.2 PBS环境中。用蛋白定量检测仪测定纯化后单抗的浓度，间接
ELISA检测抗体效价(步骤同1.2.5)。
2.1 亚克隆及建株
选择细胞上清中重组MPB64蛋白OD值高，pET32a 蛋白OD值低的细胞孔，从
而排除针对载体的细胞株，筛选出针对MPB64蛋白的阳性细胞株；将对应的阳性
细胞株转入24孔中，进行复测，进一步确认，共转55个细胞孔；对融合后筛选
得到的针对MPB64蛋白的阳性细胞，同时与无关的pET32a载体蛋白交叉反应低
的细胞孔，应用有限稀释法进行亚克隆；经过3次亚克隆阳性率达100%，正式建
株10株细胞分别命名为1A3D1、1F5C10、2D8B11、2E5A2、3D2A1、3G4A5、
4G8A9、4H8A1、5F5A5、5G9A9，获得10株能稳定分泌针对MPB64的抗体
的杂交瘤细胞株。细胞上清Western blot检测结果均呈阳性，见图1。
2.2 腹水效价检测结果
包被抗原选择重组质粒pET32a- MPB64蛋白，2μg·mL-1包被，包被量100μL，
检测波长：OD450nm, 按照3倍的比例进行稀释,且腹水效价>1∶720000(表1)。
2.3 抗体浓度及体积
抗体浓度2.15mg·mL-1、抗体体积3.5mL、抗体总量7.525mg。
2.4 纯化MPB64单抗效价检测
包被抗原选择重组质粒pET32a-MPB64蛋白，2μg·mL-1包被，包被量100μL，
检测波长：450nm，按照3倍的比例进行稀释后还能够被检测到,抗体效价约为
1∶720000(表2)。
2.5 纯化MPB64单抗SDS电泳检测结果
纯化后的抗体进行电泳，抗体变性后有两条带，一条是抗体的轻链为24kD，另一
条为抗体的重链为50kD，见图2。
目前单克隆抗体的研究与开发已进入实用阶段，有不少单克隆抗体产品上市和应用，
单克隆抗体与药物连接后，形成药物-载体-抗体复合物，能载带更多的药物分子，
可将药物靶向输送给病灶部位[4-6]。牛结核杆菌具有多种保护性抗原成分,其中
MPB64 蛋白由牛结核杆菌基因组RD2区基因编码分泌的24 kD蛋白抗原，是引
起细胞和体液免疫十分重要的免疫原，在感染的早期可刺激T淋巴细胞迅速增殖
和释放高水平的IFN-γ，有效地激活巨噬细胞，从而控制结核病感染[7]。本研究
采用细胞融合技术，成功制备了抗MPB64单克隆抗体，为后续研究提供了有价值
的工具。首先它们能作为结核分枝杆菌特异性抗体与抗原结合；其次能够在结核抗
原的检测中发挥巨大的作用；再者抗MPB64单克隆抗体可成为靶向标志偶联抗结
核药物，用于结核病的靶向治疗，为实现靶向治疗脊柱结核奠定基础。
研究选择对结核分枝杆菌相对耐受的小鼠作为实验动物，该种动物模型中亚单位疫
苗免疫效果可接近卡介苗。为获得较好的免疫效果使用佐剂联合免疫是一种有效的
手段，在杂交瘤的制备过程中，我们对动物免疫的免疫蛋白和佐剂的配比浓度进行
了一些改变，第一次加强免疫和第二次加强免疫均采用与初次免疫等剂量的不完全
佐剂，而免疫蛋白较初次免疫减半，这样在采血检测效价时血清效价>1∶20000
已达融合标准。此方法不仅大大缩短了动物免疫的时间，同时使乳化和免疫效果均
达最佳。制备获得了10株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，经鉴定上清Western
blot检测的细胞上清均呈阳性，且10株细胞株均能与真核表达的MPB64蛋白反
应。
在制备小鼠腹水前，为提高腹水效价，我们先检测细胞培养上清液中单抗的效价，
挑选效价高的细胞生长状态好的单抗细胞株进行扩大培养并制备腹水。单抗纯化后
的纯度对于后续研究和应用有着至关重要的作用，选择何种纯化方法至关重要。离
子交换层析法、辛酸二步法、硫胺法均可得到纯化的抗体，但三者之间操作步骤和
费用，纯化的单抗从纯化的浓度、纯度、活性等方面有显著差异[8]。本研究对单
抗纯度要求较高，选择离子交换层析法纯化后的抗体纯度达100%，可应用于科研
分析。
本研究对所制备的单克隆抗体进行了简单的性质鉴定，后续研究中还需完善对单克
隆抗体进行亚型鉴定、抗体识别抗原表位进行鉴定。制备的抗MPB64单克隆抗体
为后期的科学研究提供了重要的工具，如可针对临床上牛结核分泌抗原MPB64的
检测、免疫色谱法抗MPB64单克隆抗体检测和诊断结核分枝杆菌。本研究对单抗
纯度要求较高，选择离子交换层析法纯化后的抗体纯度达100%，为后续单克隆抗
体偶联抗结核药物提供了抗体。
[1] 石华,戈朝晖,贾伟,等.结合分枝杆菌分泌蛋白MPB64表达纯化[J].宁夏医科大
学学报，2011,33(8):704-707.
[2] Rastodi R,Sultana Y,Ali A, et ulate and vesicular drug carriers in
the mannagement of tuberculosis[J].Curr Deliv,2006,3(1):121-128.
[3] 萨姆布鲁克J,拉塞尔DW.分子克隆实验指南[M].3版.北京：科学出版社，
2002：105-110.
[4] 张利红,刘祥磊,谷银芳,等.中和性VEGF单抗的制备及其对肺癌的抑制作用[J].
中国细胞生物学学报,2015,37(4):477-485.
[5] 孔君,刘箐,韩跃武,等.单克隆抗体制备技术的最新进展及应用前景[J].免疫学杂
志,2011,27(2):170-173.
[6] Clynes RA,Towers TL,Presta LG,et tory fc receptors modulate in
vivo cytotoxicity against tumor targets[J]. Nat Med，2000,6(4):443-446.
[7] Singh H B, Singh P, Jadaun G P, et al . Simultaneous use of two PCR
systems targeting IS6110 and MPB64 for confirmation of diagnosis of
tuberculous lymphadenitis[J].Commun Dis,2006,38(3):274-279.
[8] 陆学东,张小艳,张银辉.结核分支杆菌H37Rv株菌体抗原单克隆抗体制备、特
性分析及纯化[J].中华结核和呼吸杂志,2000,23(11):672-675.
2024年11月2日发(作者：锐冰心)
结核分枝杆菌分泌蛋白MPB64小鼠单克隆抗体制备、纯化
及鉴定
马荣;陈振;黑龙;赵志军;徐广贤;戈朝晖
【摘 要】目的 应用细胞融合技术制备和鉴定抗MPB64单克隆抗体.方法 采用重
组目的蛋白pET32a-MPB64(680bp)为免疫原,免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细
胞与小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞融合.间接ELISA法筛选分泌抗体的杂交瘤细胞,采用有
限稀释方法对所有筛选确认的阳性细胞株进行亚克隆,杂交瘤细胞诱导小鼠产生腹
水,再用蛋白G亲和层析法纯化抗体,通过间接ELISA、Western Blot鉴定该单克
隆抗体.结果 通过杂交瘤技术获得10株可稳定分泌抗MPB64单克隆抗体的细胞
株.以命名的“1A3”单抗细胞株进行腹水制备,经鉴定腹水效价＞1∶720000,经纯
化抗体效价约为1∶720000,抗体浓度2.15mg·mL-1.结论 成功制备和获得了抗
MPB64单克隆抗体的细胞株,为MPB64单克隆抗体制备和鉴定奠定了基础.
【期刊名称】《宁夏医科大学学报》
【年(卷),期】2015(037)009
【总页数】4页(P1013-1016)
【关键词】结核分枝杆菌;MPB64;单克隆抗体;杂交瘤技术
【作 者】马荣;陈振;黑龙;赵志军;徐广贤;戈朝晖
【作者单位】宁夏医科大学总医院骨科,银川750004;宁夏医科大学总医院骨科,银
川750004;宁夏医科大学总医院骨科,银川750004;宁夏医科大学总医院检验科,银
川750004;宁夏医科大学检验学院,银川750004;宁夏医科大学总医院骨科,银川
750004
【正文语种】中 文
【中图分类】R378.91+1
E-mail:**************
MPB64蛋白是结核杆菌合成的一种分泌性抗原，其相对分子量为24kDa，是结核
分枝杆菌复合群的一种标志蛋白。我们前期研究中成功构建的MPB64 基因核苷酸
序列测序结果与标准菌株H37RV 核苷酸(GenBank: AY208674．1)序列同源性为
98.36%[1]。免疫介导药物靶向作为一种新型的给药系统受到人们的重视[2]。因此,
制备特异性抗MPB64单克隆抗体，再将其与抗结核药物偶联则可制成免疫介导的
靶向制剂。本研究以构建并表达成功的MPB64蛋白为免疫原，采用细胞融合技术，
制备抗MPB64单克隆抗体，为后续单克隆抗体偶联载抗结核药物实现靶向治疗脊
柱结核奠定基础。
1.1 材料、试剂与仪器
1.1.1 试剂和仪器
重组质粒pET32a-MPB64、表达蛋白(pET32a)、表达载体(S748)由本实验室制备
保存。完全福氏佐剂(CFA)、不完全福氏佐剂(IFA)；山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP、
胎牛血清、DMEM、HAT均购于Sigma 公司；PEG 4000 购于Merck；HiTrap
protein G、硝酸纤维素膜购于美国Amersham 公司；蛋白Marker 购于美国
Fermentas公司；其他试剂为分析纯，国产试剂。超滤管(Millipore)；T-25培养
瓶(corning公司)；96、24孔培养板NEST公司；透析袋(BLUEBIRD)。 DEM-3
型自动洗板机(北京拓普分析仪器有限责任公司)；酶标仪(BIO-RAD 680)；二氧化
碳培养箱(SANYO)；HD-4层析工作站(上海沪西仪器厂)；层析柱(Phamacia)；蛋
白质电泳转移仪(Bio-Rad 公司)。
1.1.2 实验动物及细胞系
Balb/C小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司。Sp2/0细胞购自北京康为世纪
生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 动物免疫
按文献方法[3]取300μg·mL-1的结核分枝杆菌重组蛋白pET32a-MPB64 250μL,
与等体积的福氏完全佐剂混合并充分乳化后,背部皮下多点免疫5只雌性Balb/C
小鼠.每间隔3周加强免疫1次,加强免疫时改用福氏不完全佐剂,抗原量减半,福氏
不完全佐剂和注射途径同初次免疫。第二次加强免疫后第10天尾静脉取血测效价,
血清效价>1∶20000,已达融合标准。再经10d后，经脾内终加强免疫一次，注射
与初次免疫等剂量的抗原PBS溶液。5d后取小鼠脾细胞与SP2/ 0 细胞融合。细
胞融合、杂交瘤细胞筛选及克隆化均按文献[3]进行。
1.2.2 细胞融合
①细胞融合：采用PEG常规融合方法进行细胞融合。共铺5块板，第8天进行细
胞上清检测。
②融合筛选：于融合后的第3、6天换液处理，于融合后第7～14天筛选融合细胞：
采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)方法(详见1.2.5)对融合细胞上清筛选，经过两次
筛选，最终确认阳性细胞孔进行单克隆化。
1.2.3 阳性细胞株亚克隆及建株
采用有限稀释方法对所有筛选确认的阳性细胞株进行亚克隆，待细胞集落生长至显
微镜视野1/3时吸取上清进行筛选(方法详见1.2.5间接ELISA)；待亚克隆阳性率
达到100%时，正式建株，每株细胞冻存5支以上。
1.2.4 抗MPB64单克隆抗体Western blot纯化鉴定
取上清上样2μg经SDS一PAGE变性蛋白电泳后，转膜、丽春红染色、Western
blot封闭液Ⅱ封闭；孵育一抗，TBST洗膜5次后孵育二抗，再次洗膜后ECL
Western blot Kit高灵敏度化学发光检测试剂盒显色、曝光。
1.2.5 单克隆抗体细胞株的鉴定——间接ELISA
包被抗原，浓度2μg·mL-1，100μL/孔，4℃过夜，洗液洗涤3次。加150μL /孔
封闭液，37℃ 2h后，洗涤3次，拍干。置4℃冰箱保存备用。加待测样品血清或
纯化抗体或腹水，第一个孔1∶1000稀释，往下以1∶3的梯度倍比稀释，37℃
孵育30min，洗板4次，拍干。
细胞上清检测，吸取细胞上清100μL，加入对应的酶标板中，37℃孵育30min，
洗板4次，拍干。
取辣根酶标记的羊抗鼠IgG按1∶5000倍稀释后，100μL /孔，37℃孵育20至
30min,洗涤4次，拍干。1×TMB按100μL /孔加入，37℃显色15～30min。加
2M H2SO450μL /孔终止反应。读数时以450nm单波长测定各孔OD值，以与
阴性对照孔OD值的比值(P/N)大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界
点。筛选阳性细胞时，P/N>2.1的判别为阳性细胞；1
被浓度后再次检测，P/N>2.1的仍判为阳性。效价以P/N<2.1的血清或纯化抗体
或腹水的最大稀释倍数表示。
1.2.6 杂交瘤细胞株腹水制备及腹水效价检测
取10只BALB/C小鼠，每只注射0.5mL石蜡油，7d后取“1A3”融合阳性率达
100%的杂交瘤细胞重悬于无血清培养基中，按1×106个细胞/0.5mL/只量注射石
蜡小鼠，注射细胞约7～14d后收集腹水。间接ELISA方法测定腹水效价并及时
冻存。腹水效价检测详见步骤同1.2.5。
1.2.7 腹水纯化及抗体效价检测
用Binding Buffer平衡protein G亲和柱至基线平稳；将腹水样品上柱，收集流
穿液；将流穿液再次上柱，继续平衡至基线平稳。加入Eluting Buffer洗脱，收
集洗脱峰。用0.01M, pH7.2 PBS透析收集的洗脱峰，使纯化后的抗体保存在
0.01M, pH7.2 PBS环境中。用蛋白定量检测仪测定纯化后单抗的浓度，间接
ELISA检测抗体效价(步骤同1.2.5)。
2.1 亚克隆及建株
选择细胞上清中重组MPB64蛋白OD值高，pET32a 蛋白OD值低的细胞孔，从
而排除针对载体的细胞株，筛选出针对MPB64蛋白的阳性细胞株；将对应的阳性
细胞株转入24孔中，进行复测，进一步确认，共转55个细胞孔；对融合后筛选
得到的针对MPB64蛋白的阳性细胞，同时与无关的pET32a载体蛋白交叉反应低
的细胞孔，应用有限稀释法进行亚克隆；经过3次亚克隆阳性率达100%，正式建
株10株细胞分别命名为1A3D1、1F5C10、2D8B11、2E5A2、3D2A1、3G4A5、
4G8A9、4H8A1、5F5A5、5G9A9，获得10株能稳定分泌针对MPB64的抗体
的杂交瘤细胞株。细胞上清Western blot检测结果均呈阳性，见图1。
2.2 腹水效价检测结果
包被抗原选择重组质粒pET32a- MPB64蛋白，2μg·mL-1包被，包被量100μL，
检测波长：OD450nm, 按照3倍的比例进行稀释,且腹水效价>1∶720000(表1)。
2.3 抗体浓度及体积
抗体浓度2.15mg·mL-1、抗体体积3.5mL、抗体总量7.525mg。
2.4 纯化MPB64单抗效价检测
包被抗原选择重组质粒pET32a-MPB64蛋白，2μg·mL-1包被，包被量100μL，
检测波长：450nm，按照3倍的比例进行稀释后还能够被检测到,抗体效价约为
1∶720000(表2)。
2.5 纯化MPB64单抗SDS电泳检测结果
纯化后的抗体进行电泳，抗体变性后有两条带，一条是抗体的轻链为24kD，另一
条为抗体的重链为50kD，见图2。
目前单克隆抗体的研究与开发已进入实用阶段，有不少单克隆抗体产品上市和应用，
单克隆抗体与药物连接后，形成药物-载体-抗体复合物，能载带更多的药物分子，
可将药物靶向输送给病灶部位[4-6]。牛结核杆菌具有多种保护性抗原成分,其中
MPB64 蛋白由牛结核杆菌基因组RD2区基因编码分泌的24 kD蛋白抗原，是引
起细胞和体液免疫十分重要的免疫原，在感染的早期可刺激T淋巴细胞迅速增殖
和释放高水平的IFN-γ，有效地激活巨噬细胞，从而控制结核病感染[7]。本研究
采用细胞融合技术，成功制备了抗MPB64单克隆抗体，为后续研究提供了有价值
的工具。首先它们能作为结核分枝杆菌特异性抗体与抗原结合；其次能够在结核抗
原的检测中发挥巨大的作用；再者抗MPB64单克隆抗体可成为靶向标志偶联抗结
核药物，用于结核病的靶向治疗，为实现靶向治疗脊柱结核奠定基础。
研究选择对结核分枝杆菌相对耐受的小鼠作为实验动物，该种动物模型中亚单位疫
苗免疫效果可接近卡介苗。为获得较好的免疫效果使用佐剂联合免疫是一种有效的
手段，在杂交瘤的制备过程中，我们对动物免疫的免疫蛋白和佐剂的配比浓度进行
了一些改变，第一次加强免疫和第二次加强免疫均采用与初次免疫等剂量的不完全
佐剂，而免疫蛋白较初次免疫减半，这样在采血检测效价时血清效价>1∶20000
已达融合标准。此方法不仅大大缩短了动物免疫的时间，同时使乳化和免疫效果均
达最佳。制备获得了10株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，经鉴定上清Western
blot检测的细胞上清均呈阳性，且10株细胞株均能与真核表达的MPB64蛋白反
应。
在制备小鼠腹水前，为提高腹水效价，我们先检测细胞培养上清液中单抗的效价，
挑选效价高的细胞生长状态好的单抗细胞株进行扩大培养并制备腹水。单抗纯化后
的纯度对于后续研究和应用有着至关重要的作用，选择何种纯化方法至关重要。离
子交换层析法、辛酸二步法、硫胺法均可得到纯化的抗体，但三者之间操作步骤和
费用，纯化的单抗从纯化的浓度、纯度、活性等方面有显著差异[8]。本研究对单
抗纯度要求较高，选择离子交换层析法纯化后的抗体纯度达100%，可应用于科研
分析。
本研究对所制备的单克隆抗体进行了简单的性质鉴定，后续研究中还需完善对单克
隆抗体进行亚型鉴定、抗体识别抗原表位进行鉴定。制备的抗MPB64单克隆抗体
为后期的科学研究提供了重要的工具，如可针对临床上牛结核分泌抗原MPB64的
检测、免疫色谱法抗MPB64单克隆抗体检测和诊断结核分枝杆菌。本研究对单抗
纯度要求较高，选择离子交换层析法纯化后的抗体纯度达100%，为后续单克隆抗
体偶联抗结核药物提供了抗体。
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