2024年8月29日发(作者：抗绮玉)
中国兽医科学
2008,38
(
01
)
:20
2
24
ChineseVeterinaryScience
中图分类号
:S852.723
文献标识码
:A
文章编号
:1673
2
4696
(
2008
)
01
2
0020
2
05
α
基因柔嫩艾美球虫免疫与鸡盲肠扁桃体
TNF
2
表达动态的关系
王彩霞
,
徐 赓
,
王黎霞
,
安 健
3
(
北京农学院动物科学技术系
,
北京
102206
)
α
的基因序列设计引物
,
应用逆转录2聚合酶链式反应
(
RT
2 摘要
:
根据
GenBank
上鸡
β
2
actin
、
TNF
2
α
基因
,
采用
βα
mRNA
在鸡柔
PCR
)
技术克隆获得了
β
2
actin
和
TNF
22
actin
为内参的半定量方法检测
TNF
2
α
基因的表达动态与柔嫩艾美球虫免疫的关系。结嫩艾美球虫免疫前后不同时间的表达情况
,
以探讨
TNF
2
α
基因在两次免疫期间的表达量整体上呈现双峰模式
,
首免后第
9d
达到一个高峰
,
二免后第
7
果显示
,TNF
2
α
在抗球虫感染中有一定的作用。
d
达到另一个高峰。结果表明
,TNF
2
α
基因关键词
:
β
2
actin
基因
;
柔嫩艾美球虫
;
盲肠扁桃体
;RT
2
PCR;TNF
2
Relationshipbetween
Eimeriatenella
immunityandkinetic
α
geneinchickencecaltonsilexpressionofTNF
2
WANGCai
2
xia,XUGeng,WANGLi
2
xia,ANJian
(
DepartmentofAnimalScienceandTechnology,BeijingCollegeofAgriculture,Beijing
102206,
China
)
α
genesequencesinGenBank,primerswerede
2
Abstract:Accordingtochicken
β
2
actinandTNF
2
signed,andthegenesequenceswereamplifiedbyreversetranscriptase
2
polymerasechainreaction
(
RT
2
PCR
)
fromthececaltonsilofchickenexperimentallyimmunizedwith
Eimeriatenella
.Theexpressionle
2
α
mRNAatdifferenttimeafterimmunizationwasdetectedbysemi
2
quantitativeRT
2
PCRwithvelofTNF
2
β
2
actingeneasinternalreferencetostudytherelationshipbetween
a
immunizationandthekinetic
α
ultsshowedthatthelevelofexpressionofTNF
2
expressionofTNF
2
α
genereached1stpeakonday9post
2
1st
2
immunization,andreached2ndpeakonday7post
2
booster
2
α
hadsomeeffectagainst
a
oncludedthatTNF
2
α
geneKeywords:
β
2
actingene;
Eimeriatenella
;cecaltonsil;RT
2
PCR;tumornecrosisfactor
2
鸡球虫病是由艾美属球虫寄生于鸡小肠和盲肠
上皮细胞引起的一类原虫病
,
对养鸡业的危害相当
严重。目前
,
应用抗球虫药进行预防仍是主要的防
治手段
,
但随着人们对药物残留问题的关注
,
学者们
开始转向球虫免疫的研究
,
使球虫病的免疫学研究
成为当前的研究热点
,
核酸疫苗的研究便是其中之
一
,
而利用细胞因子作为免疫佐剂可以有效增强核
酸疫苗的免疫效果
[1]
。球虫感染时
,
鸡主要有
5
种
γ
、细胞因子起作用
,
包括
IFN
2
IL
2
2
、
IL
2
5
、
TGF
和肿
瘤坏死因子
(
tumornecrosisfactor,TNF
)
[2]
。其中
的肿瘤坏死因子是近年来研究较深入、应用较广泛
α
(
TNF
2
α
)
的一种新型细胞因子
[3]
。肿瘤坏死因子2
由自然杀伤细胞
(
NK
细胞
)
和巨噬细胞分泌
,
对球
虫感染可产生保护作用
,
很多传染性或炎性刺激物
α
能促进
T
细胞能够刺激
TNF
的生物合成。
TNF
2
和
B
细胞的增生
,
提高
NK
细胞活性
,
促进吞噬细
α
作为炎症介质参与炎症反应胞的吞噬功能
;TNF
2
过程
;
影响机体的物质代谢引起恶病质
;
介导细胞凋
α
可以调节
MHC
Ⅰ和
MHC
Ⅱ亡等
[4]
。
TNF
2对抗
原呈递细胞的表达
,
是多种细胞介导免疫的最初调
收稿日期
:2007
2
08
2
13;
修回日期
:2007
2
11
2
08
基金项目
:
北京市教委资助项目
(
KM2
)
;
北京市属市管高校人才强教计划项目
(
PXM2007
2
014207
2
044539
)
作者简介
:
王彩霞
(
1982
)
,
女
,
山东潍坊人
,
硕士生
,E
2
mail:caixia
2
1688@
。3通讯作者
,
副教授
,
从事动物寄生
虫学与分子生物学研究
,E
2
mail:anyh001@
第
1
期
α
基因表达动态的关系 王彩霞等
:
柔嫩艾美球虫免疫与鸡盲肠扁桃体
TNF
2
21
节因子
,
包括
T
细胞分化、
NK
细胞和巨噬细胞作用
α
的抗球虫作用以及免疫作等
[5]
。鉴于以上
TNF
2
用
,
本试验设计从盲肠扁桃体克隆获得鸡的
TNF
2
α
,
对其表达水平进行研究
,
以探讨柔嫩艾美球虫
(
a
)
免疫与
TNF
2
α
表达动态的关系。
PCR
扩增条件为
:
首先
95
℃预变性
3min;
然后
94
℃
30s,61.9
℃
30s,72
℃
30s,
共
30
个循环
,
最后
α
基因的
72
℃延伸
5min,4
℃结束反应。
TNF
2
PCR
扩增条件为
:
首先
95
℃预变性
3min;
然后
94
1
材料与方法
1.1
实验动物
℃
30s,55.6
℃
30s,72
℃
30s,
共
30
个循环
,
最后
72
℃延伸
5min,4
℃结束反应。
α
基因的克隆鉴定与测序
1.6
鸡
β
2
actin
与
TNF
2
按
DNA
回收试剂盒说明书操作
,
用
15g/L
的
琼脂糖凝胶对
RT
2
PCR
产物进行电泳纯化
,
将回收
产物与
pGEM
2
T
载体于
4
℃连接过夜
,
转化大肠杆
菌
JM109
感受态细胞。随机挑取
LB
平板上生长良
好的白色单菌落
,
分别接种到含氨苄青霉素的
LB
液体培养基上
,37
℃摇床培养过夜。取菌液作为模
板进行
PCR
鉴定。将
PCR
鉴定的阳性菌液吸取
1
mL
进行测序
,
剩余的菌液保存于
-80
℃冰箱中。
测序结果用
DNAMAN
与预期片段进行比对
,
并将
α
基因与几种哺乳动物的
TNF
2
α
基扩增到的
TNF
2
因序列进行了同源性分析比对。
α
基因在鸡球虫病免疫期间表达水平的
1.7
TNF
2
半定量
RT
2
PCR
检测
1.7.1
材料的获得 无菌饲养
1
日龄雏鸡
,
随机分
成试验组和对照组
,
试验组共
48
只鸡
,
分别在
12
和
22
日龄时用活卵囊进行
2
次免疫
,
免疫剂量为每只
鸡
500
个卵囊
,
对照组鸡给以等量生理盐水。对照
组共
90
只鸡
,
分别在
1
、
5
、
7
、
11
、
13
、
15
、
17
、
19
、
21
、
23
、
25
、
27
、
29
、
38
、
39
日龄时每次取
6
只鸡的盲肠扁
桃体。试验组于
13
、
19
、
21
、
25
、
27
、
29
、
31
、
39
日龄时
每次取
6
只鸡的盲肠扁桃体
,
取材后保存于液氮中。
1.7.2
半定量
RT
2
PCR
分离纯化每组不同时间
1
日龄海兰灰蛋鸡
,
购自北京昌平种鸡场
,
未落
地前饲养于汽油喷灯火焰消毒的无球虫笼舍中
,
饲
喂无抗球虫药的饲料和饮水。
1.2
质粒和菌种
pGEM
2
T
克隆载体为
Promega
公司产品
,
宿主
菌
JM109
为北京全式金生物技术有限公司产品。
1.3
酶和试剂
M
2
MLV
反转录酶、
Taq
DNA
聚合酶、
dNTP
、
Oligo
(
dT
)
15
为
Promega
公司产品
,Trizol
为
In
2
vitrogen
公司产品
,RNA
酶抑制剂为大连宝生物工
程有限公司产品
,UNIQ-10
柱式
DNA
胶回收试
剂盒为上海生工生物工程技术服务有限公司产品。
其他试剂均为分析纯。
1.4
引物的设计
根据
GenBank
上鸡
β
2
actin
(
登录号为
L08165
)
、
α
(
登录号为
AY765397
)
的基因序列设计引
TNF
2
物
:
β
2
actin
上游
:5
′2
CCACAGCTGCCTCTAGC
2
TCT
2
3
′
,
下游
:5
′2
ACATCTGCTGGAAGGTGGA
2
α
上游
:5
′
C
2
3
′
,
预期扩增片段大小为
384bp,TNF
22
AGATGGGAAGGGAATGAACC
2
3
′
,
下游
:5
′2
T
2
CAGAGCATCAACGCAAAAG
2
3
′
,
预期扩增片段
大小为
269bp,
由上海生工生物工程技术服务有限
公司合成。
1.5
总
RNA
的提取及序列扩增
1.5.1
总
RNA
的提取 无菌采取鸡盲肠扁桃体
,
按
Trizol
说明书分离纯化总
RNA
。用德国
Eppen
2
dorf
公司生产的核酸蛋白浓度测定仪检测其浓度
,
用甲醛变性凝胶电泳检测其完整性。
1.5.2
RT
2
PCR
反应
RT
反应体系为
25
μ
L:
总
RNA
模板
2
μ
g,Oligo
(
dT
)
15
1
μ
L,
加灭菌超纯水构
成
9
μ
L
反应体系
,
置于
70
℃反应
5min,
立即冰浴
,
然后加
dNTPs1.25
μ
L,RNA
酶抑制剂
0.5
μ
L,M
2
MLV5
×缓冲液
5
μ
L,M
2
MLV
反转录酶
1
μ
L,
最
后用灭菌超纯水补至
25
μ
L,
置于
37
℃反应
1.5h
。
PCR
反应体系为
50
μ
L:cDNA1
μ
L,5
×缓冲
液
10
μ
L,
上、下游引物各
1
μ
L,
Taq
DNA
聚合酶
β
0
1
25
μ
L,
加灭菌超纯水至
50
μ
L
。2
actin
基因的
采集的盲肠扁桃体的总
RNA,
随机选取一总
RNA
α
作为模板
,
以不同循环数分别扩增
β
2
actin
与
TNF
2
基因
,
电泳检测确定各自扩增的最佳循环数
,
然后以
α
最佳循环数扩增获得不同时间的
β
2
actin
与
TNF
2
基因。扩增产物电泳后于凝胶成像系统
(
美国
Al
2
α
pha
公司
)
进行定量分析
,
以
TNF
2
/
β
2
actin
的净灰
α
基因的相对表达量。度比表示免疫不同时间
TNF
2
本试验重复
4
次
,
统计数据并绘制图表。
2
结果与分析
2.1
目的基因的
RT
2
PCR
对盲肠扁桃体所提取的
RNA
进行浓度测定及
完整性鉴定后
,
以质量合格的
RNA
为模板进行
RT
2
PCR
扩增
,
电泳结果显示
,
得到了与预期结果大
小相符的约
384bp
的
β
2
actin
基因和
269bp
的
α
基因特异性片段
(
见图
1
)
。
TNF
2
22
中国兽医科学第
38
卷
βα
基因不同时间的低循环数为
23
。2
actin
与
TNF
2
PCR
产物凝胶电泳结果见图
4
。
α
基因的电泳结果图
1
PCR
扩增的
β
2
actin
和
TNF
2
α
genesamplifiedFig.1
Electrophoresisof
β
2
actinandTNF
2
byPCR
α
基因
;2:
β
M:DNA
分子质量标准
;1:TNF
22
actin
基因
α
gene;2:
β
M:DL2000DNAMarker;1:TNF
22
actingene
2.2
目的基因的克隆与鉴定
βα
基因的
PCR
扩增产物经纯化 2
actin
和
TNF
2
后连接到
pGEM
2
T
载体上
,
转化大肠杆菌
JM109,
摇床培养后经
PCR
鉴定表明获得了相应大小的目
的片段。
α
基因核苷酸序列的测定
2.3
鸡
β
2
actin
与
TNF
2
β
对所构建的
pGEM
2
T
2
ch
2
actin
和
pGEM
2
T
2
ch
α
质粒进行测序
,
比对结果显示
β
TNF
22
actin
基因与
目的序列
(
GenBank
登录号
:L08165
)
的一致性达
α
基因与目的序列
(
GenBank
登录号
:99
1
2%,TNF
2
AY765397
)
的一致性达
99.6%
。同源性比较也显
图
3
不同循环数
PCR
产物的电泳分析结果
Fig.3
ElectropherogramanalysisresultsofPCRproductsfor
differentcycles
α
基因与其他几种哺乳动物的同示
β
2
actin
和
TNF
2
源性比较低
,
说明是预期要扩增的目的基因。
α
在鸡球虫病免疫期间的表达动态
2.4
TNF
2
βα
基因
PCR
扩增时最低循环数 2
actin
与
TNF
2
的确定结果见图
2
。根据图
2,
统计结果后得出其不
同循环数光密度值的曲线图
(
见图
3
)
。
α
与
β
图
4
不同日龄鸡盲肠扁桃体中
TNF
22
actin
基因
PCR
产物的电泳结果
α
andFig.4
ElectrophoresisofthePCRproductsforTNF
2
β
2
actinfromchickencecaltonsilondifferentday
2
old
M:DNA
分子质量标准
;
上方
1
～
15:
对照组
1
、
5
、
7
、
11
、
13
、
15
、
17
、
α
基因的表达
19
、
21
、
23
、
25
、
27
、
29
、
38
、
39
日龄鸡盲肠扁桃体
TNF
2
动态
;16
～
23:
免疫组
13
、
19
、
21
、
25
、
27
、
29
、
31
、
39
日龄鸡盲肠扁桃体
α
基因的表达动态
;
下方
1
～
15:
对照组
1
、
TNF
2
5
、
7
、
11
、
13
、
15
、
17
、
19
、
21
、
23
、
25
、
27
、
29
、
38
、
39
日龄鸡盲肠扁桃体
β
2
actin
基因的表达动
βα
基因不同循环数的电泳结果图
2
2
actin
和
TNF
2
α
genesindiffer
2
Fig.2
Electrophoresisfor
β
2
actinandTNF
2
entcycles
M:DNA
分子质量标准
;1
～
5
分别是
16
、
18
、
19
、
20
、
23
个循环
;6
～
10
分别是
30
、
26
、
23
、
21
、
19
个循环
M:DL2000DNAMarker;1-5:PCRproductsin16,18,19,20,23
cyclesrespectively;6-10:PCRproductsin30,26,23,21,19cycles
respectively
态
;16
～
23:
免疫组
13
、
19
、
21
、
25
、
27
、
29
、
31
、
39
日龄鸡盲肠扁桃体
β
2
actin
基因的表达动态
M:DL2000DNAMarker;Thesuperior1-15:Thekineticexpres
2
α
geneincecaltonsilfrom1,5,7,11,13,15,17,19,21,sionofTNF
2
23,25,27,29,38,39day
2
oldchickensofcontrolgrouprespectively;
α
geneincecaltonsilfrom16-23:ThekineticexpressionofTNF
2
13,19,21,25,27,29,31,39day
2
oldchickensofimmunitygroupre
2
spectively;Theinferior1-15:Thekineticexpressionof
β
2
actingene
incecaltonsilfrom1,5,7,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,38,39
day
2
oldchickensofcontrolgrouprespectively;16-23:Thekinetic
expressionof
β
2
actingeneincecaltonsilfrom13,19,21,25,27,29,
31,39day
2
oldchickensofimmunitygrouprespectively
根据图
3
结果确定了
PCR
扩增
β
2
actin
基因时
α
基因时的最的最低循环数为
19,PCR
扩增
TNF
2
第
1
期
α
基因表达动态的关系 王彩霞等
:
柔嫩艾美球虫免疫与鸡盲肠扁桃体
TNF
2
23
α
基因 经过
4
次重复
,
求取平均值
,
绘制
TNF
2
在鸡球虫病免疫前后不同时间的表达动态
(
见图
α
基因在两次免疫期间
5
)
。从图
5
可以看出
,TNF
2
的表达量整体上呈现双峰模式
,
首免后第
9d
和二
免后第
7d
分别是两次免疫的峰值
,
且首免峰值是
二免峰值的
2
倍左右。
虫。它还可以刺激内皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、
中性粒细胞、枯否氏细胞和肝细胞产生
NO
等
,
抑制
线粒体功能
,
使球虫能量的生成减少
,
最终导致虫体
发育障碍甚至死亡
[10]
。
α
基因在两次免疫期间 本试验结果显示
,TNF
2
的表达动态呈双峰模式
,
这与
Byrnes
等
[11]
在体外
检测到两次感染巨型艾美球虫
(
)
和柔嫩
α
呈双峰模式艾美球虫期间巨噬细胞产生的
TNF
2
相吻合。他们发现第一个峰值几乎是第二个峰值的
4
倍
,
均高于对照组
,
并提出第一个峰与疾病的致病
过程有关
,
第二个峰与保护性免疫的形成有关。本
试验中的不同是
,
首免峰值是二免峰值的
2
倍
,
只有
首免的峰值高于正常值
,
其余时间试验组的相对表
达量均低于对照组。笔者认为
,
这可能与海兰灰这
种鸡品种的免疫遗传因素有关。
Zhang
等
[12]
在研
究
SC
和
TK
鸡球虫病发病机理中类
TNF
活性的
作用时
,
发现用抗
TNF
的抗体处理
SC
鸡可增加因
柔嫩艾美球虫感染所致的增重降低
,
而
TK
鸡未出
α
在不同品种的鸡体内发挥现该现象
,
这说明
TNF
2
着不同的作用。
Choi
等
[13]
发现初次感染堆形艾美
γ
的表达量保持恒球虫的
SC
鸡盲肠扁桃体
IFN
2
定
,
而
TK
鸡却是减少的
,
二次感染后两者的表达量
α
也存在这种免疫遗传差则都增长了一样
,TNF
2
α
在柔嫩艾美异。在遗传因素的影响下
,
使得
TNF
2
α
在首球虫免疫初期的表达量低于正常值。
TNF
2
α
对球次免疫后第
9d
时达到高峰
,
笔者推测
,TNF
2
γ
被认为起着关键作虫感染具有保护作用
,IFN
2
γ
mRNA
在柔嫩艾美球虫感染后的
用
[9,12]
,
而
IFN
2
γ
可刺激巨
第
6d
和第
8d
时明显增多
[14]
,
且
IFN
2
α
。因此在
IFN
2
γ
的量达到最大
,
噬细胞产生
TNF
2
α
对巨噬细胞产生了最大刺激之后才引起了
TNF
2
α
基因表达量基因表达量峰值的出现
,
从而使
TNF
2
α
基因达到高峰的时间推迟了。二次免疫后
TNF
2
的表达量在第
7d
时达到高峰
,
随后开始下降
,
第
9
d
时降至最低值
,
二免后第
17d
时又回升至接近正
α
基因的表达量常值。整个二免期间试验组
TNF
2
均低于对照组
,
但期间仍有一个峰值
,
笔者推测可能
是由于免疫记忆对机体的保护性免疫形成的
,
可见
α
在抗球虫方面还是有一定作用的。
TNF
2
α
增强抵抗球虫的作 综上所述
,
在首免时
TNF
2
用比较明显
,
而在二次免疫时的作用不是很明显
,
而
且鸡的品种不同
,
其作用效果也不同。因此
,
要彻底
α
的抗球虫作用
,
将其作为一种疫苗佐剂弄清
TNF
2
来使用还有待于进行更深入的研究
,
尤其是鸡的免
疫遗传因素与进化史对其发挥作用的影响的研究。
α
基因在鸡球虫病免疫前后不同时间的表达图
5
TNF
2
α
geneduringtheimmunityFig.5
KineticexpressionofTNF
2
againstcoccidiosis
3
讨论
肿瘤坏死因子是一种存在于动物体内
,
能杀伤
某些肿瘤细胞并使肿瘤组织发生出血性坏死的小分
子蛋白质
,
它在机体免疫过程中起着很重要的作用。
目前
,
有关肿瘤坏死因子的研究主要是人类和哺乳
动物较多
,
而在禽类方面的研究主要是有关
TNF
的活性及理化性质的研究
[6]
,
克隆及功能方面的研
究较少。柔嫩艾美球虫主要侵害鸡的盲肠
,
而盲肠
扁桃体是盲肠主要的免疫器官
,
并且分泌大量细胞
因子参与免疫反应。因此
,
本试验选择从盲肠扁桃
α
基因并进行序列分析
,
与体取材
,
克隆鸡的
TNF
2
α
基因序列也进行了比对
,
比对结其他物种的
TNF
2
果显示与预期片段大小相符
,
与其他几种哺乳动物
α
基因的同源性较低
,
表明本试验成功克隆了
TNF
2
α
。海兰灰鸡的
TNF
2
目前
,
已知柔嫩艾美球虫子孢子、裂殖子可刺激
鸡巨噬细胞、
NK
细胞和外周血液中巨噬细胞产生
α
,
适量的
TNF
2
α
有利于机体清除虫体。此
TNF
2
γ
也可以激活巨噬细胞
,
促进
TNF
2
α
的分外
,IFN
2
α
在鸡球虫免疫过程中有一定的抗泌。因此
,TNF
2
α
抗球虫的主要作用机制是增球虫作用
[7
2
9]
。
TNF
2
强吞噬细胞的吞噬功能
;
活化巨噬细胞
,
通过呼吸激
发产生活性氧自由基
,
再经脂质过氧化反应杀伤球
24
中国兽医科学第
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中国兽医科学
2008,38
(
01
)
:20
2
24
ChineseVeterinaryScience
中图分类号
:S852.723
文献标识码
:A
文章编号
:1673
2
4696
(
2008
)
01
2
0020
2
05
α
基因柔嫩艾美球虫免疫与鸡盲肠扁桃体
TNF
2
表达动态的关系
王彩霞
,
徐 赓
,
王黎霞
,
安 健
3
(
北京农学院动物科学技术系
,
北京
102206
)
α
的基因序列设计引物
,
应用逆转录2聚合酶链式反应
(
RT
2 摘要
:
根据
GenBank
上鸡
β
2
actin
、
TNF
2
α
基因
,
采用
βα
mRNA
在鸡柔
PCR
)
技术克隆获得了
β
2
actin
和
TNF
22
actin
为内参的半定量方法检测
TNF
2
α
基因的表达动态与柔嫩艾美球虫免疫的关系。结嫩艾美球虫免疫前后不同时间的表达情况
,
以探讨
TNF
2
α
基因在两次免疫期间的表达量整体上呈现双峰模式
,
首免后第
9d
达到一个高峰
,
二免后第
7
果显示
,TNF
2
α
在抗球虫感染中有一定的作用。
d
达到另一个高峰。结果表明
,TNF
2
α
基因关键词
:
β
2
actin
基因
;
柔嫩艾美球虫
;
盲肠扁桃体
;RT
2
PCR;TNF
2
Relationshipbetween
Eimeriatenella
immunityandkinetic
α
geneinchickencecaltonsilexpressionofTNF
2
WANGCai
2
xia,XUGeng,WANGLi
2
xia,ANJian
(
DepartmentofAnimalScienceandTechnology,BeijingCollegeofAgriculture,Beijing
102206,
China
)
α
genesequencesinGenBank,primerswerede
2
Abstract:Accordingtochicken
β
2
actinandTNF
2
signed,andthegenesequenceswereamplifiedbyreversetranscriptase
2
polymerasechainreaction
(
RT
2
PCR
)
fromthececaltonsilofchickenexperimentallyimmunizedwith
Eimeriatenella
.Theexpressionle
2
α
mRNAatdifferenttimeafterimmunizationwasdetectedbysemi
2
quantitativeRT
2
PCRwithvelofTNF
2
β
2
actingeneasinternalreferencetostudytherelationshipbetween
a
immunizationandthekinetic
α
ultsshowedthatthelevelofexpressionofTNF
2
expressionofTNF
2
α
genereached1stpeakonday9post
2
1st
2
immunization,andreached2ndpeakonday7post
2
booster
2
α
hadsomeeffectagainst
a
oncludedthatTNF
2
α
geneKeywords:
β
2
actingene;
Eimeriatenella
;cecaltonsil;RT
2
PCR;tumornecrosisfactor
2
鸡球虫病是由艾美属球虫寄生于鸡小肠和盲肠
上皮细胞引起的一类原虫病
,
对养鸡业的危害相当
严重。目前
,
应用抗球虫药进行预防仍是主要的防
治手段
,
但随着人们对药物残留问题的关注
,
学者们
开始转向球虫免疫的研究
,
使球虫病的免疫学研究
成为当前的研究热点
,
核酸疫苗的研究便是其中之
一
,
而利用细胞因子作为免疫佐剂可以有效增强核
酸疫苗的免疫效果
[1]
。球虫感染时
,
鸡主要有
5
种
γ
、细胞因子起作用
,
包括
IFN
2
IL
2
2
、
IL
2
5
、
TGF
和肿
瘤坏死因子
(
tumornecrosisfactor,TNF
)
[2]
。其中
的肿瘤坏死因子是近年来研究较深入、应用较广泛
α
(
TNF
2
α
)
的一种新型细胞因子
[3]
。肿瘤坏死因子2
由自然杀伤细胞
(
NK
细胞
)
和巨噬细胞分泌
,
对球
虫感染可产生保护作用
,
很多传染性或炎性刺激物
α
能促进
T
细胞能够刺激
TNF
的生物合成。
TNF
2
和
B
细胞的增生
,
提高
NK
细胞活性
,
促进吞噬细
α
作为炎症介质参与炎症反应胞的吞噬功能
;TNF
2
过程
;
影响机体的物质代谢引起恶病质
;
介导细胞凋
α
可以调节
MHC
Ⅰ和
MHC
Ⅱ亡等
[4]
。
TNF
2对抗
原呈递细胞的表达
,
是多种细胞介导免疫的最初调
收稿日期
:2007
2
08
2
13;
修回日期
:2007
2
11
2
08
基金项目
:
北京市教委资助项目
(
KM2
)
;
北京市属市管高校人才强教计划项目
(
PXM2007
2
014207
2
044539
)
作者简介
:
王彩霞
(
1982
)
,
女
,
山东潍坊人
,
硕士生
,E
2
mail:caixia
2
1688@
。3通讯作者
,
副教授
,
从事动物寄生
虫学与分子生物学研究
,E
2
mail:anyh001@
第
1
期
α
基因表达动态的关系 王彩霞等
:
柔嫩艾美球虫免疫与鸡盲肠扁桃体
TNF
2
21
节因子
,
包括
T
细胞分化、
NK
细胞和巨噬细胞作用
α
的抗球虫作用以及免疫作等
[5]
。鉴于以上
TNF
2
用
,
本试验设计从盲肠扁桃体克隆获得鸡的
TNF
2
α
,
对其表达水平进行研究
,
以探讨柔嫩艾美球虫
(
a
)
免疫与
TNF
2
α
表达动态的关系。
PCR
扩增条件为
:
首先
95
℃预变性
3min;
然后
94
℃
30s,61.9
℃
30s,72
℃
30s,
共
30
个循环
,
最后
α
基因的
72
℃延伸
5min,4
℃结束反应。
TNF
2
PCR
扩增条件为
:
首先
95
℃预变性
3min;
然后
94
1
材料与方法
1.1
实验动物
℃
30s,55.6
℃
30s,72
℃
30s,
共
30
个循环
,
最后
72
℃延伸
5min,4
℃结束反应。
α
基因的克隆鉴定与测序
1.6
鸡
β
2
actin
与
TNF
2
按
DNA
回收试剂盒说明书操作
,
用
15g/L
的
琼脂糖凝胶对
RT
2
PCR
产物进行电泳纯化
,
将回收
产物与
pGEM
2
T
载体于
4
℃连接过夜
,
转化大肠杆
菌
JM109
感受态细胞。随机挑取
LB
平板上生长良
好的白色单菌落
,
分别接种到含氨苄青霉素的
LB
液体培养基上
,37
℃摇床培养过夜。取菌液作为模
板进行
PCR
鉴定。将
PCR
鉴定的阳性菌液吸取
1
mL
进行测序
,
剩余的菌液保存于
-80
℃冰箱中。
测序结果用
DNAMAN
与预期片段进行比对
,
并将
α
基因与几种哺乳动物的
TNF
2
α
基扩增到的
TNF
2
因序列进行了同源性分析比对。
α
基因在鸡球虫病免疫期间表达水平的
1.7
TNF
2
半定量
RT
2
PCR
检测
1.7.1
材料的获得 无菌饲养
1
日龄雏鸡
,
随机分
成试验组和对照组
,
试验组共
48
只鸡
,
分别在
12
和
22
日龄时用活卵囊进行
2
次免疫
,
免疫剂量为每只
鸡
500
个卵囊
,
对照组鸡给以等量生理盐水。对照
组共
90
只鸡
,
分别在
1
、
5
、
7
、
11
、
13
、
15
、
17
、
19
、
21
、
23
、
25
、
27
、
29
、
38
、
39
日龄时每次取
6
只鸡的盲肠扁
桃体。试验组于
13
、
19
、
21
、
25
、
27
、
29
、
31
、
39
日龄时
每次取
6
只鸡的盲肠扁桃体
,
取材后保存于液氮中。
1.7.2
半定量
RT
2
PCR
分离纯化每组不同时间
1
日龄海兰灰蛋鸡
,
购自北京昌平种鸡场
,
未落
地前饲养于汽油喷灯火焰消毒的无球虫笼舍中
,
饲
喂无抗球虫药的饲料和饮水。
1.2
质粒和菌种
pGEM
2
T
克隆载体为
Promega
公司产品
,
宿主
菌
JM109
为北京全式金生物技术有限公司产品。
1.3
酶和试剂
M
2
MLV
反转录酶、
Taq
DNA
聚合酶、
dNTP
、
Oligo
(
dT
)
15
为
Promega
公司产品
,Trizol
为
In
2
vitrogen
公司产品
,RNA
酶抑制剂为大连宝生物工
程有限公司产品
,UNIQ-10
柱式
DNA
胶回收试
剂盒为上海生工生物工程技术服务有限公司产品。
其他试剂均为分析纯。
1.4
引物的设计
根据
GenBank
上鸡
β
2
actin
(
登录号为
L08165
)
、
α
(
登录号为
AY765397
)
的基因序列设计引
TNF
2
物
:
β
2
actin
上游
:5
′2
CCACAGCTGCCTCTAGC
2
TCT
2
3
′
,
下游
:5
′2
ACATCTGCTGGAAGGTGGA
2
α
上游
:5
′
C
2
3
′
,
预期扩增片段大小为
384bp,TNF
22
AGATGGGAAGGGAATGAACC
2
3
′
,
下游
:5
′2
T
2
CAGAGCATCAACGCAAAAG
2
3
′
,
预期扩增片段
大小为
269bp,
由上海生工生物工程技术服务有限
公司合成。
1.5
总
RNA
的提取及序列扩增
1.5.1
总
RNA
的提取 无菌采取鸡盲肠扁桃体
,
按
Trizol
说明书分离纯化总
RNA
。用德国
Eppen
2
dorf
公司生产的核酸蛋白浓度测定仪检测其浓度
,
用甲醛变性凝胶电泳检测其完整性。
1.5.2
RT
2
PCR
反应
RT
反应体系为
25
μ
L:
总
RNA
模板
2
μ
g,Oligo
(
dT
)
15
1
μ
L,
加灭菌超纯水构
成
9
μ
L
反应体系
,
置于
70
℃反应
5min,
立即冰浴
,
然后加
dNTPs1.25
μ
L,RNA
酶抑制剂
0.5
μ
L,M
2
MLV5
×缓冲液
5
μ
L,M
2
MLV
反转录酶
1
μ
L,
最
后用灭菌超纯水补至
25
μ
L,
置于
37
℃反应
1.5h
。
PCR
反应体系为
50
μ
L:cDNA1
μ
L,5
×缓冲
液
10
μ
L,
上、下游引物各
1
μ
L,
Taq
DNA
聚合酶
β
0
1
25
μ
L,
加灭菌超纯水至
50
μ
L
。2
actin
基因的
采集的盲肠扁桃体的总
RNA,
随机选取一总
RNA
α
作为模板
,
以不同循环数分别扩增
β
2
actin
与
TNF
2
基因
,
电泳检测确定各自扩增的最佳循环数
,
然后以
α
最佳循环数扩增获得不同时间的
β
2
actin
与
TNF
2
基因。扩增产物电泳后于凝胶成像系统
(
美国
Al
2
α
pha
公司
)
进行定量分析
,
以
TNF
2
/
β
2
actin
的净灰
α
基因的相对表达量。度比表示免疫不同时间
TNF
2
本试验重复
4
次
,
统计数据并绘制图表。
2
结果与分析
2.1
目的基因的
RT
2
PCR
对盲肠扁桃体所提取的
RNA
进行浓度测定及
完整性鉴定后
,
以质量合格的
RNA
为模板进行
RT
2
PCR
扩增
,
电泳结果显示
,
得到了与预期结果大
小相符的约
384bp
的
β
2
actin
基因和
269bp
的
α
基因特异性片段
(
见图
1
)
。
TNF
2
22
中国兽医科学第
38
卷
βα
基因不同时间的低循环数为
23
。2
actin
与
TNF
2
PCR
产物凝胶电泳结果见图
4
。
α
基因的电泳结果图
1
PCR
扩增的
β
2
actin
和
TNF
2
α
genesamplifiedFig.1
Electrophoresisof
β
2
actinandTNF
2
byPCR
α
基因
;2:
β
M:DNA
分子质量标准
;1:TNF
22
actin
基因
α
gene;2:
β
M:DL2000DNAMarker;1:TNF
22
actingene
2.2
目的基因的克隆与鉴定
βα
基因的
PCR
扩增产物经纯化 2
actin
和
TNF
2
后连接到
pGEM
2
T
载体上
,
转化大肠杆菌
JM109,
摇床培养后经
PCR
鉴定表明获得了相应大小的目
的片段。
α
基因核苷酸序列的测定
2.3
鸡
β
2
actin
与
TNF
2
β
对所构建的
pGEM
2
T
2
ch
2
actin
和
pGEM
2
T
2
ch
α
质粒进行测序
,
比对结果显示
β
TNF
22
actin
基因与
目的序列
(
GenBank
登录号
:L08165
)
的一致性达
α
基因与目的序列
(
GenBank
登录号
:99
1
2%,TNF
2
AY765397
)
的一致性达
99.6%
。同源性比较也显
图
3
不同循环数
PCR
产物的电泳分析结果
Fig.3
ElectropherogramanalysisresultsofPCRproductsfor
differentcycles
α
基因与其他几种哺乳动物的同示
β
2
actin
和
TNF
2
源性比较低
,
说明是预期要扩增的目的基因。
α
在鸡球虫病免疫期间的表达动态
2.4
TNF
2
βα
基因
PCR
扩增时最低循环数 2
actin
与
TNF
2
的确定结果见图
2
。根据图
2,
统计结果后得出其不
同循环数光密度值的曲线图
(
见图
3
)
。
α
与
β
图
4
不同日龄鸡盲肠扁桃体中
TNF
22
actin
基因
PCR
产物的电泳结果
α
andFig.4
ElectrophoresisofthePCRproductsforTNF
2
β
2
actinfromchickencecaltonsilondifferentday
2
old
M:DNA
分子质量标准
;
上方
1
～
15:
对照组
1
、
5
、
7
、
11
、
13
、
15
、
17
、
α
基因的表达
19
、
21
、
23
、
25
、
27
、
29
、
38
、
39
日龄鸡盲肠扁桃体
TNF
2
动态
;16
～
23:
免疫组
13
、
19
、
21
、
25
、
27
、
29
、
31
、
39
日龄鸡盲肠扁桃体
α
基因的表达动态
;
下方
1
～
15:
对照组
1
、
TNF
2
5
、
7
、
11
、
13
、
15
、
17
、
19
、
21
、
23
、
25
、
27
、
29
、
38
、
39
日龄鸡盲肠扁桃体
β
2
actin
基因的表达动
βα
基因不同循环数的电泳结果图
2
2
actin
和
TNF
2
α
genesindiffer
2
Fig.2
Electrophoresisfor
β
2
actinandTNF
2
entcycles
M:DNA
分子质量标准
;1
～
5
分别是
16
、
18
、
19
、
20
、
23
个循环
;6
～
10
分别是
30
、
26
、
23
、
21
、
19
个循环
M:DL2000DNAMarker;1-5:PCRproductsin16,18,19,20,23
cyclesrespectively;6-10:PCRproductsin30,26,23,21,19cycles
respectively
态
;16
～
23:
免疫组
13
、
19
、
21
、
25
、
27
、
29
、
31
、
39
日龄鸡盲肠扁桃体
β
2
actin
基因的表达动态
M:DL2000DNAMarker;Thesuperior1-15:Thekineticexpres
2
α
geneincecaltonsilfrom1,5,7,11,13,15,17,19,21,sionofTNF
2
23,25,27,29,38,39day
2
oldchickensofcontrolgrouprespectively;
α
geneincecaltonsilfrom16-23:ThekineticexpressionofTNF
2
13,19,21,25,27,29,31,39day
2
oldchickensofimmunitygroupre
2
spectively;Theinferior1-15:Thekineticexpressionof
β
2
actingene
incecaltonsilfrom1,5,7,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,38,39
day
2
oldchickensofcontrolgrouprespectively;16-23:Thekinetic
expressionof
β
2
actingeneincecaltonsilfrom13,19,21,25,27,29,
31,39day
2
oldchickensofimmunitygrouprespectively
根据图
3
结果确定了
PCR
扩增
β
2
actin
基因时
α
基因时的最的最低循环数为
19,PCR
扩增
TNF
2
第
1
期
α
基因表达动态的关系 王彩霞等
:
柔嫩艾美球虫免疫与鸡盲肠扁桃体
TNF
2
23
α
基因 经过
4
次重复
,
求取平均值
,
绘制
TNF
2
在鸡球虫病免疫前后不同时间的表达动态
(
见图
α
基因在两次免疫期间
5
)
。从图
5
可以看出
,TNF
2
的表达量整体上呈现双峰模式
,
首免后第
9d
和二
免后第
7d
分别是两次免疫的峰值
,
且首免峰值是
二免峰值的
2
倍左右。
虫。它还可以刺激内皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、
中性粒细胞、枯否氏细胞和肝细胞产生
NO
等
,
抑制
线粒体功能
,
使球虫能量的生成减少
,
最终导致虫体
发育障碍甚至死亡
[10]
。
α
基因在两次免疫期间 本试验结果显示
,TNF
2
的表达动态呈双峰模式
,
这与
Byrnes
等
[11]
在体外
检测到两次感染巨型艾美球虫
(
)
和柔嫩
α
呈双峰模式艾美球虫期间巨噬细胞产生的
TNF
2
相吻合。他们发现第一个峰值几乎是第二个峰值的
4
倍
,
均高于对照组
,
并提出第一个峰与疾病的致病
过程有关
,
第二个峰与保护性免疫的形成有关。本
试验中的不同是
,
首免峰值是二免峰值的
2
倍
,
只有
首免的峰值高于正常值
,
其余时间试验组的相对表
达量均低于对照组。笔者认为
,
这可能与海兰灰这
种鸡品种的免疫遗传因素有关。
Zhang
等
[12]
在研
究
SC
和
TK
鸡球虫病发病机理中类
TNF
活性的
作用时
,
发现用抗
TNF
的抗体处理
SC
鸡可增加因
柔嫩艾美球虫感染所致的增重降低
,
而
TK
鸡未出
α
在不同品种的鸡体内发挥现该现象
,
这说明
TNF
2
着不同的作用。
Choi
等
[13]
发现初次感染堆形艾美
γ
的表达量保持恒球虫的
SC
鸡盲肠扁桃体
IFN
2
定
,
而
TK
鸡却是减少的
,
二次感染后两者的表达量
α
也存在这种免疫遗传差则都增长了一样
,TNF
2
α
在柔嫩艾美异。在遗传因素的影响下
,
使得
TNF
2
α
在首球虫免疫初期的表达量低于正常值。
TNF
2
α
对球次免疫后第
9d
时达到高峰
,
笔者推测
,TNF
2
γ
被认为起着关键作虫感染具有保护作用
,IFN
2
γ
mRNA
在柔嫩艾美球虫感染后的
用
[9,12]
,
而
IFN
2
γ
可刺激巨
第
6d
和第
8d
时明显增多
[14]
,
且
IFN
2
α
。因此在
IFN
2
γ
的量达到最大
,
噬细胞产生
TNF
2
α
对巨噬细胞产生了最大刺激之后才引起了
TNF
2
α
基因表达量基因表达量峰值的出现
,
从而使
TNF
2
α
基因达到高峰的时间推迟了。二次免疫后
TNF
2
的表达量在第
7d
时达到高峰
,
随后开始下降
,
第
9
d
时降至最低值
,
二免后第
17d
时又回升至接近正
α
基因的表达量常值。整个二免期间试验组
TNF
2
均低于对照组
,
但期间仍有一个峰值
,
笔者推测可能
是由于免疫记忆对机体的保护性免疫形成的
,
可见
α
在抗球虫方面还是有一定作用的。
TNF
2
α
增强抵抗球虫的作 综上所述
,
在首免时
TNF
2
用比较明显
,
而在二次免疫时的作用不是很明显
,
而
且鸡的品种不同
,
其作用效果也不同。因此
,
要彻底
α
的抗球虫作用
,
将其作为一种疫苗佐剂弄清
TNF
2
来使用还有待于进行更深入的研究
,
尤其是鸡的免
疫遗传因素与进化史对其发挥作用的影响的研究。
α
基因在鸡球虫病免疫前后不同时间的表达图
5
TNF
2
α
geneduringtheimmunityFig.5
KineticexpressionofTNF
2
againstcoccidiosis
3
讨论
肿瘤坏死因子是一种存在于动物体内
,
能杀伤
某些肿瘤细胞并使肿瘤组织发生出血性坏死的小分
子蛋白质
,
它在机体免疫过程中起着很重要的作用。
目前
,
有关肿瘤坏死因子的研究主要是人类和哺乳
动物较多
,
而在禽类方面的研究主要是有关
TNF
的活性及理化性质的研究
[6]
,
克隆及功能方面的研
究较少。柔嫩艾美球虫主要侵害鸡的盲肠
,
而盲肠
扁桃体是盲肠主要的免疫器官
,
并且分泌大量细胞
因子参与免疫反应。因此
,
本试验选择从盲肠扁桃
α
基因并进行序列分析
,
与体取材
,
克隆鸡的
TNF
2
α
基因序列也进行了比对
,
比对结其他物种的
TNF
2
果显示与预期片段大小相符
,
与其他几种哺乳动物
α
基因的同源性较低
,
表明本试验成功克隆了
TNF
2
α
。海兰灰鸡的
TNF
2
目前
,
已知柔嫩艾美球虫子孢子、裂殖子可刺激
鸡巨噬细胞、
NK
细胞和外周血液中巨噬细胞产生
α
,
适量的
TNF
2
α
有利于机体清除虫体。此
TNF
2
γ
也可以激活巨噬细胞
,
促进
TNF
2
α
的分外
,IFN
2
α
在鸡球虫免疫过程中有一定的抗泌。因此
,TNF
2
α
抗球虫的主要作用机制是增球虫作用
[7
2
9]
。
TNF
2
强吞噬细胞的吞噬功能
;
活化巨噬细胞
,
通过呼吸激
发产生活性氧自由基
,
再经脂质过氧化反应杀伤球
24
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