2024年11月1日发(作者：藏乐心)
中 文 说 明 书
Anti-HiBiT Monoclonal
Antibody
适用产品目录号：
N7200、N7210
2023
原英文技术手册
版 CTM719
TM719
Anti-HiBiT Monoclonal Antibody
所有技术文献的英文原版均可在
本。如果您在使用该试剂盒时有任何问题，请与
/ protocols 获得。请访问该网址以确定您使用的说明书是否为最新版
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1. 描述 ....................................................................................................................................................................................2
2. 产品组分和储存条件............................................................................................................................................................3
3. 免疫印迹分析 ......................................................................................................................................................................3
3. A. 一般注意事项 ............................................................................................................................................................ 3
3. B. 示例操作流程 ............................................................................................................................................................ 4
3. C. 示例数据....................................................................................................................................................................5
4. 免疫荧光分析 ......................................................................................................................................................................7
4. A. 一般注意事项 ............................................................................................................................................................ 7
4. B. 示例操作流程 ............................................................................................................................................................ 8
4. C. 示例数据....................................................................................................................................................................9
5. 免疫沉淀 ...........................................................................................................................................................................10
5. A. 一般注意事项 .......................................................................................................................................................... 10
5. B. 示例操作流程 .......................................................................................................................................................... 11
5. C. 示例数据..................................................................................................................................................................12
6. 用活细胞进行荧光激活细胞分选（FACS） .......................................................................................................................15
6. A. 一般注意事项 .......................................................................................................................................................... 15
6. B. 示例操作流程 .......................................................................................................................................................... 15
6. C. 示例数据..................................................................................................................................................................17
7. 用固定细胞进行荧光激活细胞分选 ....................................................................................................................................17
7. A. 一般注意事项 .......................................................................................................................................................... 17
7. B. 示例操作流程 ...........................................................................................................................................................18
7. C. 示例数据..................................................................................................................................................................19
8. 抗体结合亲和力和与LgBiT的竞争 ....................................................................................................................................19
9. 疑难排查 ...........................................................................................................................................................................21
9. A. 免疫印迹分析 .......................................................................................................................................................... 21
9. B. 免疫荧光分析 .......................................................................................................................................................... 22
9. C. 免疫沉淀................................................................................................................................................................. 22
9. D. 荧光激活细胞分选....................................................................................................................................................23
10.参考文献 ...........................................................................................................................................................................24
11.相关产品............................................................................................................................................................................24
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1
1.描述
HiBiT蛋白标签为含有11个氨基酸的多肽，在NanoLuc
®
Binary Technology（NanoBiT
®
）中，可与大亚基（LgBiT）
以高亲和力结合，以重建NanoBiT
®
萤光素酶，一种明亮的发光酶（1,2）。可通过多种均质发光信号检测方法轻易定
量HiBiT标记蛋白。鉴于HiBiT体积小且检测灵敏度高，因此其是通过基因组编辑技术（例如CRISPR/Cas9）实现基
因插入的理想标签，从而导致HiBiT标记蛋白发生内源性表达（3）。还可通过HiBiT克隆载体将HiBiT标签加入至蛋
白中或者通过PCR法或基因合成法直接将其加入至现有蛋白表达构建体中。可通过查看并接受使用条款和条件（网址：
/HiBiT-Synthesis）获得序列以及合成HiBiT标签的权利。
Anti-HiBiT Monoclonal Antibody
(a)
是一款可与HiBiT标签发生结合的强效、特异性小鼠单克隆抗体（mAb），可用于
免疫印迹分析、免疫荧光分析、免疫沉淀分析和荧光激活细胞分选（FACS）等应用场景。抗体与HiBiT结合亲和力较高，
在溶液中，其KD约为6pM。鉴于结合亲和力高且背景结合低，因此可检测到大量的内源表达水平HiBiT标记蛋白。
Anti-HiBiT Monoclonal Antibody可用于抗体应用场景标准操作流程。本中文说明书包括免疫印迹分析、免疫荧光分析、
免疫沉淀分析和FACS的示例操作流程和代表数据。
表1. Anti-HiBiT Monoclonal Antibody规格说明
浓度
储存缓冲液
偶联物
克隆编号
宿主物种
抗体形式
同型
纯化方法
免疫原
1.0mg/ml
含50%甘油的磷酸盐缓冲盐水（PBS, pH 7.3）
未偶联
30E5
小鼠
纯化后免疫球蛋白
带κ轻链的IgG2c
蛋白A树脂
合成HiBiT肽
2
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2.
产品组分和储存条件
产品规格目录号
Anti-HiBiT Monoclonal Antibody
100µgN7200
5 × 100µgN7210
储存条件：Anti-HiBiT Monoclonal Antibody是无菌过滤的溶液，溶于含50%甘油的PBS，产品中不含叠氮化钠。抗体
以干冰冷冻运输。接收后，解冻抗体，短暂离心片刻，从而收集管侧或管盖上溶液。抗体置于-30℃至-10℃（该条件下
呈液态）条件下储存。
3. 免疫印迹分析
3.A. 一般注意事项
鉴于Anti-HiBiT Monoclonal Antibody的高结合亲和力和低本底，因此可检测较低水平的HiBiT标记蛋白。使用标准
HRP偶联二抗和化学发光底物，可检测到哺乳动物细胞裂解物中浓度≤1pg（本底校正后）的HiBiT标记蛋白。尽管膜
或交叉反应带所致本底信号会升高，但灵敏度更高的化学发光底物可实现检测更低浓度的的HiBiT标记蛋白，因此可需
对抗体浓度进行优化。使用Anti-HiBiT Monoclonal Antibody进行免疫印迹分析时，一般应可检测到CRISPR修饰细胞
系中大多数内源性水平HiBiT标记蛋白。
Nano-Glo
®
HiBiT Blotting System（目录号：N2410）是一款用于HiBiT标记蛋白的替代性无抗体印迹分析产品，依赖
与试剂中LgBiT亚基互补，仅在膜上的HiBiT带上特异性产生NanoBiT复合物。HiBiT印迹分析方法产生的发光信号可
能会比免疫印迹分析更暗淡，但由于HiBiT印迹分析方法的生物发光本底极低，因此有时该系统展现出的灵敏度可能比
免疫印迹分析更高（信背比更高），尤其是它可以进行长时间曝光来整合信号。
用户需提供的材料
• gel transfer system (例如iBlot™ 2 Gel Transfer System, Thermo Fisher Scientific, 目录号：IB21001)
• PVDF 或 nitrocellulose membrane (例如iBlot™ 2 Transfer Stacks, PVDF, Thermo Fisher Scientific 目录号：
IB24001或iBlot™ 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, Thermo Fisher Scientific, 目录号：IB23001)
• Tris-buffered saline solution (25mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 7.5)
• Tween
®
20, Molecular Biology Grade (例如目录号：H5152)
• nonfat dry milk（NFDM） (例如Research Products International, 目录号：M17200-50)
• HRP-conjugated anti-mouse secondary antibody (Anti-Mouse IgG (H+L), HRP Conjugate, 目录号：W4021)
• ECL Western Blotting Substrate (目录号：W1001)
• 化学发光成像仪
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3.B. 示例操作流程
1. SDS-PAGE，使用iBlot™ 2 Gel Transfer System等将蛋白转移至PVDF或硝化纤维膜上。
说明：若有需要，置滤纸上干燥PVDF膜（例如过夜）。操作前，先将PVDF膜置甲醇中润湿数秒。
2. 于TBST缓冲液[Tris缓冲盐水+0.1%（v/v）Tween
®
20]中冲洗膜。
3. 在室温条件下，于平台摇摆振荡器上将膜置于封闭缓冲液[TBST+5%（w/v）脱脂奶粉（NFDM）]中封闭1小时。
说明：已针对NFDM封闭进行优化。使用其他封闭试剂（例如牛血清白蛋白或SuperBlock™ Blocking Buffer）可
能导致较高水平的膜本底或交叉反应条带。
4. 使用封闭缓冲液将Anti-HiBiT Monoclonal Antibody稀释至1µg/ml。使用一抗溶液替换膜上的封闭缓冲液，并于4℃
条件下振荡孵育过夜。
说明：
a. 有时，将浓度降至0.2µg/ml可降低交叉反应条带强度。优化抗体浓度可提高信背比。使用灵敏度更高底物（例
如SuperSignal™ West Femto，Thermo Fisher Scientific，目录号：34095）时，根据生产商建议将抗体稀释
至0.04–0.2µg/ml。
b. 也可将一抗与膜置于室温条件下孵育2小时。与4℃ 过夜孵育相比，较高温度条件下孵育较短时间可能导致
HiBiT信号强度降低，但也可能导致非预期本底信号降低。
5. 使用TBST洗涤5次，共计约15分钟。
6. 使用封闭缓冲液稀释HRP偶联抗小鼠二抗（例如，Anti-Mouse IgG (H+L), HRP Conjugate，目录号：W4021）
2500至5000倍或根据生产商建议进行稀释。于室温下振荡孵育膜1小时。
说明：极少量HiBiT标记蛋白检测灵敏度可能受标记二抗本底限制。若有可能，将二抗稀释至当无一抗存在时不产
生显著信号的浓度。若使用灵敏度更高底物，则应根据生产商建议将二抗稀释至较低浓度（例如，0.01µg/ml）。
7. 使用TBST洗涤6次，共计约30分钟。
8. 加入ECL Western Blotting Substrate，使之刚好覆盖膜并孵育1分钟。
说明：对于极低水平蛋白，可使用灵敏度更高底物（例如，SuperSignal™ West Femto Maximum Sensitivity
Substrate，Thermo Fisher Scientific，目录号：34095）并降低一抗和二抗浓度。
9. 从底物溶液中取出膜，并用吸水纸巾吸干多余液体，然后置于两块透明塑料片间。
10. 使用化学发光成像仪或胶片对膜进行成像（曝光时间适宜）。
4
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3.C. 示例数据
图1为哺乳动物细胞裂解物中低浓度HiBiT标记蛋白的灵敏检测（与其他蛋白的交叉反应性极小）。
A.B.
gg
p
gg
p
gg
5
pp
ggg
5
pp
ggg
g
250
ppp
250
ppp
p
125000
g
125000
......
p
......
24
kDa
250
148
98
64
50
36
16
A
T
1
4
4
8
1
图1. 与Nano-Glo
®
HiBiT Blotting System相比，Anti-HiBiT Monoclonal Antibody免疫印迹分析灵敏度和特异
性。使用K562哺乳动物细胞裂解物（Mass Spec Compatible Human Protein Extract, Intact；目录号：V6941）对
HaloTag
®
-HiBiT蛋白（4；HiBiT Control Protein，目录号：N3010）进行系列稀释，从而制备样品（含0.125–4pg标记
蛋白；稀释到10µg裂解物蛋白）。SDS-PAGE分析后，将凝胶转移至PVDF或硝化纤维素膜上，并使用iBlot™ 2 Gel
Transfer Device（Thermo Fisher Scientific，目录号：IB21001）、1µg/ml一抗、0.2µg/ml HRP偶联二抗（Anti-Mouse
IgG (H+L), HRP Conjugate，目录号：W4021）和ECL Western Blotting Substrate（目录号：W1015）进行免疫印迹分析。
图A. PVDF上Anti-HiBiT Monoclonal Antibody免疫印迹分析，曝光60分钟，曝光量范围（scale）1200–15000。图B.为
进行比较，将重复的凝胶转移到硝化纤维素膜上，以进行Nano-Glo
®
HiBiT印迹测定（目录号：N2410），依赖于酶互
补作用，从膜上HiBiT标记蛋白质产生特定的生物发光信号。硝酸纤维素上HiBiT印迹曝光60分钟，曝光量范围（scale）
1500–5000。缩放2个16位图像的低于膜本底至高于2pg条带强度这一部分。
与免疫印迹分析相比，Nano-Glo
®
HiBiT经常较暗，但哺乳动物裂解物中几乎无非特异性条带。使用Anti-HiBiT
Monoclonal Antibody进行免疫印迹分析可实现哺乳动物裂解物中皮克水平以下HiBiT标记蛋白的可视化。即便曝光1小
时，交叉反应条带信号和膜本底信号仍较低，因此可实现少量标记蛋白的灵敏检测。
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3.C. 示例数据（续）
图2为表达内源性水平HiBiT标记蛋白的CRISPR修饰细胞裂解物的免疫印迹分析。
levels.
kDa
250
148
98
64
50
36
1
8
4
4
2
T
A
16
图2. CRISPR修饰细胞裂解物的免疫印迹分析。使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对HeLa细胞进行编辑，从而将
HiBiT标签加入至HSP90B1、EGFR、HDAC2和CFL1的C末端。HSP90B1 HiBiT细胞代表主要含HiBiT阴性细胞的
CRISPR修饰混合细胞池，而其他三份样品代表分离后HiBiT阳性克隆物。使用4–20% SDS-PAGE梯度凝胶对10µg
细胞裂解物进行分析，使用iBlot™ 2 Gel Transfer Device （Thermo Fisher Scientific，目录号：IB21001）将其转移至
PVDF膜上，并根据第3.B节所述内容进行免疫印迹分析（曝光5分钟）。泳道1亲本HeLa细胞。泳道2 HSP90B1
HiBiT池（93kDa）。泳道3 EGFR-HiBiT克隆物（135kDa）泳道4 HDAC2-HiBiT克隆物（56kDa）泳道5 CFL1-
HiBiT克隆物（19kDa）。
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e
L
a
P
a
r
e
n
t
a
l
H
S
P
9
0
B
1
-
H
i
B
i
T
P
o
o
l
E
G
F
R
-
H
i
B
i
T
C
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o
n
e
H
D
A
C
2
-
H
i
B
i
T
C
l
o
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C
F
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1
-
H
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l
o
n
e
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4. 免疫荧光分析
4.A. 一般注意事项
可通过荧光免疫显微技术以及Anti-HiBiT Monoclonal Antibody实现HiBiT标记蛋白的定位。虽然抗体的亲和力和特异
性可促进大量内源性表达HiBiT标记蛋白的灵敏检测，但荧光显微技术的灵敏度可能比微孔板形式的生物发光检测系统
（例如Nano-Glo
®
HiBiT Lytic Detection System（目录号：N3030））低约2个数量级。因此，其中发光信号比不表达
HiBiT的亲本细胞系的发光信号低几百倍的细胞系在显微镜下可能具有接近背景的荧光信号，特别是对于具有扩散定位的
蛋白质。表达 LgBiT 的细胞可能显示 HiBiT 染色大幅降低，这是因为抗体和LgBiT亚基之间存在HiBiT结合竞争（参见
第8节）。
用户需提供的材料
• 成像板 (例如Cellvis, 目录号：P96-1.5H-N)
• 多聚甲醛 (例如Electron Microscopy Sciences, 目录号：15710)
• 磷酸盐缓冲盐水 (例如DPBS, GIBCO™ 目录号：14190)
• Tween
®
20, Molecular Biology Grade (例如目录号：H5152)
• Triton
®
X-100 (例如目录号：H5141)
• 正常山羊血清 (例如Abcam, 目录号：ab7481)
• 荧光标记的抗小鼠二抗 (例如Thermo Fisher Scientific, 目录号：A-21235)
• 荧光显微镜 (例如Keyence BZ-X800)
• 可选：Hoechst stain (例如Hoechst 33342 Solution, Thermo Fisher Scientific, 目录号：62249)
4.B. 示例操作流程
1. 使用玻璃底成像板培养贴壁细胞。
说明：下述一种或多种对照可能有助于确定HiBiT信号或优化染色条件：
• 不表达HiBiT的亲本细胞（用一抗和二抗染色），代表所有来源荧光信号本底，且是确定表达HiBiT的细胞系中
HiBiT标记蛋白对应信号的最佳对照。
• 单独用二抗染色的亲本或表达HiBiT的细胞，代表标记二抗荧光信号本底。若本底与上述对照接近，则所用
Anti-HiBiT Monoclonal Antibody浓度不会导致本底升高。降低二抗浓度可降低本底并实现灵敏检测。
• 未染色亲本或表达HiBiT的细胞，代表自发荧光信号本底（某些通道中较为显著）。与上述对照比较，可确定
标记二抗对应荧光本底。
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4.B. 示例操作流程（续）
2. 取出培养基，用PBS洗涤1次，并于室温条件下用4%多聚甲醛PBS溶液固定10分钟。
说明：也可用Anti-HiBiT Monoclonal Antibody对甲醇等有机溶剂固定细胞进行染色。
3. 用PBS洗涤3次，每次5分钟。
4. 于室温条件下使用PBS+0.2%（v/v）Triton
®
X-100对细胞进行透化处理。
5. 用PBS洗涤3次，每次5分钟。
6. 于室温条件下，使用含5%（v/v）正常山羊血清（NGS）的PBST（PBS+0.05% Tween
®
20）封闭1小时。
说明：我们建议使用二抗获取物种血清进行封闭。
7. 取出封闭试剂，加入1µg/ml Anti-HiBiT Monoclonal Antibody（用封闭缓冲液（PBST+5% NGS）稀释）。于室温
条件下孵育2小时。
说明：也可于4℃条件下过夜孵育抗体，但此操作可能导致非特异性本底信号升高。
8. 用PBST洗涤3次， 5分钟。
9. 用1:1000稀释度抗小鼠Alexa Fluor
®
647偶联山羊二抗（最终浓度为2µg/ml）或您所选二抗（用封闭缓冲液稀释）
进行孵育。于室温，黑暗条件下孵育1小时。
说明：当与表达低水平HiBiT标记蛋白的细胞结合使用时，信号可能接近荧光本底信号（细胞自发荧光信号和二抗
本底信号）。使用远红外通道可显著降低自发荧光本底信号。
10. 用PBST洗涤3次，每次洗涤5分钟，样品应避光。
11. 对于核染色，加入PBS稀释Hoechst染剂（例如，1-5µg/ml），孵育10分钟，然后用PBS洗涤3次。
12. 使用荧光显微镜以及滤光片进行成像。
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4.C. 示例数据
图3 CRISPR修饰HeLa细胞中内源性表达水平HiBiT标记蛋白的成像示例。
A.B.
C.D.
E.F.
G.H.
A
T
3
4
4
8
1
图3. CRISPR修饰HeLa克隆或混合细胞池内源性表达水平HiBiT标记蛋白的免疫荧光成像。在HeLa细胞中，使用
CRISPR/Cas9基因组编辑技术将HiBiT标签加入至以下蛋白的C末端：VCL（图A和B；粘着斑、膜、细胞骨架）；
HDAC2（图C和D；细胞核）；SMARCA4（图E和F；细胞核纤维中心）；和HSP90B1（图G和H；内质网，用结
构化照明实现可视化）。对于HDAC2和SMARCA4，已分离HiBiT阳性克隆。对固定细胞进行免疫染色（如第4.B节所述），
VCL和HSP90B1池中的HiBiT阴性细胞显示低背景荧光。用Anti-HiBiT Monoclonal Antibody和Alexa Fluor
®
647标记
抗小鼠二抗（Thermo Fisher Scientific，目录号：A21235）对固定细胞进行染色，并于Keyence BZ-X800荧光显微镜
上成像。Hoechst细胞核染色（蓝色）叠加图见图B、D、F和H。
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5. 免疫沉淀
5.A. 一般注意事项
Anti-HiBiT Monoclonal Antibody可用于免疫沉淀，从细胞裂解物或其他样品中捕获、浓缩和纯化HiBiT标记蛋白。使用
G蛋白树脂进行抗体固定时，便于样品结合、洗涤和洗脱。可用低pH缓冲液洗脱蛋白或用SDS上样缓冲液并加热洗脱蛋白，
但应注意此操作可能导致抗体洗脱且可能使HiBiT融合蛋白变性。洗脱后抗体可能干扰部分下游应用场景，例如用抗小
鼠二抗对样品进行免疫印迹分析。Nano-Glo
®
HiBiT Blotting System（目录号：N2410）这一无抗体方法是可视化洗脱
液中HiBiT标记蛋白的适宜方法。
若需更为温和洗脱条件，则可使用与合成的HiBiT或DrkBiT肽的竞争。DrkBiT 肽为HiBiT变体，可与LgBiT亚基结合
形成非发光复合物。虽然DrkBiT的抗体亲和力小于HiBiT Peptide，但所用浓度远高于KD，因此可有效阻断HiBiT标记
蛋白（解离自固定化抗体）再结合。使用HiBiT或DrkBiT 肽进行洗脱可能干扰下游HiBiT发光信号检测，除非首先对肽
进行分离（例如采用SDS-PAGE法分离）。由于HiBiT/mAb复合物的解离速率较慢（参见第8节），因此用肽洗脱可
能需相对较长孵育时间（例如过夜）。
用户需提供的材料
• magnetic protein G resin (例如Cytiva Protein G Mag Sepharose, 目录号：28944008)
• Tris缓冲盐水 (25mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 7.5)
• Tween
®
20 (目录号：H5152)
• 哺乳动物裂解缓冲液 (目录号：G9381)
• RQ1 RNase-Free DNase (目录号：M6101)
• Protease Inhibitor Cocktail (目录号：G6521)
• 磁力架 (例如MagneSphere
®
Technology Magnetic Separation Stand, 目录号：Z5342)
• 可选：SDS上样缓冲液
• 可选：低pH缓冲液 (100mM glycine-HCl, pH 2.5)
• 可选：中和缓冲液 (2M Tris-HCl, pH 7.5)
• 可选：合成的HiBiT或DrkBiT肽（网址：/c/global/forms/contact-tailored-rd- solutions-
form/）
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5.B. 示例操作流程
1. 用TBST（Tris缓冲盐水+0.1%吐温20）洗涤G蛋白树脂，并重悬成20%混悬液。
2. 将20µl 20%树脂分装至每管中。
3. 取2µg Anti-HiBiT Monoclonal Antibody，加至每管中，并于室温条件下结合10-20分钟。用磁力架沉淀磁珠，并取
出上清液。从磁力架上取下磁珠，并用移液器吸取1ml TBST清洗磁珠。将试管放回磁力架，取出洗涤液。
说明：抗体可大量结合至树脂，然后将混悬液分装至多个试管中。您也可将抗体加至含HiBiT标记蛋白的样品中，
然后加入G蛋白树脂。
4. 制备含HiBiT的样品，例如，使用哺乳动物裂解缓冲液（添加了RQ1 RNase-Free DNase和Protease Inhibitor
Cocktail）制备细胞裂解物。于4℃，16000×g条件下离心裂解物10分钟，并将上清液转移至新试管中，从而净化裂解物。
5. 取样品（例如200µl净化后细胞裂解物）加至每管中。
6. 于4℃条件下过夜孵育，并上下颠倒旋转。
说明：根据具体应用情况场景，可于室温条件下孵育2小时或根据具体实验条件进行优化。
7. 使用磁力架沉淀磁珠。
8. 取出上清；若有需要，可将上清液转移至新试管中，以供后续分析。
9. 用1ml TBST洗涤磁珠3次。
10. 取出洗涤缓冲液并加入洗脱缓冲液，例如下述操作之一：
• 加入50µl SDS上样缓冲液，并于70℃下条件下加热10分钟。
• 加入50µl 100mM甘氨-HCl（pH 2.5），并于室温条件下孵育5-10分钟（搅拌或端对端旋转）。用20%体积
的2M Tris-HCl（pH 7.5）中和洗脱液。
• 在TBST中加入50µl 10µM 合成的HiBiT或DrkBiT 肽段，并于4℃条件下孵育过夜，并上下颠倒旋转。
说明：若使用HiBiT或DrkBiT，也可于室温条件下孵育和/或孵育更短时间。洗脱程度取决于HiBiT与固定抗体的
解离速率，不同融合蛋白的解离速率可能不同。
11. 将样品上样至凝胶上，并通过SDS-PAGE法进行分析。
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5.C. 示例数据
A.
SupernatantsEluates
Anti-HiBiT mAb
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图4. 瞬时转染HEK293细胞中HiBiT标记萤火虫萤光素酶（Fluc-HiBiT）的免疫沉淀。起始样品为1ml裂解物（含
2×10
6
个细胞/ml），由含Protease Inhibitor Cocktail（目录号：G6521）和RQ1 RNase-Free DNase（目录号：
M6101）的Mammalian Lysis Buffer（目录号：G9381）制成。将Protein G Mag Sepharose（Cytivia，目录号：
28944008）与Anti-HiBiT Monoclonal Antibody、无抗体或阴性对照抗体（抗Myc mAb，克隆编号9E10）一起孵育。
将净化后裂解物样品与Protein G珠子置于4℃条件下过夜孵育。通过与SDS上样缓冲液一起加热，从而洗脱样品，但
含有Anti-HiBiT Monoclonal Antibody的平行重复管也用甘氨酸（pH 2.5）洗脱，置4℃条件下过夜孵育DrkBiT Peptide
或置室温条件下过夜孵育DrkBiT Peptide。图A显示了使用Nano-Glo
®
HiBiT Blotting System （目录号：N2410）对
样品进行分析，以避免洗脱抗体的干扰。将左侧面板缩放到较低的强度，以说明Fluc-HiBiT被Anti-HiBiT Monoclonal
Antibody有效清除，而不是阴性对照。右侧面板按比例缩放到更高的强度，以显示具有Anti-HiBiT Monoclonal Antibody
的洗脱液中Fluc-HiBiT的浓度增加，而不是阴性对照。在图B中，Fluc-HiBiT的萤火虫萤光素酶活性使用ONE
Glo™Assay（录号：E6110）检测，强调Fluc-HiBiT从上清液中的清除率>90%，以及通过用竞争肽洗脱来维持融合伴
侣的酶活性的能力。
12
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75
50
37
25
20
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5
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4
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1
图5. 从CRISPR修饰的HeLa细胞中免疫沉淀HiBiT标记的蛋白质。使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对HeLa细
胞进行编辑，从而将HiBiT标签添加至CFL1、HDAC2、CTNNB1、HDAC6和EGFR的C末端。第5.B节中的标准方
案用于免疫沉淀蛋白质，并分析样品以监测上清液中的蛋白质清除率和洗脱液中的蛋白质回收率。经过净化的细胞裂解
物（0.15ml；5×10
6
个细胞/ml）作为起始样品，通过在4℃下结合过夜并在50µl SDS负载缓冲液中洗脱进行免疫沉淀。
使用Nano-Glo
®
HiBiT Blotting System（目录号：N2410）分析每个原始裂解物样品、上清液和洗脱液的当量体积。在凝
胶加载之前，将来自每个细胞系的三个样品进一步稀释到SDS加载缓冲液中，以使膜上的HiBiT水平更加相似：CFL1（4
倍稀释）、HDAC2（4倍稀度）、CTNNB1（4倍稀释）、HDAC6（无稀释）、EGFR（20倍稀释）。左图和右图分别
代表曝光4分钟和20分钟结果。
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5.C. 示例数据（续）
图6展示了从大肠杆菌裂解物中纯化HiBiT标记的麦芽糖结合蛋白（MBP-HiBiT-His6）的结果。
A.
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kDa
250
150
100
75
Heavy chain
Maltose-binding protein
Light chain
50
37
25
Figure
2024年11月1日发(作者：藏乐心)
中 文 说 明 书
Anti-HiBiT Monoclonal
Antibody
适用产品目录号：
N7200、N7210
2023
原英文技术手册
版 CTM719
TM719
Anti-HiBiT Monoclonal Antibody
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本。如果您在使用该试剂盒时有任何问题，请与
/ protocols 获得。请访问该网址以确定您使用的说明书是否为最新版
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1. 描述 ....................................................................................................................................................................................2
2. 产品组分和储存条件............................................................................................................................................................3
3. 免疫印迹分析 ......................................................................................................................................................................3
3. A. 一般注意事项 ............................................................................................................................................................ 3
3. B. 示例操作流程 ............................................................................................................................................................ 4
3. C. 示例数据....................................................................................................................................................................5
4. 免疫荧光分析 ......................................................................................................................................................................7
4. A. 一般注意事项 ............................................................................................................................................................ 7
4. B. 示例操作流程 ............................................................................................................................................................ 8
4. C. 示例数据....................................................................................................................................................................9
5. 免疫沉淀 ...........................................................................................................................................................................10
5. A. 一般注意事项 .......................................................................................................................................................... 10
5. B. 示例操作流程 .......................................................................................................................................................... 11
5. C. 示例数据..................................................................................................................................................................12
6. 用活细胞进行荧光激活细胞分选（FACS） .......................................................................................................................15
6. A. 一般注意事项 .......................................................................................................................................................... 15
6. B. 示例操作流程 .......................................................................................................................................................... 15
6. C. 示例数据..................................................................................................................................................................17
7. 用固定细胞进行荧光激活细胞分选 ....................................................................................................................................17
7. A. 一般注意事项 .......................................................................................................................................................... 17
7. B. 示例操作流程 ...........................................................................................................................................................18
7. C. 示例数据..................................................................................................................................................................19
8. 抗体结合亲和力和与LgBiT的竞争 ....................................................................................................................................19
9. 疑难排查 ...........................................................................................................................................................................21
9. A. 免疫印迹分析 .......................................................................................................................................................... 21
9. B. 免疫荧光分析 .......................................................................................................................................................... 22
9. C. 免疫沉淀................................................................................................................................................................. 22
9. D. 荧光激活细胞分选....................................................................................................................................................23
10.参考文献 ...........................................................................................................................................................................24
11.相关产品............................................................................................................................................................................24
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1.描述
HiBiT蛋白标签为含有11个氨基酸的多肽，在NanoLuc
®
Binary Technology（NanoBiT
®
）中，可与大亚基（LgBiT）
以高亲和力结合，以重建NanoBiT
®
萤光素酶，一种明亮的发光酶（1,2）。可通过多种均质发光信号检测方法轻易定
量HiBiT标记蛋白。鉴于HiBiT体积小且检测灵敏度高，因此其是通过基因组编辑技术（例如CRISPR/Cas9）实现基
因插入的理想标签，从而导致HiBiT标记蛋白发生内源性表达（3）。还可通过HiBiT克隆载体将HiBiT标签加入至蛋
白中或者通过PCR法或基因合成法直接将其加入至现有蛋白表达构建体中。可通过查看并接受使用条款和条件（网址：
/HiBiT-Synthesis）获得序列以及合成HiBiT标签的权利。
Anti-HiBiT Monoclonal Antibody
(a)
是一款可与HiBiT标签发生结合的强效、特异性小鼠单克隆抗体（mAb），可用于
免疫印迹分析、免疫荧光分析、免疫沉淀分析和荧光激活细胞分选（FACS）等应用场景。抗体与HiBiT结合亲和力较高，
在溶液中，其KD约为6pM。鉴于结合亲和力高且背景结合低，因此可检测到大量的内源表达水平HiBiT标记蛋白。
Anti-HiBiT Monoclonal Antibody可用于抗体应用场景标准操作流程。本中文说明书包括免疫印迹分析、免疫荧光分析、
免疫沉淀分析和FACS的示例操作流程和代表数据。
表1. Anti-HiBiT Monoclonal Antibody规格说明
浓度
储存缓冲液
偶联物
克隆编号
宿主物种
抗体形式
同型
纯化方法
免疫原
1.0mg/ml
含50%甘油的磷酸盐缓冲盐水（PBS, pH 7.3）
未偶联
30E5
小鼠
纯化后免疫球蛋白
带κ轻链的IgG2c
蛋白A树脂
合成HiBiT肽
2
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2.
产品组分和储存条件
产品规格目录号
Anti-HiBiT Monoclonal Antibody
100µgN7200
5 × 100µgN7210
储存条件：Anti-HiBiT Monoclonal Antibody是无菌过滤的溶液，溶于含50%甘油的PBS，产品中不含叠氮化钠。抗体
以干冰冷冻运输。接收后，解冻抗体，短暂离心片刻，从而收集管侧或管盖上溶液。抗体置于-30℃至-10℃（该条件下
呈液态）条件下储存。
3. 免疫印迹分析
3.A. 一般注意事项
鉴于Anti-HiBiT Monoclonal Antibody的高结合亲和力和低本底，因此可检测较低水平的HiBiT标记蛋白。使用标准
HRP偶联二抗和化学发光底物，可检测到哺乳动物细胞裂解物中浓度≤1pg（本底校正后）的HiBiT标记蛋白。尽管膜
或交叉反应带所致本底信号会升高，但灵敏度更高的化学发光底物可实现检测更低浓度的的HiBiT标记蛋白，因此可需
对抗体浓度进行优化。使用Anti-HiBiT Monoclonal Antibody进行免疫印迹分析时，一般应可检测到CRISPR修饰细胞
系中大多数内源性水平HiBiT标记蛋白。
Nano-Glo
®
HiBiT Blotting System（目录号：N2410）是一款用于HiBiT标记蛋白的替代性无抗体印迹分析产品，依赖
与试剂中LgBiT亚基互补，仅在膜上的HiBiT带上特异性产生NanoBiT复合物。HiBiT印迹分析方法产生的发光信号可
能会比免疫印迹分析更暗淡，但由于HiBiT印迹分析方法的生物发光本底极低，因此有时该系统展现出的灵敏度可能比
免疫印迹分析更高（信背比更高），尤其是它可以进行长时间曝光来整合信号。
用户需提供的材料
• gel transfer system (例如iBlot™ 2 Gel Transfer System, Thermo Fisher Scientific, 目录号：IB21001)
• PVDF 或 nitrocellulose membrane (例如iBlot™ 2 Transfer Stacks, PVDF, Thermo Fisher Scientific 目录号：
IB24001或iBlot™ 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, Thermo Fisher Scientific, 目录号：IB23001)
• Tris-buffered saline solution (25mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 7.5)
• Tween
®
20, Molecular Biology Grade (例如目录号：H5152)
• nonfat dry milk（NFDM） (例如Research Products International, 目录号：M17200-50)
• HRP-conjugated anti-mouse secondary antibody (Anti-Mouse IgG (H+L), HRP Conjugate, 目录号：W4021)
• ECL Western Blotting Substrate (目录号：W1001)
• 化学发光成像仪
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3.B. 示例操作流程
1. SDS-PAGE，使用iBlot™ 2 Gel Transfer System等将蛋白转移至PVDF或硝化纤维膜上。
说明：若有需要，置滤纸上干燥PVDF膜（例如过夜）。操作前，先将PVDF膜置甲醇中润湿数秒。
2. 于TBST缓冲液[Tris缓冲盐水+0.1%（v/v）Tween
®
20]中冲洗膜。
3. 在室温条件下，于平台摇摆振荡器上将膜置于封闭缓冲液[TBST+5%（w/v）脱脂奶粉（NFDM）]中封闭1小时。
说明：已针对NFDM封闭进行优化。使用其他封闭试剂（例如牛血清白蛋白或SuperBlock™ Blocking Buffer）可
能导致较高水平的膜本底或交叉反应条带。
4. 使用封闭缓冲液将Anti-HiBiT Monoclonal Antibody稀释至1µg/ml。使用一抗溶液替换膜上的封闭缓冲液，并于4℃
条件下振荡孵育过夜。
说明：
a. 有时，将浓度降至0.2µg/ml可降低交叉反应条带强度。优化抗体浓度可提高信背比。使用灵敏度更高底物（例
如SuperSignal™ West Femto，Thermo Fisher Scientific，目录号：34095）时，根据生产商建议将抗体稀释
至0.04–0.2µg/ml。
b. 也可将一抗与膜置于室温条件下孵育2小时。与4℃ 过夜孵育相比，较高温度条件下孵育较短时间可能导致
HiBiT信号强度降低，但也可能导致非预期本底信号降低。
5. 使用TBST洗涤5次，共计约15分钟。
6. 使用封闭缓冲液稀释HRP偶联抗小鼠二抗（例如，Anti-Mouse IgG (H+L), HRP Conjugate，目录号：W4021）
2500至5000倍或根据生产商建议进行稀释。于室温下振荡孵育膜1小时。
说明：极少量HiBiT标记蛋白检测灵敏度可能受标记二抗本底限制。若有可能，将二抗稀释至当无一抗存在时不产
生显著信号的浓度。若使用灵敏度更高底物，则应根据生产商建议将二抗稀释至较低浓度（例如，0.01µg/ml）。
7. 使用TBST洗涤6次，共计约30分钟。
8. 加入ECL Western Blotting Substrate，使之刚好覆盖膜并孵育1分钟。
说明：对于极低水平蛋白，可使用灵敏度更高底物（例如，SuperSignal™ West Femto Maximum Sensitivity
Substrate，Thermo Fisher Scientific，目录号：34095）并降低一抗和二抗浓度。
9. 从底物溶液中取出膜，并用吸水纸巾吸干多余液体，然后置于两块透明塑料片间。
10. 使用化学发光成像仪或胶片对膜进行成像（曝光时间适宜）。
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3.C. 示例数据
图1为哺乳动物细胞裂解物中低浓度HiBiT标记蛋白的灵敏检测（与其他蛋白的交叉反应性极小）。
A.B.
gg
p
gg
p
gg
5
pp
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pp
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250
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A
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1
4
4
8
1
图1. 与Nano-Glo
®
HiBiT Blotting System相比，Anti-HiBiT Monoclonal Antibody免疫印迹分析灵敏度和特异
性。使用K562哺乳动物细胞裂解物（Mass Spec Compatible Human Protein Extract, Intact；目录号：V6941）对
HaloTag
®
-HiBiT蛋白（4；HiBiT Control Protein，目录号：N3010）进行系列稀释，从而制备样品（含0.125–4pg标记
蛋白；稀释到10µg裂解物蛋白）。SDS-PAGE分析后，将凝胶转移至PVDF或硝化纤维素膜上，并使用iBlot™ 2 Gel
Transfer Device（Thermo Fisher Scientific，目录号：IB21001）、1µg/ml一抗、0.2µg/ml HRP偶联二抗（Anti-Mouse
IgG (H+L), HRP Conjugate，目录号：W4021）和ECL Western Blotting Substrate（目录号：W1015）进行免疫印迹分析。
图A. PVDF上Anti-HiBiT Monoclonal Antibody免疫印迹分析，曝光60分钟，曝光量范围（scale）1200–15000。图B.为
进行比较，将重复的凝胶转移到硝化纤维素膜上，以进行Nano-Glo
®
HiBiT印迹测定（目录号：N2410），依赖于酶互
补作用，从膜上HiBiT标记蛋白质产生特定的生物发光信号。硝酸纤维素上HiBiT印迹曝光60分钟，曝光量范围（scale）
1500–5000。缩放2个16位图像的低于膜本底至高于2pg条带强度这一部分。
与免疫印迹分析相比，Nano-Glo
®
HiBiT经常较暗，但哺乳动物裂解物中几乎无非特异性条带。使用Anti-HiBiT
Monoclonal Antibody进行免疫印迹分析可实现哺乳动物裂解物中皮克水平以下HiBiT标记蛋白的可视化。即便曝光1小
时，交叉反应条带信号和膜本底信号仍较低，因此可实现少量标记蛋白的灵敏检测。
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3.C. 示例数据（续）
图2为表达内源性水平HiBiT标记蛋白的CRISPR修饰细胞裂解物的免疫印迹分析。
levels.
kDa
250
148
98
64
50
36
1
8
4
4
2
T
A
16
图2. CRISPR修饰细胞裂解物的免疫印迹分析。使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对HeLa细胞进行编辑，从而将
HiBiT标签加入至HSP90B1、EGFR、HDAC2和CFL1的C末端。HSP90B1 HiBiT细胞代表主要含HiBiT阴性细胞的
CRISPR修饰混合细胞池，而其他三份样品代表分离后HiBiT阳性克隆物。使用4–20% SDS-PAGE梯度凝胶对10µg
细胞裂解物进行分析，使用iBlot™ 2 Gel Transfer Device （Thermo Fisher Scientific，目录号：IB21001）将其转移至
PVDF膜上，并根据第3.B节所述内容进行免疫印迹分析（曝光5分钟）。泳道1亲本HeLa细胞。泳道2 HSP90B1
HiBiT池（93kDa）。泳道3 EGFR-HiBiT克隆物（135kDa）泳道4 HDAC2-HiBiT克隆物（56kDa）泳道5 CFL1-
HiBiT克隆物（19kDa）。
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4. 免疫荧光分析
4.A. 一般注意事项
可通过荧光免疫显微技术以及Anti-HiBiT Monoclonal Antibody实现HiBiT标记蛋白的定位。虽然抗体的亲和力和特异
性可促进大量内源性表达HiBiT标记蛋白的灵敏检测，但荧光显微技术的灵敏度可能比微孔板形式的生物发光检测系统
（例如Nano-Glo
®
HiBiT Lytic Detection System（目录号：N3030））低约2个数量级。因此，其中发光信号比不表达
HiBiT的亲本细胞系的发光信号低几百倍的细胞系在显微镜下可能具有接近背景的荧光信号，特别是对于具有扩散定位的
蛋白质。表达 LgBiT 的细胞可能显示 HiBiT 染色大幅降低，这是因为抗体和LgBiT亚基之间存在HiBiT结合竞争（参见
第8节）。
用户需提供的材料
• 成像板 (例如Cellvis, 目录号：P96-1.5H-N)
• 多聚甲醛 (例如Electron Microscopy Sciences, 目录号：15710)
• 磷酸盐缓冲盐水 (例如DPBS, GIBCO™ 目录号：14190)
• Tween
®
20, Molecular Biology Grade (例如目录号：H5152)
• Triton
®
X-100 (例如目录号：H5141)
• 正常山羊血清 (例如Abcam, 目录号：ab7481)
• 荧光标记的抗小鼠二抗 (例如Thermo Fisher Scientific, 目录号：A-21235)
• 荧光显微镜 (例如Keyence BZ-X800)
• 可选：Hoechst stain (例如Hoechst 33342 Solution, Thermo Fisher Scientific, 目录号：62249)
4.B. 示例操作流程
1. 使用玻璃底成像板培养贴壁细胞。
说明：下述一种或多种对照可能有助于确定HiBiT信号或优化染色条件：
• 不表达HiBiT的亲本细胞（用一抗和二抗染色），代表所有来源荧光信号本底，且是确定表达HiBiT的细胞系中
HiBiT标记蛋白对应信号的最佳对照。
• 单独用二抗染色的亲本或表达HiBiT的细胞，代表标记二抗荧光信号本底。若本底与上述对照接近，则所用
Anti-HiBiT Monoclonal Antibody浓度不会导致本底升高。降低二抗浓度可降低本底并实现灵敏检测。
• 未染色亲本或表达HiBiT的细胞，代表自发荧光信号本底（某些通道中较为显著）。与上述对照比较，可确定
标记二抗对应荧光本底。
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4.B. 示例操作流程（续）
2. 取出培养基，用PBS洗涤1次，并于室温条件下用4%多聚甲醛PBS溶液固定10分钟。
说明：也可用Anti-HiBiT Monoclonal Antibody对甲醇等有机溶剂固定细胞进行染色。
3. 用PBS洗涤3次，每次5分钟。
4. 于室温条件下使用PBS+0.2%（v/v）Triton
®
X-100对细胞进行透化处理。
5. 用PBS洗涤3次，每次5分钟。
6. 于室温条件下，使用含5%（v/v）正常山羊血清（NGS）的PBST（PBS+0.05% Tween
®
20）封闭1小时。
说明：我们建议使用二抗获取物种血清进行封闭。
7. 取出封闭试剂，加入1µg/ml Anti-HiBiT Monoclonal Antibody（用封闭缓冲液（PBST+5% NGS）稀释）。于室温
条件下孵育2小时。
说明：也可于4℃条件下过夜孵育抗体，但此操作可能导致非特异性本底信号升高。
8. 用PBST洗涤3次， 5分钟。
9. 用1:1000稀释度抗小鼠Alexa Fluor
®
647偶联山羊二抗（最终浓度为2µg/ml）或您所选二抗（用封闭缓冲液稀释）
进行孵育。于室温，黑暗条件下孵育1小时。
说明：当与表达低水平HiBiT标记蛋白的细胞结合使用时，信号可能接近荧光本底信号（细胞自发荧光信号和二抗
本底信号）。使用远红外通道可显著降低自发荧光本底信号。
10. 用PBST洗涤3次，每次洗涤5分钟，样品应避光。
11. 对于核染色，加入PBS稀释Hoechst染剂（例如，1-5µg/ml），孵育10分钟，然后用PBS洗涤3次。
12. 使用荧光显微镜以及滤光片进行成像。
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4.C. 示例数据
图3 CRISPR修饰HeLa细胞中内源性表达水平HiBiT标记蛋白的成像示例。
A.B.
C.D.
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G.H.
A
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3
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1
图3. CRISPR修饰HeLa克隆或混合细胞池内源性表达水平HiBiT标记蛋白的免疫荧光成像。在HeLa细胞中，使用
CRISPR/Cas9基因组编辑技术将HiBiT标签加入至以下蛋白的C末端：VCL（图A和B；粘着斑、膜、细胞骨架）；
HDAC2（图C和D；细胞核）；SMARCA4（图E和F；细胞核纤维中心）；和HSP90B1（图G和H；内质网，用结
构化照明实现可视化）。对于HDAC2和SMARCA4，已分离HiBiT阳性克隆。对固定细胞进行免疫染色（如第4.B节所述），
VCL和HSP90B1池中的HiBiT阴性细胞显示低背景荧光。用Anti-HiBiT Monoclonal Antibody和Alexa Fluor
®
647标记
抗小鼠二抗（Thermo Fisher Scientific，目录号：A21235）对固定细胞进行染色，并于Keyence BZ-X800荧光显微镜
上成像。Hoechst细胞核染色（蓝色）叠加图见图B、D、F和H。
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5. 免疫沉淀
5.A. 一般注意事项
Anti-HiBiT Monoclonal Antibody可用于免疫沉淀，从细胞裂解物或其他样品中捕获、浓缩和纯化HiBiT标记蛋白。使用
G蛋白树脂进行抗体固定时，便于样品结合、洗涤和洗脱。可用低pH缓冲液洗脱蛋白或用SDS上样缓冲液并加热洗脱蛋白，
但应注意此操作可能导致抗体洗脱且可能使HiBiT融合蛋白变性。洗脱后抗体可能干扰部分下游应用场景，例如用抗小
鼠二抗对样品进行免疫印迹分析。Nano-Glo
®
HiBiT Blotting System（目录号：N2410）这一无抗体方法是可视化洗脱
液中HiBiT标记蛋白的适宜方法。
若需更为温和洗脱条件，则可使用与合成的HiBiT或DrkBiT肽的竞争。DrkBiT 肽为HiBiT变体，可与LgBiT亚基结合
形成非发光复合物。虽然DrkBiT的抗体亲和力小于HiBiT Peptide，但所用浓度远高于KD，因此可有效阻断HiBiT标记
蛋白（解离自固定化抗体）再结合。使用HiBiT或DrkBiT 肽进行洗脱可能干扰下游HiBiT发光信号检测，除非首先对肽
进行分离（例如采用SDS-PAGE法分离）。由于HiBiT/mAb复合物的解离速率较慢（参见第8节），因此用肽洗脱可
能需相对较长孵育时间（例如过夜）。
用户需提供的材料
• magnetic protein G resin (例如Cytiva Protein G Mag Sepharose, 目录号：28944008)
• Tris缓冲盐水 (25mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 7.5)
• Tween
®
20 (目录号：H5152)
• 哺乳动物裂解缓冲液 (目录号：G9381)
• RQ1 RNase-Free DNase (目录号：M6101)
• Protease Inhibitor Cocktail (目录号：G6521)
• 磁力架 (例如MagneSphere
®
Technology Magnetic Separation Stand, 目录号：Z5342)
• 可选：SDS上样缓冲液
• 可选：低pH缓冲液 (100mM glycine-HCl, pH 2.5)
• 可选：中和缓冲液 (2M Tris-HCl, pH 7.5)
• 可选：合成的HiBiT或DrkBiT肽（网址：/c/global/forms/contact-tailored-rd- solutions-
form/）
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5.B. 示例操作流程
1. 用TBST（Tris缓冲盐水+0.1%吐温20）洗涤G蛋白树脂，并重悬成20%混悬液。
2. 将20µl 20%树脂分装至每管中。
3. 取2µg Anti-HiBiT Monoclonal Antibody，加至每管中，并于室温条件下结合10-20分钟。用磁力架沉淀磁珠，并取
出上清液。从磁力架上取下磁珠，并用移液器吸取1ml TBST清洗磁珠。将试管放回磁力架，取出洗涤液。
说明：抗体可大量结合至树脂，然后将混悬液分装至多个试管中。您也可将抗体加至含HiBiT标记蛋白的样品中，
然后加入G蛋白树脂。
4. 制备含HiBiT的样品，例如，使用哺乳动物裂解缓冲液（添加了RQ1 RNase-Free DNase和Protease Inhibitor
Cocktail）制备细胞裂解物。于4℃，16000×g条件下离心裂解物10分钟，并将上清液转移至新试管中，从而净化裂解物。
5. 取样品（例如200µl净化后细胞裂解物）加至每管中。
6. 于4℃条件下过夜孵育，并上下颠倒旋转。
说明：根据具体应用情况场景，可于室温条件下孵育2小时或根据具体实验条件进行优化。
7. 使用磁力架沉淀磁珠。
8. 取出上清；若有需要，可将上清液转移至新试管中，以供后续分析。
9. 用1ml TBST洗涤磁珠3次。
10. 取出洗涤缓冲液并加入洗脱缓冲液，例如下述操作之一：
• 加入50µl SDS上样缓冲液，并于70℃下条件下加热10分钟。
• 加入50µl 100mM甘氨-HCl（pH 2.5），并于室温条件下孵育5-10分钟（搅拌或端对端旋转）。用20%体积
的2M Tris-HCl（pH 7.5）中和洗脱液。
• 在TBST中加入50µl 10µM 合成的HiBiT或DrkBiT 肽段，并于4℃条件下孵育过夜，并上下颠倒旋转。
说明：若使用HiBiT或DrkBiT，也可于室温条件下孵育和/或孵育更短时间。洗脱程度取决于HiBiT与固定抗体的
解离速率，不同融合蛋白的解离速率可能不同。
11. 将样品上样至凝胶上，并通过SDS-PAGE法进行分析。
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5.C. 示例数据
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图4. 瞬时转染HEK293细胞中HiBiT标记萤火虫萤光素酶（Fluc-HiBiT）的免疫沉淀。起始样品为1ml裂解物（含
2×10
6
个细胞/ml），由含Protease Inhibitor Cocktail（目录号：G6521）和RQ1 RNase-Free DNase（目录号：
M6101）的Mammalian Lysis Buffer（目录号：G9381）制成。将Protein G Mag Sepharose（Cytivia，目录号：
28944008）与Anti-HiBiT Monoclonal Antibody、无抗体或阴性对照抗体（抗Myc mAb，克隆编号9E10）一起孵育。
将净化后裂解物样品与Protein G珠子置于4℃条件下过夜孵育。通过与SDS上样缓冲液一起加热，从而洗脱样品，但
含有Anti-HiBiT Monoclonal Antibody的平行重复管也用甘氨酸（pH 2.5）洗脱，置4℃条件下过夜孵育DrkBiT Peptide
或置室温条件下过夜孵育DrkBiT Peptide。图A显示了使用Nano-Glo
®
HiBiT Blotting System （目录号：N2410）对
样品进行分析，以避免洗脱抗体的干扰。将左侧面板缩放到较低的强度，以说明Fluc-HiBiT被Anti-HiBiT Monoclonal
Antibody有效清除，而不是阴性对照。右侧面板按比例缩放到更高的强度，以显示具有Anti-HiBiT Monoclonal Antibody
的洗脱液中Fluc-HiBiT的浓度增加，而不是阴性对照。在图B中，Fluc-HiBiT的萤火虫萤光素酶活性使用ONE
Glo™Assay（录号：E6110）检测，强调Fluc-HiBiT从上清液中的清除率>90%，以及通过用竞争肽洗脱来维持融合伴
侣的酶活性的能力。
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图5. 从CRISPR修饰的HeLa细胞中免疫沉淀HiBiT标记的蛋白质。使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对HeLa细
胞进行编辑，从而将HiBiT标签添加至CFL1、HDAC2、CTNNB1、HDAC6和EGFR的C末端。第5.B节中的标准方
案用于免疫沉淀蛋白质，并分析样品以监测上清液中的蛋白质清除率和洗脱液中的蛋白质回收率。经过净化的细胞裂解
物（0.15ml；5×10
6
个细胞/ml）作为起始样品，通过在4℃下结合过夜并在50µl SDS负载缓冲液中洗脱进行免疫沉淀。
使用Nano-Glo
®
HiBiT Blotting System（目录号：N2410）分析每个原始裂解物样品、上清液和洗脱液的当量体积。在凝
胶加载之前，将来自每个细胞系的三个样品进一步稀释到SDS加载缓冲液中，以使膜上的HiBiT水平更加相似：CFL1（4
倍稀释）、HDAC2（4倍稀度）、CTNNB1（4倍稀释）、HDAC6（无稀释）、EGFR（20倍稀释）。左图和右图分别
代表曝光4分钟和20分钟结果。
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5.C. 示例数据（续）
图6展示了从大肠杆菌裂解物中纯化HiBiT标记的麦芽糖结合蛋白（MBP-HiBiT-His6）的结果。
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250
150
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75
Heavy chain
Maltose-binding protein
Light chain
50
37
25
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