2024年6月2日发(作者：微生燕岚)
中国实验诊断 ２０１Ｑ生 箜
文章编号：１００７—４２８７（２０１０）０１—０００９—０３
抑制ＳＴＡＴ３表达增加Ｈ２Ｏ２诱导
人胶质瘤Ｕ２５ １细胞损伤
苏静，孙际童，刘 宁，钟加滕，刘 菲，于慧美，康劲松
（吉林大学白求恩医学院病理生理学系，吉林长春１３００２１）
摘要：目的探讨ＲＮＡ干涉技术抑制ＳＴＡＴ３基因表达对过氧化氢（Ｈ２０２）复制的人胶质瘤Ｕ２５１细胞损伤模型的
影响。方法转染ｐｓｉｌｅｎｃｅｒ １．０－Ｕ６一ＳｉＲＮＡ—ＳＴＡＴ３重组质粒到Ｕ２５１细胞；Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ方法观察转染重组质粒对ＳＴＡＴ３
蛋白表达的影响；ＭＴ＇Ｆ法检测细胞生存率，ＴＵＮＥＬ法检测细胞凋亡，Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ检测凋亡相关蛋白ＢＣＬ－２、ＢＡＸ表达。
结果转染ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ １．０－Ｕ６－ＳｉＲＮＡ—ＳＴＡＴ３重组质粒能有效抑制Ｕ２５１细胞ＳＴＡＴ３蛋白表达（抑制率＞５０％）；抑制
ＳＴＡＴ３表达能促进１１２０２诱导Ｕ２５１细胞生存率下降，增加细胞凋亡率（Ｐ＜０．０５）。ＳＴＡＴ３抑制能促进Ｈ１０２作用下
Ｕ２５１细胞ＢＣＬ－２表达降低，ＢＡＸ表达增加（Ｐ＜０．０５）。结论ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ １．０－Ｕ６．ＳｉＲＮＡ—ＳＴＡＴ３可有效抑制Ｕ２５１细胞
Ｓ＇ＦＡＴ３的表达，并促进Ｈ２０２诱导Ｕ２５１细胞凋亡。
关键词：胶质瘤；信号转导及转录激活因子３；过氧化氧；凋亡
中图分类号：Ｒ７３９．４ 文献标识码：Ａ
Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆＳＹＡＴ３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＦａｃｉｌｉｔａｔｅｓＡｐｏｐｔｏ￣Ｉｎｄｕｃｅｄｂｙ ０２ｉｎＨｍｎａｎＧｌｉｏｍａＵ２５１ Ｃｅｌｌｓ ＳＵ ｎｇ，ＳＵＮ 一ｔｏｎｇ，
ＨＵ ，ｌｇ，ｅｔ ．（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＰａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏ￣ ，Ｎｏｒｍａｎ Ｂｅｔｈｎａｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３００２１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０－Ｕ６一ｓｉＲＮＡ—ＳＴＡＴ３ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｉｎｊｕｒｙ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｕ２５１ ｇｌｉｏｍａ
ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ（Ｈ２ｏ２）．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＰＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０．Ｕ６一ｓｉＲＮＡ—ＳＴＡＴ３ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ Ｕ２５１ ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ ＳＴＡＴ３
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｕ２５ １ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｄｅ ｗｉｔｈ ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０－Ｕ６－ｓｉＲＮＡ—ＳＴＡＴ３ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ．Ｔｈｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｕ２５ １ ｃｅｌｌｓ Ｗａｓ
ｍｅａｓｉＩｒｅｄ ｂｙ舯ｓａｓａｙ．ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ＴＵＮＥＬ ｓａｓａｙ．ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＢＣＬ－２ ａｎｄ ＢＡＸ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔ—
ｅｍ ｂｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｒａｎｓｆｅｅｔｉｏｎ ｏｆ ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１． Ｕ６．ｓｉＲＮＡ—ＳＴＡＴ３ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＳＴＡＴ３ ｅｆｉｆｃｉｅｎｔｌｙ ｉｎ Ｕ２５ １ ｃｅｌｌｓ（ｉｎ—
ｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ＞５０％）．Ｓｕｐｐｒｅｓｉｏｎ ｏｆ ＳＴＡ３３ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ ｈｔｅ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ（Ｐ＜０．０５）ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｈ２０２ ｉｎ Ｕ２５１ ｃｅＨｓ．Ｉｎ—
ｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＳＴＡＴ３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｈｔｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ＢＣＬ－２ ａｎｄ ＢＡＸ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｈ２０２ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ Ｕ２５１ ｃｅｌｌｓ（Ｐ＜
０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０－Ｕ昏ｓｉＲＮＡ—ＳＴＡＴ３ ｃｏｕｌｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＳＴＡＴ３ ｅｆｉｆｃｉｅｎｔｌｙ ａｎｄ ｆａｃｉｌｉｔａｔ—
ｅｄ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｈ２０２ ｉｎ Ｕ２５１ ｃｅｌｌｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｇｌｉｏｍａ；Ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ３：Ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ；Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
（Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ嘶ｌ，２０１０，１４：ＯＯＯ９）
神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿 化形成二聚体入核后启动基因转录在细胞因子（ｃｙ—
瘤，基因突变导致的细胞周期失控及抗凋亡能力增
ｔｏｋｉｎｅ，ＣＫ）的信号转导中起着关键性的作用ｌ２ｊ。已
加是其发生的主要原因 ｌｊ。神经胶质瘤恶性程度
有研究证明，在多种肿瘤包括胶质瘤中，ＳＴＡＴ３及其
高，预后差，传统的放疗、化疗及手术治疗在内的综
下游基因包括ｃｙｃｌｉｎＤ１、ｃ．Ｍｙｃ、Ｂｃ１．２和ＶＥＧＦ等常显
合疗法均不能解决肿瘤的恶化转移问题。信号转导
示异常表达或活性增强 ｊ。ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉ）是一
及转录激活因子３（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ０ｆ
种转录后的基因沉默。它能触发某种转录后监控程
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ３，ｓＴＡ１ｒ３）具有诱导细胞增殖和抑制凋亡
序，导致特异的ｍＲＮＡ单链降解 ４］。本实验利用
的作用，作为Ｊａｎｕｓ激酶（Ｊａｎｕｓ ｋｉｎａｓｅ，ＪＡＫ）．ＳＴＡＴ途
ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ １．０一Ｕ６一ｓｉＲＮＡ—ＳＴＡＴ３重组质粒有效抑制人
径中ＪＡＫ激酶的底物，ＳＴＡＴ３的酪氨酸残基被磷酸
胶质瘤Ｕ２５１细胞ＳＴＡＴ３蛋白表达，并观察其对氧化
应激诱导的Ｕ２５１细胞损伤作用的影响，希望为胶质
基金项目：国家自然科学基金（３０５７０６８７）；吉林省科技厅医学专项基
瘤临床治疗提供新的理论基础和实践依据。
金资助项目（２００５０５１３９）；吉林省科技厅资助项目（Ｎｏ．
１材料和方法
２００７０５３７３）
１．１材料
＊通讯作者
人胶质瘤Ｕ２５１细胞和大肠埃希菌ＪＭ１０９由吉
～
ｌＯ一
Ｃｈｉ
ｎ Ｊ Ｌ
ａｂ
Ｄｉａｇｎ，Ｊａｎｕａｒｙ，２０１０，Ｖｏｌ １４，Ｎｏ．Ｉ
林大学白求恩医学院病理生理学系提供；带有Ｕ６
育１５ ｍｉｎ，全自动酶标仪（波长５７０ ｎｍ）检测各孔的
吸光度，计算细胞生存率。结果应用ＳＰＳＳ１１．５进
行统计学分析。
１．２．５ Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ检测蛋白表达用ＲＩＰＡ裂解液
提取细胞总蛋白，Ｂｉｏｆｒａｄ法蛋白定量，进行Ｗｅｓｔｅｍ．
ｂｌｏｔ分析：取３０ ｇ总蛋白上样，实验结果经天能凝
启动子的质粒载体（ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ－１．Ｏ—Ｕ６）购自美国Ａｍ．
ｂｉｏｎ公司；新生小牛血清、ＩＭＤＭ培养基购自Ｈｙｃｌｏｎｅ
公司；胶回收试剂盒、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶、ＡＰＡ Ｉ、Ｅｃ０Ｒ
Ⅱ和Ｈ ｉｎｄ ｍ限制性内切酶、质粒提取试剂盒、ＲＴ－
ＰＣＲ相关试剂及寡核苷酸合成均购自Ｔａｋａｒａ公司；
ＳＴＡＴ３、ｐＳＴＡＴ３、Ｂｃ１．２、Ｂａｘ、￣－ａｃｔｉｎ抗体，辣根过氧化
物酶（ＨＲＰ）标记二抗均购自Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ公司；脂质体
（１ｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）、 ｚｏｌ试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。
胶成像系统摄像、进行灰度值分析。
１．２．６ ＴＵＮＥＬ法检测细胞凋亡Ｕ２５１细胞接种于
预先放置盖玻片的２４孔板中，按前述方法转染给
１．２方法
１．２．１重组质粒ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０一Ｕ６．ｓｉＲＮＡ—ＳＴＡＴ３构建
及鉴定根据ｇｅｎｅｂａｎｋ（ＮＭ ３１５００）人ＳＴＡＴ３基因ｍＲ．
ＮＡ的已知序列和本实验室前期工作，确定合适的靶
位点（２１４３．２１６２）。寡核苷酸链序列：ＧＣＡＧＣＡＧＣＴ．
ＧＡＡＣＡＡＣＡＴＧ；ｓｉＲＮＡ模板：ｓｅｎｓｅ：５’．ＧＡＴ ＣＣＧ ＣＡＧ
ＣＡＧ ＣＴＧ从Ｃ从Ｃ ＡＴＧ ＴＴ℃ＡＡＧ ＡＧＡ ＣＡＴ ＧＴｒ
ＧＴＩ＂ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＹ ＴＩ］ｒ ＴＧＧ ＡＡＡ．３’；ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：
５’．ＡＧＣ １ｒ］［ＴｒＴＣＣ ＡＡＡ Ａ从ＧＣＡ ＧＣＡ ＧＣＴ ＧＡＡ ＣＡＡ
ＣＡＴ ＧＴＣ ＴＣＴ １１ＧＡ ＡＣＡ ＴＧＴ ＴＧＴ ＴＣＡ ＧＣＴ ＧＣＴ ＧＣＧ－
３’。ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１
．
０．Ｕ６经ＡＰＡ工和ＥｃｏＲ Ｉ限制性内切
酶线性化，在Ｔ４ ＤＮＡ连接酶的作用下与退火后形
成的双链结构连接，形成ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０．Ｕ６．ｓｉＲＮＡ．
ＳＴＡＴ３重组质粒。
１．２．２细胞培养及转染将Ｕ２５１细胞（１×ｌＯ６个）
分别接种于１００ ｍｌ培养瓶中（１０％小牛血清ＩＭＤＭ
培养液，３７ ｏＣ，５％ＣＯ２），培养至８０％一９０％细胞融
合。用无血清培养液洗３遍，将重组质粒ｐＳｉ．
１ｅｎｅｅｒ１．０一Ｕ６一ｓｉＲＮＡ—ＳＴＡＴ３按脂质体（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ
２０００）使用说明操作，培养４ ｈ后（无血清ＩＭＤＭ培养
液，３７℃，５％ＣＯ２），弃上清，加入含１０％小牛血清
培养液及给药后继续培养２４小时，收集细胞备用。
１．２．３实验分组及给药方法实验共分４组，对照
组：转染ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０．Ｕ６质粒；ＳＴＡＴ３一ＳｉＲＮＡ组：转
染ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０．Ｕ６．ｓｉＲＮＡ．ＳＴＡＴ３质粒；Ｈ２Ｏ２组：转
染ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０一Ｕ６质粒４ ｈ后加入Ｈ２０２（终浓度为１
ｍｍｏｌ／Ｌ）给药２４ ｈ；ＳＴＡＴ３．ＳｉＲＮＡ＋Ｈ２０２组：转染
ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０一Ｕ６．ｓｉＲＮＡ．ＳＴＡＴ３质粒４ ｈ后加入Ｈ２０２
（终浓度为１ ｍｍｏｌ／Ｌ）给药２４ ｈ。
１．２．４亚甲基四唑蓝（ＭＩＴ）比色法检测细胞生存
率取对数生长的细胞接种于９６孔培养板，按细胞
数１×１０４／ｗｅｌ１种人细胞，待细胞长满孔底９０％时按
上述方法转染给药，每组设５复孔，实验结束前４ ｈ
加ＭＴＹ（５ ｍ＃ｎ￣）２０ ｂｔｌ／ｗｅｌｌ，３７ ｑＣ孵育４ ｈ后吸出所
有液体加入二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）１５０ ｔ．ｄ／ｗｅｌｌ，室温孵
药。实验结束时用冷ＰＢＳ冲洗３次，冷４％中性多
聚甲醛固定２０ ｍｉｎ，室温干燥过夜。干燥后盖玻片
～
２０℃保存。按ＴＵＮＥＬ使用说明书染色。荧光显
微镜下成像，激发波长为４５０—５００ Ｂｉｎ，检测波长为
５１５—５６５ ｎｍ（绿色荧光）。按说明书设立阴性对照。
计算细胞凋亡率。每组重复３次。
１．２．７统计学处理采用ＳＰＳＳ １１．Ｏ软件分析。计
量资料实验数据以均数±标准差（ｘ±ｓ）表示。单
变量配对资料之间的比较采用配对样本ｔ检验。
２结果
２．１转染重组质粒ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０．Ｕ６．ｓｉＲＮＡ．ＳＴＡＴ３
能够有效抑制ＳＴＡＴ３在Ｕ２５１细胞中的表达
Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ结果显示，与对照组相比，ＳＴＡＴ３．
ＳｉＲＮＡ组Ｕ２５１细胞ＳＴＡＴ３蛋白表达明显下降，对结
果进行灰度分析，蛋白表达降低５３．７ ４－６．２％（Ｐ＜
０．０５，凡＝３）（见图１）。
２．２抑制ＳＴＡＴ３表达对Ｈ２ｏ２作用下Ｕ２５１细胞生
存率的影响
ＭＴＦ结果显示，与对照组相比，Ｈ２Ｏ２组细胞生
存率为５３．８±６．２％（Ｐ＜０．０５，ｎ＝３）；ＳＴＡＴ３一ＳｉＲＮＡ
＋Ｈ，０＇组生存率为３２．３±ｌ１．６％，明显低于对照组
和Ｈ＇０＇组（Ｐ＜０．０５，ｎ：３）（见图２）。
２．３ ＴＵＮＥＬ法检测抑制ＳＴＡＴ３表达对Ｈ２ｏ２作用
下Ｕ２５１细胞凋亡的影响
使用ＴＵＮＥＬ法检测抑制ＳＴＡＴ３表达和Ｈ２０２作
用引起Ｕ２５１细胞发生凋亡的情况。荧光显微镜下
观察，细胞核呈绿色荧光为凋亡阳性细胞。ＴＵＮＥＬ
结果显示：与对照组相比，Ｈ２０２组细胞凋亡率（１７．０
±４．３％）日呵显增力Ⅱ（Ｐ＜０．０５，ｎ＝３）；ＳＴＡＴ３ ＳｉＲＮＡ
＋Ｈ２Ｏ，组细胞凋亡率（２７．８±８．６％）明显高于
Ｈ２０２组（Ｐ＜０．０５，ｎ＝３）。
２．４凋亡相关蛋白ＢＣＬ－２和ＢＡＸ表达变化
Ｗｅｓｔｅｍ—ｂｌｏｔ结果显示，与对照组（１．０±０．０８）相
比，Ｈ’０２组ＢＣＬ－２与ＢＡＸ蛋白表达之比（０．５６ ４－
０．１１）明显降低（Ｐ＜０．０５，凡＝３）；与Ｈ２０２组相比，
中国实验诊断学２０１０年１届 苤 鲞笙 塑
ＳＴＡＴ３．ＳｉＲＮＡ＋Ｈ２０２组ＢＣＬ－２与ＢＡＸ蛋白表达之 图３）。
比（０．３２±０．１４）明显降低（Ｐ＜０．０５，ｎ＝３）（见
彗
至
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∽ ∞
｛０々 Ｉ ０《 ０ ｌ ０
Ｕ 雹 ４－
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Ｅ二］：Ｂ Ｃ Ｌ－２
＝
０
＊Ｐ＜０．０５ Ｙｓ ｃ￣ｔｍｌ ｇｒｏｕｐ，＃Ｐ＜０．０６ ＶＳ Ｏ２ ｇｒｏｕｐ
图１ ＳＴＡＴ３－ＳｉＲＮＡ重组质粒对Ｕ２５１
细胞￥ＴＡＴ３蛋白表达的影响
图２抑制ＳＴＡＴ３表达对Ｈ２０２作用
下Ｕ２５１细胞生存率的影响
图３抑制ＳＴＡＴ３表达对Ｈ２０２作用下
Ｕ２５１细胞凋亡相关蛋白ＢＣＬ－２
和ＢＡＸ表达的影响
３讨论
降低细胞生存率，增加细胞凋亡，使ＢＣＬ－２和ＢＡＸ
表达比值降低。最近的研究已经证实ＳＴＡＴ３在神
经胶质瘤和神经胶质瘤细胞系都存在异常持续性激
活，在神经胶质瘤的增殖、分化和进展过程中具有重
要的作用 ３。在我们的研究工作中，得到如下结论：
活性氧Ｈ２０ 是体内氧化代谢的中间产物，易通
过细胞膜产生细胞毒性，引起细胞氧化应激损伤和
细胞死亡，常用于复制细胞氧化损伤模型 ｊ。
ＳＴＡＴ３可被多种细胞因子和生长因子激活，在胚胎
发生和早期发育过程中具有不同的功能。在肿瘤发
生过程中，常存在由蛋白酪氨酸激酶（ ｓ）异常激
活导致的ＳＴＡＴ３的异常活化＿６ 。近来研究发现，在
多发性骨髓瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和头颈部
肿瘤中ＳＴＡＴ３持续激活ｌ＿３』。利用反义寡核苷酸抑
制ＳＴＡＴ３表达或ＳＴＡＴ信号转导通道抑制剂，均能
降低细胞生存率，诱导凋亡发生。
ＲＮＡ干扰（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｅｅ，ＲＮＡｉ）是一种转录
后的基因沉默，能够触发某种转录后监控程序，导致
有效抑制ＳＴＡＴ３表达能降低神经胶质瘤细胞生存
率，并增加其对氧化应激损伤的敏感性。
作者简介：苏静（１９７８一），女，在读医学博士，研究方向为肿
瘤病理生理学
参考文献：
［１ｊＭａｈｅｒ ＥＡ，Ｆｕｍａｒｉ ＦＢ，Ｂａｃｈｏｏ ＲＭ，ｅｔ ａ１．Ｍａｌｉｇｎａｎｔ￣ｉｏｍａ：ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ
ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａ ｅ ｍａｔｔｅｒ［Ｊ］．Ｃ￣ｎｅｓ Ｄｅｖ，２００１，１５：１３１１．
２］ＮｕｆｉａＩ，Ｇｅｎｅｖｉｅｖｅ Ｋ，Ｓｉｄｈａｒｔｈ Ｖ，ｅｔａ１．Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｇｌＥＮ，ｒｅｇｕｌａｔｅｄ
ＳＴＡＴ３ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，２００８，２２：４４９．
３ Ｂｕｅｔｔｎｅｒ Ｒ，Ｍｏｒａ ＬＢ ａＪ１ｄ Ｊｏｖｅ Ｒ．Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＡＴ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｕ．
一一
特定ｍＲＮＡ单链降解，调控特定基因的表达 。我
们利用ＲＮＡｉ技术特异性抑制ＳＴＡＴ３表达，观察其
ｎｌｏｒｓ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｎｍ ｅｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｔｅｎｅｎｔｉｏｎ【Ｊ］．Ｃｌｉｎ
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００，８：９４５．
对氧化应激损伤Ｕ２５１细胞的影响。实验结果显示，
我们设计构建合成的ＤＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０．Ｕ６一ｓｉＲＮＡ．ＳＴＡＴ３
重组质粒体外转染Ｕ２５１细胞，能够有效抑制ＳＴＡＴ３
蛋白表达（抑制率＞５０％）。有效抑制ＳＴＡＴ３表达
４ ＩＡｐｐｍｍ￣Ｚ，Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ Ｒ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎ￣ｅ ｉｎ ｈｅｔｅｒｏｅｌｕｃｏ—
ｍａｔｉｃ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ［Ｊ ．Ｎａｔｕｒｅ，２００４，４３１：３６４．
１．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ—ｉｎ．
５］Ｊａｅｓｃｈｋｅ Ｈ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｊｕｒｙ
１
．
．
ｄｕｅｅｄ ｌｉｖｅｒ（，ｅｌｌ ｉｎｊｕ￣＇ｄｕｒｉｎｇ ｈｅｐａｔｉｃ ｉ￣ｈｅｍｉａ・ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｃｕｔｅ
ｉｎｆｔａｎｓ￣ｔｏｒｖ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｍｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ，
２００６，２９０：１０８３．
能降低Ｕ２５１细胞生存率、增加细胞凋亡率，同时降
低凋亡相关蛋白ＢＣＬ一２和ＢＡＸ表达比值。氧化应
６ 手春光，姚宪亭，张兴义．ＳｉｌＬＮＡ．ＳＴＡＴ３在肿瘤研究中的应用［Ｊ］
中国实验诊断学，２００６，１ｏ（２）：２１０．
激损伤Ｕ２５１细胞模型中，抑制ＳＴＡＴ３表达，进一步
（收稿日期：２００９—０７—１４）
2024年6月2日发(作者：微生燕岚)
中国实验诊断 ２０１Ｑ生 箜
文章编号：１００７—４２８７（２０１０）０１—０００９—０３
抑制ＳＴＡＴ３表达增加Ｈ２Ｏ２诱导
人胶质瘤Ｕ２５ １细胞损伤
苏静，孙际童，刘 宁，钟加滕，刘 菲，于慧美，康劲松
（吉林大学白求恩医学院病理生理学系，吉林长春１３００２１）
摘要：目的探讨ＲＮＡ干涉技术抑制ＳＴＡＴ３基因表达对过氧化氢（Ｈ２０２）复制的人胶质瘤Ｕ２５１细胞损伤模型的
影响。方法转染ｐｓｉｌｅｎｃｅｒ １．０－Ｕ６一ＳｉＲＮＡ—ＳＴＡＴ３重组质粒到Ｕ２５１细胞；Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ方法观察转染重组质粒对ＳＴＡＴ３
蛋白表达的影响；ＭＴ＇Ｆ法检测细胞生存率，ＴＵＮＥＬ法检测细胞凋亡，Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ检测凋亡相关蛋白ＢＣＬ－２、ＢＡＸ表达。
结果转染ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ １．０－Ｕ６－ＳｉＲＮＡ—ＳＴＡＴ３重组质粒能有效抑制Ｕ２５１细胞ＳＴＡＴ３蛋白表达（抑制率＞５０％）；抑制
ＳＴＡＴ３表达能促进１１２０２诱导Ｕ２５１细胞生存率下降，增加细胞凋亡率（Ｐ＜０．０５）。ＳＴＡＴ３抑制能促进Ｈ１０２作用下
Ｕ２５１细胞ＢＣＬ－２表达降低，ＢＡＸ表达增加（Ｐ＜０．０５）。结论ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ １．０－Ｕ６．ＳｉＲＮＡ—ＳＴＡＴ３可有效抑制Ｕ２５１细胞
Ｓ＇ＦＡＴ３的表达，并促进Ｈ２０２诱导Ｕ２５１细胞凋亡。
关键词：胶质瘤；信号转导及转录激活因子３；过氧化氧；凋亡
中图分类号：Ｒ７３９．４ 文献标识码：Ａ
Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆＳＹＡＴ３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＦａｃｉｌｉｔａｔｅｓＡｐｏｐｔｏ￣Ｉｎｄｕｃｅｄｂｙ ０２ｉｎＨｍｎａｎＧｌｉｏｍａＵ２５１ Ｃｅｌｌｓ ＳＵ ｎｇ，ＳＵＮ 一ｔｏｎｇ，
ＨＵ ，ｌｇ，ｅｔ ．（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＰａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏ￣ ，Ｎｏｒｍａｎ Ｂｅｔｈｎａｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３００２１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０－Ｕ６一ｓｉＲＮＡ—ＳＴＡＴ３ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｉｎｊｕｒｙ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｕ２５１ ｇｌｉｏｍａ
ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ（Ｈ２ｏ２）．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＰＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０．Ｕ６一ｓｉＲＮＡ—ＳＴＡＴ３ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ Ｕ２５１ ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ ＳＴＡＴ３
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｕ２５ １ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｄｅ ｗｉｔｈ ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０－Ｕ６－ｓｉＲＮＡ—ＳＴＡＴ３ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ．Ｔｈｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｕ２５ １ ｃｅｌｌｓ Ｗａｓ
ｍｅａｓｉＩｒｅｄ ｂｙ舯ｓａｓａｙ．ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ＴＵＮＥＬ ｓａｓａｙ．ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＢＣＬ－２ ａｎｄ ＢＡＸ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔ—
ｅｍ ｂｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｒａｎｓｆｅｅｔｉｏｎ ｏｆ ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１． Ｕ６．ｓｉＲＮＡ—ＳＴＡＴ３ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＳＴＡＴ３ ｅｆｉｆｃｉｅｎｔｌｙ ｉｎ Ｕ２５ １ ｃｅｌｌｓ（ｉｎ—
ｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ＞５０％）．Ｓｕｐｐｒｅｓｉｏｎ ｏｆ ＳＴＡ３３ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ ｈｔｅ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ（Ｐ＜０．０５）ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｈ２０２ ｉｎ Ｕ２５１ ｃｅＨｓ．Ｉｎ—
ｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＳＴＡＴ３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｈｔｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ＢＣＬ－２ ａｎｄ ＢＡＸ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｈ２０２ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ Ｕ２５１ ｃｅｌｌｓ（Ｐ＜
０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０－Ｕ昏ｓｉＲＮＡ—ＳＴＡＴ３ ｃｏｕｌｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＳＴＡＴ３ ｅｆｉｆｃｉｅｎｔｌｙ ａｎｄ ｆａｃｉｌｉｔａｔ—
ｅｄ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｈ２０２ ｉｎ Ｕ２５１ ｃｅｌｌｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｇｌｉｏｍａ；Ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ３：Ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ；Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
（Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ嘶ｌ，２０１０，１４：ＯＯＯ９）
神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿 化形成二聚体入核后启动基因转录在细胞因子（ｃｙ—
瘤，基因突变导致的细胞周期失控及抗凋亡能力增
ｔｏｋｉｎｅ，ＣＫ）的信号转导中起着关键性的作用ｌ２ｊ。已
加是其发生的主要原因 ｌｊ。神经胶质瘤恶性程度
有研究证明，在多种肿瘤包括胶质瘤中，ＳＴＡＴ３及其
高，预后差，传统的放疗、化疗及手术治疗在内的综
下游基因包括ｃｙｃｌｉｎＤ１、ｃ．Ｍｙｃ、Ｂｃ１．２和ＶＥＧＦ等常显
合疗法均不能解决肿瘤的恶化转移问题。信号转导
示异常表达或活性增强 ｊ。ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉ）是一
及转录激活因子３（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ０ｆ
种转录后的基因沉默。它能触发某种转录后监控程
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ３，ｓＴＡ１ｒ３）具有诱导细胞增殖和抑制凋亡
序，导致特异的ｍＲＮＡ单链降解 ４］。本实验利用
的作用，作为Ｊａｎｕｓ激酶（Ｊａｎｕｓ ｋｉｎａｓｅ，ＪＡＫ）．ＳＴＡＴ途
ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ １．０一Ｕ６一ｓｉＲＮＡ—ＳＴＡＴ３重组质粒有效抑制人
径中ＪＡＫ激酶的底物，ＳＴＡＴ３的酪氨酸残基被磷酸
胶质瘤Ｕ２５１细胞ＳＴＡＴ３蛋白表达，并观察其对氧化
应激诱导的Ｕ２５１细胞损伤作用的影响，希望为胶质
基金项目：国家自然科学基金（３０５７０６８７）；吉林省科技厅医学专项基
瘤临床治疗提供新的理论基础和实践依据。
金资助项目（２００５０５１３９）；吉林省科技厅资助项目（Ｎｏ．
１材料和方法
２００７０５３７３）
１．１材料
＊通讯作者
人胶质瘤Ｕ２５１细胞和大肠埃希菌ＪＭ１０９由吉
～
ｌＯ一
Ｃｈｉ
ｎ Ｊ Ｌ
ａｂ
Ｄｉａｇｎ，Ｊａｎｕａｒｙ，２０１０，Ｖｏｌ １４，Ｎｏ．Ｉ
林大学白求恩医学院病理生理学系提供；带有Ｕ６
育１５ ｍｉｎ，全自动酶标仪（波长５７０ ｎｍ）检测各孔的
吸光度，计算细胞生存率。结果应用ＳＰＳＳ１１．５进
行统计学分析。
１．２．５ Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ检测蛋白表达用ＲＩＰＡ裂解液
提取细胞总蛋白，Ｂｉｏｆｒａｄ法蛋白定量，进行Ｗｅｓｔｅｍ．
ｂｌｏｔ分析：取３０ ｇ总蛋白上样，实验结果经天能凝
启动子的质粒载体（ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ－１．Ｏ—Ｕ６）购自美国Ａｍ．
ｂｉｏｎ公司；新生小牛血清、ＩＭＤＭ培养基购自Ｈｙｃｌｏｎｅ
公司；胶回收试剂盒、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶、ＡＰＡ Ｉ、Ｅｃ０Ｒ
Ⅱ和Ｈ ｉｎｄ ｍ限制性内切酶、质粒提取试剂盒、ＲＴ－
ＰＣＲ相关试剂及寡核苷酸合成均购自Ｔａｋａｒａ公司；
ＳＴＡＴ３、ｐＳＴＡＴ３、Ｂｃ１．２、Ｂａｘ、￣－ａｃｔｉｎ抗体，辣根过氧化
物酶（ＨＲＰ）标记二抗均购自Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ公司；脂质体
（１ｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）、 ｚｏｌ试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。
胶成像系统摄像、进行灰度值分析。
１．２．６ ＴＵＮＥＬ法检测细胞凋亡Ｕ２５１细胞接种于
预先放置盖玻片的２４孔板中，按前述方法转染给
１．２方法
１．２．１重组质粒ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０一Ｕ６．ｓｉＲＮＡ—ＳＴＡＴ３构建
及鉴定根据ｇｅｎｅｂａｎｋ（ＮＭ ３１５００）人ＳＴＡＴ３基因ｍＲ．
ＮＡ的已知序列和本实验室前期工作，确定合适的靶
位点（２１４３．２１６２）。寡核苷酸链序列：ＧＣＡＧＣＡＧＣＴ．
ＧＡＡＣＡＡＣＡＴＧ；ｓｉＲＮＡ模板：ｓｅｎｓｅ：５’．ＧＡＴ ＣＣＧ ＣＡＧ
ＣＡＧ ＣＴＧ从Ｃ从Ｃ ＡＴＧ ＴＴ℃ＡＡＧ ＡＧＡ ＣＡＴ ＧＴｒ
ＧＴＩ＂ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＹ ＴＩ］ｒ ＴＧＧ ＡＡＡ．３’；ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：
５’．ＡＧＣ １ｒ］［ＴｒＴＣＣ ＡＡＡ Ａ从ＧＣＡ ＧＣＡ ＧＣＴ ＧＡＡ ＣＡＡ
ＣＡＴ ＧＴＣ ＴＣＴ １１ＧＡ ＡＣＡ ＴＧＴ ＴＧＴ ＴＣＡ ＧＣＴ ＧＣＴ ＧＣＧ－
３’。ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１
．
０．Ｕ６经ＡＰＡ工和ＥｃｏＲ Ｉ限制性内切
酶线性化，在Ｔ４ ＤＮＡ连接酶的作用下与退火后形
成的双链结构连接，形成ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０．Ｕ６．ｓｉＲＮＡ．
ＳＴＡＴ３重组质粒。
１．２．２细胞培养及转染将Ｕ２５１细胞（１×ｌＯ６个）
分别接种于１００ ｍｌ培养瓶中（１０％小牛血清ＩＭＤＭ
培养液，３７ ｏＣ，５％ＣＯ２），培养至８０％一９０％细胞融
合。用无血清培养液洗３遍，将重组质粒ｐＳｉ．
１ｅｎｅｅｒ１．０一Ｕ６一ｓｉＲＮＡ—ＳＴＡＴ３按脂质体（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ
２０００）使用说明操作，培养４ ｈ后（无血清ＩＭＤＭ培养
液，３７℃，５％ＣＯ２），弃上清，加入含１０％小牛血清
培养液及给药后继续培养２４小时，收集细胞备用。
１．２．３实验分组及给药方法实验共分４组，对照
组：转染ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０．Ｕ６质粒；ＳＴＡＴ３一ＳｉＲＮＡ组：转
染ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０．Ｕ６．ｓｉＲＮＡ．ＳＴＡＴ３质粒；Ｈ２Ｏ２组：转
染ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０一Ｕ６质粒４ ｈ后加入Ｈ２０２（终浓度为１
ｍｍｏｌ／Ｌ）给药２４ ｈ；ＳＴＡＴ３．ＳｉＲＮＡ＋Ｈ２０２组：转染
ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０一Ｕ６．ｓｉＲＮＡ．ＳＴＡＴ３质粒４ ｈ后加入Ｈ２０２
（终浓度为１ ｍｍｏｌ／Ｌ）给药２４ ｈ。
１．２．４亚甲基四唑蓝（ＭＩＴ）比色法检测细胞生存
率取对数生长的细胞接种于９６孔培养板，按细胞
数１×１０４／ｗｅｌ１种人细胞，待细胞长满孔底９０％时按
上述方法转染给药，每组设５复孔，实验结束前４ ｈ
加ＭＴＹ（５ ｍ＃ｎ￣）２０ ｂｔｌ／ｗｅｌｌ，３７ ｑＣ孵育４ ｈ后吸出所
有液体加入二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）１５０ ｔ．ｄ／ｗｅｌｌ，室温孵
药。实验结束时用冷ＰＢＳ冲洗３次，冷４％中性多
聚甲醛固定２０ ｍｉｎ，室温干燥过夜。干燥后盖玻片
～
２０℃保存。按ＴＵＮＥＬ使用说明书染色。荧光显
微镜下成像，激发波长为４５０—５００ Ｂｉｎ，检测波长为
５１５—５６５ ｎｍ（绿色荧光）。按说明书设立阴性对照。
计算细胞凋亡率。每组重复３次。
１．２．７统计学处理采用ＳＰＳＳ １１．Ｏ软件分析。计
量资料实验数据以均数±标准差（ｘ±ｓ）表示。单
变量配对资料之间的比较采用配对样本ｔ检验。
２结果
２．１转染重组质粒ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０．Ｕ６．ｓｉＲＮＡ．ＳＴＡＴ３
能够有效抑制ＳＴＡＴ３在Ｕ２５１细胞中的表达
Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ结果显示，与对照组相比，ＳＴＡＴ３．
ＳｉＲＮＡ组Ｕ２５１细胞ＳＴＡＴ３蛋白表达明显下降，对结
果进行灰度分析，蛋白表达降低５３．７ ４－６．２％（Ｐ＜
０．０５，凡＝３）（见图１）。
２．２抑制ＳＴＡＴ３表达对Ｈ２ｏ２作用下Ｕ２５１细胞生
存率的影响
ＭＴＦ结果显示，与对照组相比，Ｈ２Ｏ２组细胞生
存率为５３．８±６．２％（Ｐ＜０．０５，ｎ＝３）；ＳＴＡＴ３一ＳｉＲＮＡ
＋Ｈ，０＇组生存率为３２．３±ｌ１．６％，明显低于对照组
和Ｈ＇０＇组（Ｐ＜０．０５，ｎ：３）（见图２）。
２．３ ＴＵＮＥＬ法检测抑制ＳＴＡＴ３表达对Ｈ２ｏ２作用
下Ｕ２５１细胞凋亡的影响
使用ＴＵＮＥＬ法检测抑制ＳＴＡＴ３表达和Ｈ２０２作
用引起Ｕ２５１细胞发生凋亡的情况。荧光显微镜下
观察，细胞核呈绿色荧光为凋亡阳性细胞。ＴＵＮＥＬ
结果显示：与对照组相比，Ｈ２０２组细胞凋亡率（１７．０
±４．３％）日呵显增力Ⅱ（Ｐ＜０．０５，ｎ＝３）；ＳＴＡＴ３ ＳｉＲＮＡ
＋Ｈ２Ｏ，组细胞凋亡率（２７．８±８．６％）明显高于
Ｈ２０２组（Ｐ＜０．０５，ｎ＝３）。
２．４凋亡相关蛋白ＢＣＬ－２和ＢＡＸ表达变化
Ｗｅｓｔｅｍ—ｂｌｏｔ结果显示，与对照组（１．０±０．０８）相
比，Ｈ’０２组ＢＣＬ－２与ＢＡＸ蛋白表达之比（０．５６ ４－
０．１１）明显降低（Ｐ＜０．０５，凡＝３）；与Ｈ２０２组相比，
中国实验诊断学２０１０年１届 苤 鲞笙 塑
ＳＴＡＴ３．ＳｉＲＮＡ＋Ｈ２０２组ＢＣＬ－２与ＢＡＸ蛋白表达之 图３）。
比（０．３２±０．１４）明显降低（Ｐ＜０．０５，ｎ＝３）（见
彗
至
善 薹
∽ ∞
｛０々 Ｉ ０《 ０ ｌ ０
Ｕ 雹 ４－
Ｓ
９ＳＫＤａ 三 ．
矗
Ｅ二］：Ｂ Ｃ Ｌ－２
＝
０
＊Ｐ＜０．０５ Ｙｓ ｃ￣ｔｍｌ ｇｒｏｕｐ，＃Ｐ＜０．０６ ＶＳ Ｏ２ ｇｒｏｕｐ
图１ ＳＴＡＴ３－ＳｉＲＮＡ重组质粒对Ｕ２５１
细胞￥ＴＡＴ３蛋白表达的影响
图２抑制ＳＴＡＴ３表达对Ｈ２０２作用
下Ｕ２５１细胞生存率的影响
图３抑制ＳＴＡＴ３表达对Ｈ２０２作用下
Ｕ２５１细胞凋亡相关蛋白ＢＣＬ－２
和ＢＡＸ表达的影响
３讨论
降低细胞生存率，增加细胞凋亡，使ＢＣＬ－２和ＢＡＸ
表达比值降低。最近的研究已经证实ＳＴＡＴ３在神
经胶质瘤和神经胶质瘤细胞系都存在异常持续性激
活，在神经胶质瘤的增殖、分化和进展过程中具有重
要的作用 ３。在我们的研究工作中，得到如下结论：
活性氧Ｈ２０ 是体内氧化代谢的中间产物，易通
过细胞膜产生细胞毒性，引起细胞氧化应激损伤和
细胞死亡，常用于复制细胞氧化损伤模型 ｊ。
ＳＴＡＴ３可被多种细胞因子和生长因子激活，在胚胎
发生和早期发育过程中具有不同的功能。在肿瘤发
生过程中，常存在由蛋白酪氨酸激酶（ ｓ）异常激
活导致的ＳＴＡＴ３的异常活化＿６ 。近来研究发现，在
多发性骨髓瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和头颈部
肿瘤中ＳＴＡＴ３持续激活ｌ＿３』。利用反义寡核苷酸抑
制ＳＴＡＴ３表达或ＳＴＡＴ信号转导通道抑制剂，均能
降低细胞生存率，诱导凋亡发生。
ＲＮＡ干扰（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｅｅ，ＲＮＡｉ）是一种转录
后的基因沉默，能够触发某种转录后监控程序，导致
有效抑制ＳＴＡＴ３表达能降低神经胶质瘤细胞生存
率，并增加其对氧化应激损伤的敏感性。
作者简介：苏静（１９７８一），女，在读医学博士，研究方向为肿
瘤病理生理学
参考文献：
［１ｊＭａｈｅｒ ＥＡ，Ｆｕｍａｒｉ ＦＢ，Ｂａｃｈｏｏ ＲＭ，ｅｔ ａ１．Ｍａｌｉｇｎａｎｔ￣ｉｏｍａ：ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ
ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａ ｅ ｍａｔｔｅｒ［Ｊ］．Ｃ￣ｎｅｓ Ｄｅｖ，２００１，１５：１３１１．
２］ＮｕｆｉａＩ，Ｇｅｎｅｖｉｅｖｅ Ｋ，Ｓｉｄｈａｒｔｈ Ｖ，ｅｔａ１．Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｇｌＥＮ，ｒｅｇｕｌａｔｅｄ
ＳＴＡＴ３ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，２００８，２２：４４９．
３ Ｂｕｅｔｔｎｅｒ Ｒ，Ｍｏｒａ ＬＢ ａＪ１ｄ Ｊｏｖｅ Ｒ．Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＡＴ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｕ．
一一
特定ｍＲＮＡ单链降解，调控特定基因的表达 。我
们利用ＲＮＡｉ技术特异性抑制ＳＴＡＴ３表达，观察其
ｎｌｏｒｓ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｎｍ ｅｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｔｅｎｅｎｔｉｏｎ【Ｊ］．Ｃｌｉｎ
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００，８：９４５．
对氧化应激损伤Ｕ２５１细胞的影响。实验结果显示，
我们设计构建合成的ＤＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０．Ｕ６一ｓｉＲＮＡ．ＳＴＡＴ３
重组质粒体外转染Ｕ２５１细胞，能够有效抑制ＳＴＡＴ３
蛋白表达（抑制率＞５０％）。有效抑制ＳＴＡＴ３表达
４ ＩＡｐｐｍｍ￣Ｚ，Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ Ｒ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎ￣ｅ ｉｎ ｈｅｔｅｒｏｅｌｕｃｏ—
ｍａｔｉｃ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ［Ｊ ．Ｎａｔｕｒｅ，２００４，４３１：３６４．
１．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ—ｉｎ．
５］Ｊａｅｓｃｈｋｅ Ｈ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｊｕｒｙ
１
．
．
ｄｕｅｅｄ ｌｉｖｅｒ（，ｅｌｌ ｉｎｊｕ￣＇ｄｕｒｉｎｇ ｈｅｐａｔｉｃ ｉ￣ｈｅｍｉａ・ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｃｕｔｅ
ｉｎｆｔａｎｓ￣ｔｏｒｖ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｍｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ，
２００６，２９０：１０８３．
能降低Ｕ２５１细胞生存率、增加细胞凋亡率，同时降
低凋亡相关蛋白ＢＣＬ一２和ＢＡＸ表达比值。氧化应
６ 手春光，姚宪亭，张兴义．ＳｉｌＬＮＡ．ＳＴＡＴ３在肿瘤研究中的应用［Ｊ］
中国实验诊断学，２００６，１ｏ（２）：２１０．
激损伤Ｕ２５１细胞模型中，抑制ＳＴＡＴ３表达，进一步
（收稿日期：２００９—０７—１４）