2024年11月2日发(作者：益菱)
靶向沉默p65基因对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖及凋
亡的影响
王玲;单保恩;桑梅香;连易水;王彬;丁春艳
【摘 要】Objective To explore the effect of microRNA (miRNA)-mediated
p65 gene knockdown on the proliferation and apoptosis of human breast
cancer MDA-MB-231 cells. Methods p65-targeted miRNA plasmid was
constructed and transfected into MDA-MB-231 cells via lipofectamineTM
2000. The expression of p65 gene in the transfected cells at the mRNA and
protein levels were detected by RT-PCR and Western blotting, respectively.
The cell proliferation and apoptosis were measured by MTT assay and flow
cytometry (FCM), respectively. The expressions of apoptosis-related
proteins were detected by Western blotting in the transfected cells. Results
Compared with the negative control group, the expressions of p65 mRNA
and protein in p65miRNA-trasnfected cells were significantly down-
regulated (P＜0.05). MTT assay showed significantly lowered viability of
MDA-MB-231 cells after the transfection (P＜0.05). FCM showed an
increased cell apoptosis rate in p65miRNA group compared with that in
the negative control group (P＜ 0.05). Caspase-3 and PARP were both
cleaved into their active forms and the expression of these active forms
was increased in p65miRNA group. Conclusion The miRNA targeting p65
gene can inhibit the proliferation and induce apoptosis of breast cancer
cells, and p65 gene might become a new target in gene therapy for human
breast cancer.%目的 利用miRNA靶向沉默p65基因,观察其对人乳腺癌细胞
MDA-MB-231增殖及凋亡的影响.方法 以脂质体LipofectamineTM2000为载体,
将针对特异靶点p65基因的miRNA转染入MDA-MB-231细胞.RT-PCR和
Western blot法检测p65 mRNA和蛋白表达的变化；MTT法检测细胞增殖；流
式细胞技术(FCM)检测细胞凋亡；Western blot法检测凋亡相关因子表达的变化.
结果 RT-PCR和Western blot检测结果显示,p65miRNA转染组p65 mRNA及
蛋白表达量较对照组显著下降(P＜0.05)；MTT检测结果显示,沉默p65基因后,细
胞出现了生长抑制现象；FCM检测结果发现,p65miRNA转染组细胞凋亡率显著
增加(P＜0.05).Western blot进一步检测发现,转染组细胞中caspase-3的前体蛋
白条带变细,裂解片段条带加深；PARP蛋白出现裂解片段.结论 miRNA靶向沉默
p65基因可抑制人乳腺癌细胞增殖,促进细胞凋亡,推测p65基因可能成为乳腺癌基
因治疗的一个新靶点.
【期刊名称】《南方医科大学学报》
【年(卷),期】2011(031)010
【总页数】6页(P1742-1747)
【关键词】乳腺癌;基因沉默;miRNA;细胞增殖;细胞凋亡;p65
【作 者】王玲;单保恩;桑梅香;连易水;王彬;丁春艳
【作者单位】河北医科大学第四医院肿瘤研究所免疫室,河北石家庄050011;河北
医科大学第四医院肿瘤研究所免疫室,河北石家庄050011;河北医科大学第四医院
肿瘤研究所免疫室,河北石家庄050011;河北医科大学第四医院肿瘤研究所免疫室,
河北石家庄050011;河北医科大学第四医院肿瘤研究所免疫室,河北石家庄
050011;河北医科大学第四医院肿瘤研究所免疫室,河北石家庄050011
【正文语种】中 文
【中图分类】R735.35
乳腺癌是女性常见的一种高度异质性的恶性肿瘤。10年间我国主要城市的乳腺癌
发病率增长了37%。特别是在30～54岁年龄组中，乳腺癌已成为威胁女性健康
的“头号杀手”［1-2］。目前，大量的研究资料显示，NF-κB信号通路的异常活
化与乳腺肿瘤关系十分密切。Biswas等报道，雌激素受体阴性乳腺癌中，NF-κB
活性显著高于雌激素受体阳性乳腺癌，尤其在组织分化差、且伴有淋巴结转移的浸
润性导管癌中NF-κB活性更高［3-4］。因此，有学者推测，NF-κB组成性活化
可能是雌激素受体阴性乳腺癌重要的发病机制之一。MDA-MB-231细胞株是一种
高侵袭性，雌、孕激素受体均为阴性的乳腺癌细胞。我们前期的研究发现，MDA-
MB-231细胞中NF-κB异常激活，并且NF-κB的p65亚基与该细胞的生物学活
性密切相关。因此，本实验重点研究靶向沉默p65基因观察其对细胞增殖及凋亡
的影响。
人乳腺癌MDA-MB-231细胞株购自中国科学院细胞库上海保藏中心。胎牛血清
购自杭州四季青公司。高糖型DMEM培养基购自Gibco公司。胰蛋白酶、四甲
基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、磷酸盐缓冲液（PBS）购自
Sigma公司。TRIzol试剂、脂质体Lipofectam ineTM 2000、Opti-MEM®I无
血清培养基购自美国Invitrogen公司。M-MLV反转录试剂盒购自Fermentas公
司，引物及探针合成由上海生物工程技术服务有限公司提供。核蛋白抽提及定量试
剂盒购自美国Pierce公司。兔抗人p65、GAPDH多克隆抗体，小鼠抗人PARP、
caspase-3单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。ECL化学发光试剂盒购自北京
中杉生物有限公司。
用含10%胎牛血清、青霉素（100 U/m l）、链霉素（100μg/m l）的DMEM完
全培养基，在37℃、5%CO2饱和湿度条件下进行培养。倒置显微镜下观察细胞
生长状态，细胞生长呈70%～80%融合状态时，以0.25%胰蛋白酶消化传代，隔
日换液，每3～4 d传代一次。收集对数生长期细胞进行实验。
根据人p65基因序列[NM_021975]转录RNA的作用位置，设计3对长度为21nt
的序列（表1），设计时已经经BLAST进行同源性比较分析，所设计的靶mRNA
与人类细胞内任何基因没有同源性。在连接酶作用下与线性表达质粒pcDNATM
6.2-GW/EmGFP-miR合成环形的重组质粒。构建了3个针对靶位点的质粒表达
载体，即pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-m iR-p65-1（简称为p65m iRNA-1）、
pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-m iR-p65-2（简称为p65m iRNA-2）、
pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-m iR-p65-3（简称为p65m iRNA-3）和阴性对照
载体pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-m iR-Negtive（简称为Negm iRNA）。
转染前将MDA-MB-231细胞以2×105个/孔的密度接种于24孔板，置于37℃、
5%CO2的培养箱中培养24 h，然后吸尽上清液，用Opti-MEM®I无血清培养基
将24孔板中的细胞漂洗2次。实验组加入lm l转染混合液(含2μg待转质粒和
1μl Lipofectam ineTM 2000)，培养12 h后，用含有10%胎牛血清的DMEM
培养液洗细胞3遍，加1m l完全DMEM培养液（含10%小牛血清、双抗生素）
继续培养。
于实验转染不同时间后，用TRIzol试剂提取各组细胞总RNA。分光光度计检测
RNA浓度及纯度，各取1μg RNA逆转录为cDNA，取2μl cDNA以p65和β-
actin的引物（表2），进行PCR扩增。PCR反应体系为25μl。p65反应条件：
94℃预变性2m in，95℃变性1m in，55℃退火50 s，72℃延伸1m in，30个
循环。72℃5min，4℃终止。β-actin反应条件：94℃预变性5m in，94℃变性
50 s，60℃退火50 s，72℃延伸40 s，35个循环。72℃5 m in，4℃终止。最后
取扩增产物10μl在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，产物条带用凝胶成像系统照相并进
行灰度分析。目的片段的相对表达量计算公式为：目的基因的灰度值/β-actin的
灰度值。
收集转染前后MDA-MB-231细胞，PBS缓冲液洗涤细胞3次，每次1000 r/m
in、5m in，弃上清，加入全细胞裂解液200m l，放置冰上1 h。4℃，12 000
r/m in离心15 min，把上清移入新的EP管中，即为细胞总蛋白，-80℃保存备用。
按照试剂盒的操作步骤进行蛋白定量。取30μg蛋白进行10%SDS-聚丙烯酰胺凝
胶电泳，依示目的蛋白相对分子质量的Marker蛋白分离条带，切下电泳后含目的
蛋白的胶。电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，于室温封闭2 h。将封闭后
的PVDF膜置入TTBS适当稀释的一抗（p65、caspase-3、PARP、GAPDH）溶
液中，4℃缓慢摇动过夜。室温洗膜，将PVDF膜置入适量以TTBS 1∶10000稀
释的辣根过氧化物酶标记的二抗（羊抗鼠、羊抗兔）溶液中，于室温反应2 h。
ECL化学发光后，在暗室内将X光片置于保鲜膜上，曝光。冲洗X光片，拍照扫
描。采用成像分析软件对Western blot显色区带的信号强度进行相对定量分析，
扫描灰度值用积分光密度值表示。
转染p65m iRNA质粒后的MDA-MB-231细胞，用DMEM完全培养基制成单细
胞悬液，接种于96孔培养板。置37℃、5%CO2培养箱及饱和湿度条件下培养
24、48和72 h，同时设空载体对照组和仅加PBS的阴性对照组，每一组设6个
复孔。具体操作方法同第一部分。实验终止前4 h各孔加入MTT（5mg/m l）
20μl，继续培养4 h，弃去培养上清，每孔加入DMSO 150μl，待结晶溶解后酶
标仪上检测570 nm波长下的吸光度值，计算细胞存活率，细胞存活率（%）=实
验组吸光度值/对照组吸光度值×100%。以上实验至少重复3次。
取转染p65m iRNA后的MDA-MB-231细胞，置37℃、5%CO2培养箱及饱和
湿度条件下培养24、48和72 h后，收集细胞，用PBS缓冲液洗涤并重新悬浮细
胞于70%乙醇中，4℃固定2 h，RNA酶37℃处理1 h，与PI（propidium
iodide,PI）室温反应10 m in，FCM应用Singlehistogram statistic分析软件测
定细胞凋亡率。
实验数据用均数±标准差表示，采用SPSS13.0统计分析软件进行组间及组内方差
分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。
重组质粒p65miRNA-1、p65miRNA-2、p65miRNA-3及阴性对照Neg-m
iRNA转染MDA-MB-231细胞24、48、72 h后发现：转染p65m iRNA-1和
p65miRNA-2组可以使MDA-MB-231细胞p65mRNA的表达下调，而转染
p65m iRNA-3和Neg-m iRNA对细胞p65 mRNA的表达影响不明显。统计结
果显示，转染p65miRNA质粒24 h时p65mRNA表达量已经开始下降，48、
72 h时p65mRNA表达量显著下降，尤其72 h检测到p65mRNA的表达水平最
低，与阴性对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05,图1）。
转染p65m iRNA质粒72 h后收集细胞，提取细胞的总蛋白质，发现与阴性对照
组相比，转染p65m iRNA-1，p65miRNA-2细胞p65蛋白表达水平显著降低，
差异有显著性（P＜0.05,图2），转染组细胞p65蛋白水平的抑制率约为70%。
转染p65m iRNA 24、48及72 h后，经MTT检测结果显示，未转染组
（Mock）、转染空载体对照组细胞体外增殖活性在不同时间段内无明显变化（P
＞0.05）；而转染p65miRNA-1和p65m iRNA-2组细胞则出现了细胞生长抑制
现象，与对照组相比，差异显著（P＜0.05，图3）。
经FCM检测结果发现，MDA-MB-231细胞转染p65miRNA-1、p65m iRNA-2
质粒48、72 h后，G0/G1峰前面出现亚二倍体凋亡峰。与Mock组、阴性对照
组比较差异具有统计学意义（P＜0.05，图4）。而转染空载体组和转染
p65miRNA的24 h时细胞未见或仅见微小的亚二倍体峰。
沉默p65基因的表达可以促进MDA-MB-231细胞的凋亡，为了进一步验证抑制
p65基因表达对细胞凋亡相关信号通路的影响，本实验采用Western blot法检测
了与细胞凋亡相关的caspase-3、PARP分子表达变化。结果显示，转染p65m
iRNA-1、p65m iRNA-2质粒48 h后，细胞中caspase-3前体蛋白条带变细、
裂解片段条带加深。通过光密度扫描半定量测定发现：Mock组、阴性对照组细胞
caspase-3前体蛋白相对含量分别是0.436± 0.072、0.381±0.0061，p65m
iRNA-1、p65miRNA-2转染组细胞caspase-3前体蛋白相对含量分别是0.169±
0.025、0.218±0.019，与对照组比较差异显著（P＜0.05,图5）。
Western blot结果显示，转染p65m iRNA后，细胞的PARP前提蛋白条带变细，
出现裂解片段。经过光密度扫描半定量测定发现：Mock组、阴性对照组细胞的
PARP前体蛋白相对含量分别是0.409±0.089、0.511± 0.107，p65m iRNA-1、
p65m iRNA-2转染组PARP前体蛋白相对含量分别是0.272±0.065、
0.215±0.059，与对照组比较差异具有统计学意义（P＜0.05,图6）。
我室前期研究发现，celecoxib可以通过抑制NF-kB信号通路诱导MDA-MB-
231细胞的凋亡［5］。作为NF-kB核转录因子的重要组成亚基p65，主要负责
下游靶基因的转录激活［6］。因此，本实验我们以p65基因为靶点，应用m
iRNA干扰技术，构建靶向p65m iRNA的表达载体，探讨从基因水平封闭其功能
后对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和凋亡的影响。我们采用的pcDNATM 6.2-
GW/EmGFP-m iR质粒载体是将含有m iR-155侧翼序列的前体结构插入siRNA
表达载体，从而构建成m iRNA真核表达载体。通过与其目标mRNA分子的3’
端非编码区域互补匹配导致该mRNA分子的降解，当m iRNA与底物mRNA不
完全配对结合，则通过抑制翻译来使基因沉默。该表达载体含有polⅡ启动子，可
高水平构成性表达m iRNA，并且可在大多数哺乳动物细胞株中表达［7-8］。
重组质粒p65m iRNA转染入MDA-MB-231细胞，经RT-PCR检测，24 h时可
见p65mRNA表达量开始下降，72 h几乎检测不到p65mRNA的表达，并且
p65m iRNA可以在蛋白水平有效地抑制p65的表达，而转染空载体组未见此改
变。因此，我们设计合成的靶向p65miRNA达到了预期的目的，不仅下调了
p65mRNA的表达水平，而且还抑制了其蛋白的表达。MTT分析结果发现，转染
p65m iRNA的细胞的生长能力、增殖能力均显著低于阴性对照组细胞，表明
p65m iRNA对MDA-MB-231细胞的生长和增殖有抑制作用。为了研究抑制p65
基因的表达对MDA-MB-231细胞凋亡的影响，本实验采用FCM检测了细胞凋亡
情况，发现沉默p65基因后细胞在短期内的凋亡率有所增加，在72 h时较阴性对
照组约增加了4倍。提示p65基因在该细胞株中可能发挥抗凋亡功能，沉默该基
因后可诱导MDA-MB-231细胞自发凋亡增多。
Caspase-3是细胞凋亡过程中早期关键的执行分子，在细胞凋亡中发挥非常重要
的作用Caspase-3的表达和裂解活化是反映凋亡启动和发生的重要分子标志。正
常情况下胞质内caspase-3以无活性的酶原形式存在，只有当细胞凋亡启动后才
被激活成有活性的caspase-3［9-10］。Caspase-3活化后可以剪切细胞凋亡过
程中的许多关键蛋白，其中多聚ADP-核糖聚合酶-PARP是最早鉴定出的
caspase-3的底物。PARP通过识别结构损伤的DNA片段而被激活，有助于修复
蛋白的结合而进行DNA的损伤修复。Caspase-3可以特异性的切割PARP，从而
阻止其进行DNA的损伤修复［11-12］。我们通过western blot法进一步检测
转染p65m iRNA后细胞caspase-3和PARP的表达发现，caspase-3前体蛋白
表达下降，裂解蛋白表达开始增加。在转染p65miRNA后，PARP蛋白出现了裂
解条带。提示沉默p65基因后可能是通过裂解活化caspase-3和PARP的路径而
实现诱导MDA-MB-231细胞凋亡。
【相关文献】
［1］ Autier P,Hery C,Haukka J,et ed breast cancer and breast cancer mortality
in randomized controlled trials on mammography screening［J］.JClin
Oncol,2009,27(35):5919-23.
［2］M cCracken M,Olsen M,Chen MS Jr,et incidence, mortality,and associated
risk factors among Asian Americans of Chinese,Filipino,Vietnamese,Korean,and Japanese
ethnicities［J］. CA Cancer JClin,2007,57(4):190-205.
［3］ Biswas DK,Dai SC,Cruz A,et nuclear factor kappa B (NF-kappa B):a potential
therapeutic target for estrogen receptor negative breast cancers［J］.Proc NatlAcad SciU
SA,2001,98(18): 10386-91.
［4］ Singh S,ShiQ,Bailey ST,et r factor-kappaB activation: a molecular
therapeutic target for estrogen receptor-negative and epidermal grow th factor receptor
fam ily receptor-positive human breastcancer［J］.MolCancer Ther,2007,6(7):1973-82.
［5］王玲,刘丽宏,单保恩,等.Celecoxib下调NF-kB信号通路促进人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋
亡的体外研究［J］.癌症,2009,28（6）: 569-74.
［6］Basak S,Hoffmann alk via the NF-kappaB signaling system
［J］.CytokineGrow th Factor Rev,2008,19(3-4):187-97.
［7］ Wang QZ,Xu W,Habib N,et ial uses ofmicroRNA in lung cancer
diagnosis,prognosis,and therapy［J］.Curr Cancer Drug Targets,2009,9(4):572-94.
［8］ Rao DD,Senzer N,Cleary MA,et ative assessment of siRNA and shRNA off
target effects:what is slow ing clinical development［J］.Cancer Gene
Ther,2009,16(11):807-9.
［9］Mazumder S,Plesca D,A lmasan e-3 activation is a critical determ inant of
genotoxic stress-induced apoptosis［J］. MethodsMolBiol,2008,414:13-21.
［10］KuribayashiK,Mayes PA,e caspases3 and 7 doing upstream of
themitochondria［J］.Cancer Biol Ther,2006,5 (7):763-5.
［11］Chalmers potential role and application of PARP inhibitors in cancer
treatment［J］.BrMed Bull,2009,89:23-40.
［12］Rodon J,Iniesta MD,Papadopoulos pment of PARP inhibitors in oncology
［J］.ExpertOpin Investig Drugs,2009,18(1): 31-43.
2024年11月2日发(作者：益菱)
靶向沉默p65基因对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖及凋
亡的影响
王玲;单保恩;桑梅香;连易水;王彬;丁春艳
【摘 要】Objective To explore the effect of microRNA (miRNA)-mediated
p65 gene knockdown on the proliferation and apoptosis of human breast
cancer MDA-MB-231 cells. Methods p65-targeted miRNA plasmid was
constructed and transfected into MDA-MB-231 cells via lipofectamineTM
2000. The expression of p65 gene in the transfected cells at the mRNA and
protein levels were detected by RT-PCR and Western blotting, respectively.
The cell proliferation and apoptosis were measured by MTT assay and flow
cytometry (FCM), respectively. The expressions of apoptosis-related
proteins were detected by Western blotting in the transfected cells. Results
Compared with the negative control group, the expressions of p65 mRNA
and protein in p65miRNA-trasnfected cells were significantly down-
regulated (P＜0.05). MTT assay showed significantly lowered viability of
MDA-MB-231 cells after the transfection (P＜0.05). FCM showed an
increased cell apoptosis rate in p65miRNA group compared with that in
the negative control group (P＜ 0.05). Caspase-3 and PARP were both
cleaved into their active forms and the expression of these active forms
was increased in p65miRNA group. Conclusion The miRNA targeting p65
gene can inhibit the proliferation and induce apoptosis of breast cancer
cells, and p65 gene might become a new target in gene therapy for human
breast cancer.%目的 利用miRNA靶向沉默p65基因,观察其对人乳腺癌细胞
MDA-MB-231增殖及凋亡的影响.方法 以脂质体LipofectamineTM2000为载体,
将针对特异靶点p65基因的miRNA转染入MDA-MB-231细胞.RT-PCR和
Western blot法检测p65 mRNA和蛋白表达的变化；MTT法检测细胞增殖；流
式细胞技术(FCM)检测细胞凋亡；Western blot法检测凋亡相关因子表达的变化.
结果 RT-PCR和Western blot检测结果显示,p65miRNA转染组p65 mRNA及
蛋白表达量较对照组显著下降(P＜0.05)；MTT检测结果显示,沉默p65基因后,细
胞出现了生长抑制现象；FCM检测结果发现,p65miRNA转染组细胞凋亡率显著
增加(P＜0.05).Western blot进一步检测发现,转染组细胞中caspase-3的前体蛋
白条带变细,裂解片段条带加深；PARP蛋白出现裂解片段.结论 miRNA靶向沉默
p65基因可抑制人乳腺癌细胞增殖,促进细胞凋亡,推测p65基因可能成为乳腺癌基
因治疗的一个新靶点.
【期刊名称】《南方医科大学学报》
【年(卷),期】2011(031)010
【总页数】6页(P1742-1747)
【关键词】乳腺癌;基因沉默;miRNA;细胞增殖;细胞凋亡;p65
【作 者】王玲;单保恩;桑梅香;连易水;王彬;丁春艳
【作者单位】河北医科大学第四医院肿瘤研究所免疫室,河北石家庄050011;河北
医科大学第四医院肿瘤研究所免疫室,河北石家庄050011;河北医科大学第四医院
肿瘤研究所免疫室,河北石家庄050011;河北医科大学第四医院肿瘤研究所免疫室,
河北石家庄050011;河北医科大学第四医院肿瘤研究所免疫室,河北石家庄
050011;河北医科大学第四医院肿瘤研究所免疫室,河北石家庄050011
【正文语种】中 文
【中图分类】R735.35
乳腺癌是女性常见的一种高度异质性的恶性肿瘤。10年间我国主要城市的乳腺癌
发病率增长了37%。特别是在30～54岁年龄组中，乳腺癌已成为威胁女性健康
的“头号杀手”［1-2］。目前，大量的研究资料显示，NF-κB信号通路的异常活
化与乳腺肿瘤关系十分密切。Biswas等报道，雌激素受体阴性乳腺癌中，NF-κB
活性显著高于雌激素受体阳性乳腺癌，尤其在组织分化差、且伴有淋巴结转移的浸
润性导管癌中NF-κB活性更高［3-4］。因此，有学者推测，NF-κB组成性活化
可能是雌激素受体阴性乳腺癌重要的发病机制之一。MDA-MB-231细胞株是一种
高侵袭性，雌、孕激素受体均为阴性的乳腺癌细胞。我们前期的研究发现，MDA-
MB-231细胞中NF-κB异常激活，并且NF-κB的p65亚基与该细胞的生物学活
性密切相关。因此，本实验重点研究靶向沉默p65基因观察其对细胞增殖及凋亡
的影响。
人乳腺癌MDA-MB-231细胞株购自中国科学院细胞库上海保藏中心。胎牛血清
购自杭州四季青公司。高糖型DMEM培养基购自Gibco公司。胰蛋白酶、四甲
基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、磷酸盐缓冲液（PBS）购自
Sigma公司。TRIzol试剂、脂质体Lipofectam ineTM 2000、Opti-MEM®I无
血清培养基购自美国Invitrogen公司。M-MLV反转录试剂盒购自Fermentas公
司，引物及探针合成由上海生物工程技术服务有限公司提供。核蛋白抽提及定量试
剂盒购自美国Pierce公司。兔抗人p65、GAPDH多克隆抗体，小鼠抗人PARP、
caspase-3单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。ECL化学发光试剂盒购自北京
中杉生物有限公司。
用含10%胎牛血清、青霉素（100 U/m l）、链霉素（100μg/m l）的DMEM完
全培养基，在37℃、5%CO2饱和湿度条件下进行培养。倒置显微镜下观察细胞
生长状态，细胞生长呈70%～80%融合状态时，以0.25%胰蛋白酶消化传代，隔
日换液，每3～4 d传代一次。收集对数生长期细胞进行实验。
根据人p65基因序列[NM_021975]转录RNA的作用位置，设计3对长度为21nt
的序列（表1），设计时已经经BLAST进行同源性比较分析，所设计的靶mRNA
与人类细胞内任何基因没有同源性。在连接酶作用下与线性表达质粒pcDNATM
6.2-GW/EmGFP-miR合成环形的重组质粒。构建了3个针对靶位点的质粒表达
载体，即pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-m iR-p65-1（简称为p65m iRNA-1）、
pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-m iR-p65-2（简称为p65m iRNA-2）、
pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-m iR-p65-3（简称为p65m iRNA-3）和阴性对照
载体pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-m iR-Negtive（简称为Negm iRNA）。
转染前将MDA-MB-231细胞以2×105个/孔的密度接种于24孔板，置于37℃、
5%CO2的培养箱中培养24 h，然后吸尽上清液，用Opti-MEM®I无血清培养基
将24孔板中的细胞漂洗2次。实验组加入lm l转染混合液(含2μg待转质粒和
1μl Lipofectam ineTM 2000)，培养12 h后，用含有10%胎牛血清的DMEM
培养液洗细胞3遍，加1m l完全DMEM培养液（含10%小牛血清、双抗生素）
继续培养。
于实验转染不同时间后，用TRIzol试剂提取各组细胞总RNA。分光光度计检测
RNA浓度及纯度，各取1μg RNA逆转录为cDNA，取2μl cDNA以p65和β-
actin的引物（表2），进行PCR扩增。PCR反应体系为25μl。p65反应条件：
94℃预变性2m in，95℃变性1m in，55℃退火50 s，72℃延伸1m in，30个
循环。72℃5min，4℃终止。β-actin反应条件：94℃预变性5m in，94℃变性
50 s，60℃退火50 s，72℃延伸40 s，35个循环。72℃5 m in，4℃终止。最后
取扩增产物10μl在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，产物条带用凝胶成像系统照相并进
行灰度分析。目的片段的相对表达量计算公式为：目的基因的灰度值/β-actin的
灰度值。
收集转染前后MDA-MB-231细胞，PBS缓冲液洗涤细胞3次，每次1000 r/m
in、5m in，弃上清，加入全细胞裂解液200m l，放置冰上1 h。4℃，12 000
r/m in离心15 min，把上清移入新的EP管中，即为细胞总蛋白，-80℃保存备用。
按照试剂盒的操作步骤进行蛋白定量。取30μg蛋白进行10%SDS-聚丙烯酰胺凝
胶电泳，依示目的蛋白相对分子质量的Marker蛋白分离条带，切下电泳后含目的
蛋白的胶。电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，于室温封闭2 h。将封闭后
的PVDF膜置入TTBS适当稀释的一抗（p65、caspase-3、PARP、GAPDH）溶
液中，4℃缓慢摇动过夜。室温洗膜，将PVDF膜置入适量以TTBS 1∶10000稀
释的辣根过氧化物酶标记的二抗（羊抗鼠、羊抗兔）溶液中，于室温反应2 h。
ECL化学发光后，在暗室内将X光片置于保鲜膜上，曝光。冲洗X光片，拍照扫
描。采用成像分析软件对Western blot显色区带的信号强度进行相对定量分析，
扫描灰度值用积分光密度值表示。
转染p65m iRNA质粒后的MDA-MB-231细胞，用DMEM完全培养基制成单细
胞悬液，接种于96孔培养板。置37℃、5%CO2培养箱及饱和湿度条件下培养
24、48和72 h，同时设空载体对照组和仅加PBS的阴性对照组，每一组设6个
复孔。具体操作方法同第一部分。实验终止前4 h各孔加入MTT（5mg/m l）
20μl，继续培养4 h，弃去培养上清，每孔加入DMSO 150μl，待结晶溶解后酶
标仪上检测570 nm波长下的吸光度值，计算细胞存活率，细胞存活率（%）=实
验组吸光度值/对照组吸光度值×100%。以上实验至少重复3次。
取转染p65m iRNA后的MDA-MB-231细胞，置37℃、5%CO2培养箱及饱和
湿度条件下培养24、48和72 h后，收集细胞，用PBS缓冲液洗涤并重新悬浮细
胞于70%乙醇中，4℃固定2 h，RNA酶37℃处理1 h，与PI（propidium
iodide,PI）室温反应10 m in，FCM应用Singlehistogram statistic分析软件测
定细胞凋亡率。
实验数据用均数±标准差表示，采用SPSS13.0统计分析软件进行组间及组内方差
分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。
重组质粒p65miRNA-1、p65miRNA-2、p65miRNA-3及阴性对照Neg-m
iRNA转染MDA-MB-231细胞24、48、72 h后发现：转染p65m iRNA-1和
p65miRNA-2组可以使MDA-MB-231细胞p65mRNA的表达下调，而转染
p65m iRNA-3和Neg-m iRNA对细胞p65 mRNA的表达影响不明显。统计结
果显示，转染p65miRNA质粒24 h时p65mRNA表达量已经开始下降，48、
72 h时p65mRNA表达量显著下降，尤其72 h检测到p65mRNA的表达水平最
低，与阴性对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05,图1）。
转染p65m iRNA质粒72 h后收集细胞，提取细胞的总蛋白质，发现与阴性对照
组相比，转染p65m iRNA-1，p65miRNA-2细胞p65蛋白表达水平显著降低，
差异有显著性（P＜0.05,图2），转染组细胞p65蛋白水平的抑制率约为70%。
转染p65m iRNA 24、48及72 h后，经MTT检测结果显示，未转染组
（Mock）、转染空载体对照组细胞体外增殖活性在不同时间段内无明显变化（P
＞0.05）；而转染p65miRNA-1和p65m iRNA-2组细胞则出现了细胞生长抑制
现象，与对照组相比，差异显著（P＜0.05，图3）。
经FCM检测结果发现，MDA-MB-231细胞转染p65miRNA-1、p65m iRNA-2
质粒48、72 h后，G0/G1峰前面出现亚二倍体凋亡峰。与Mock组、阴性对照
组比较差异具有统计学意义（P＜0.05，图4）。而转染空载体组和转染
p65miRNA的24 h时细胞未见或仅见微小的亚二倍体峰。
沉默p65基因的表达可以促进MDA-MB-231细胞的凋亡，为了进一步验证抑制
p65基因表达对细胞凋亡相关信号通路的影响，本实验采用Western blot法检测
了与细胞凋亡相关的caspase-3、PARP分子表达变化。结果显示，转染p65m
iRNA-1、p65m iRNA-2质粒48 h后，细胞中caspase-3前体蛋白条带变细、
裂解片段条带加深。通过光密度扫描半定量测定发现：Mock组、阴性对照组细胞
caspase-3前体蛋白相对含量分别是0.436± 0.072、0.381±0.0061，p65m
iRNA-1、p65miRNA-2转染组细胞caspase-3前体蛋白相对含量分别是0.169±
0.025、0.218±0.019，与对照组比较差异显著（P＜0.05,图5）。
Western blot结果显示，转染p65m iRNA后，细胞的PARP前提蛋白条带变细，
出现裂解片段。经过光密度扫描半定量测定发现：Mock组、阴性对照组细胞的
PARP前体蛋白相对含量分别是0.409±0.089、0.511± 0.107，p65m iRNA-1、
p65m iRNA-2转染组PARP前体蛋白相对含量分别是0.272±0.065、
0.215±0.059，与对照组比较差异具有统计学意义（P＜0.05,图6）。
我室前期研究发现，celecoxib可以通过抑制NF-kB信号通路诱导MDA-MB-
231细胞的凋亡［5］。作为NF-kB核转录因子的重要组成亚基p65，主要负责
下游靶基因的转录激活［6］。因此，本实验我们以p65基因为靶点，应用m
iRNA干扰技术，构建靶向p65m iRNA的表达载体，探讨从基因水平封闭其功能
后对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和凋亡的影响。我们采用的pcDNATM 6.2-
GW/EmGFP-m iR质粒载体是将含有m iR-155侧翼序列的前体结构插入siRNA
表达载体，从而构建成m iRNA真核表达载体。通过与其目标mRNA分子的3’
端非编码区域互补匹配导致该mRNA分子的降解，当m iRNA与底物mRNA不
完全配对结合，则通过抑制翻译来使基因沉默。该表达载体含有polⅡ启动子，可
高水平构成性表达m iRNA，并且可在大多数哺乳动物细胞株中表达［7-8］。
重组质粒p65m iRNA转染入MDA-MB-231细胞，经RT-PCR检测，24 h时可
见p65mRNA表达量开始下降，72 h几乎检测不到p65mRNA的表达，并且
p65m iRNA可以在蛋白水平有效地抑制p65的表达，而转染空载体组未见此改
变。因此，我们设计合成的靶向p65miRNA达到了预期的目的，不仅下调了
p65mRNA的表达水平，而且还抑制了其蛋白的表达。MTT分析结果发现，转染
p65m iRNA的细胞的生长能力、增殖能力均显著低于阴性对照组细胞，表明
p65m iRNA对MDA-MB-231细胞的生长和增殖有抑制作用。为了研究抑制p65
基因的表达对MDA-MB-231细胞凋亡的影响，本实验采用FCM检测了细胞凋亡
情况，发现沉默p65基因后细胞在短期内的凋亡率有所增加，在72 h时较阴性对
照组约增加了4倍。提示p65基因在该细胞株中可能发挥抗凋亡功能，沉默该基
因后可诱导MDA-MB-231细胞自发凋亡增多。
Caspase-3是细胞凋亡过程中早期关键的执行分子，在细胞凋亡中发挥非常重要
的作用Caspase-3的表达和裂解活化是反映凋亡启动和发生的重要分子标志。正
常情况下胞质内caspase-3以无活性的酶原形式存在，只有当细胞凋亡启动后才
被激活成有活性的caspase-3［9-10］。Caspase-3活化后可以剪切细胞凋亡过
程中的许多关键蛋白，其中多聚ADP-核糖聚合酶-PARP是最早鉴定出的
caspase-3的底物。PARP通过识别结构损伤的DNA片段而被激活，有助于修复
蛋白的结合而进行DNA的损伤修复。Caspase-3可以特异性的切割PARP，从而
阻止其进行DNA的损伤修复［11-12］。我们通过western blot法进一步检测
转染p65m iRNA后细胞caspase-3和PARP的表达发现，caspase-3前体蛋白
表达下降，裂解蛋白表达开始增加。在转染p65miRNA后，PARP蛋白出现了裂
解条带。提示沉默p65基因后可能是通过裂解活化caspase-3和PARP的路径而
实现诱导MDA-MB-231细胞凋亡。
【相关文献】
［1］ Autier P,Hery C,Haukka J,et ed breast cancer and breast cancer mortality
in randomized controlled trials on mammography screening［J］.JClin
Oncol,2009,27(35):5919-23.
［2］M cCracken M,Olsen M,Chen MS Jr,et incidence, mortality,and associated
risk factors among Asian Americans of Chinese,Filipino,Vietnamese,Korean,and Japanese
ethnicities［J］. CA Cancer JClin,2007,57(4):190-205.
［3］ Biswas DK,Dai SC,Cruz A,et nuclear factor kappa B (NF-kappa B):a potential
therapeutic target for estrogen receptor negative breast cancers［J］.Proc NatlAcad SciU
SA,2001,98(18): 10386-91.
［4］ Singh S,ShiQ,Bailey ST,et r factor-kappaB activation: a molecular
therapeutic target for estrogen receptor-negative and epidermal grow th factor receptor
fam ily receptor-positive human breastcancer［J］.MolCancer Ther,2007,6(7):1973-82.
［5］王玲,刘丽宏,单保恩,等.Celecoxib下调NF-kB信号通路促进人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋
亡的体外研究［J］.癌症,2009,28（6）: 569-74.
［6］Basak S,Hoffmann alk via the NF-kappaB signaling system
［J］.CytokineGrow th Factor Rev,2008,19(3-4):187-97.
［7］ Wang QZ,Xu W,Habib N,et ial uses ofmicroRNA in lung cancer
diagnosis,prognosis,and therapy［J］.Curr Cancer Drug Targets,2009,9(4):572-94.
［8］ Rao DD,Senzer N,Cleary MA,et ative assessment of siRNA and shRNA off
target effects:what is slow ing clinical development［J］.Cancer Gene
Ther,2009,16(11):807-9.
［9］Mazumder S,Plesca D,A lmasan e-3 activation is a critical determ inant of
genotoxic stress-induced apoptosis［J］. MethodsMolBiol,2008,414:13-21.
［10］KuribayashiK,Mayes PA,e caspases3 and 7 doing upstream of
themitochondria［J］.Cancer Biol Ther,2006,5 (7):763-5.
［11］Chalmers potential role and application of PARP inhibitors in cancer
treatment［J］.BrMed Bull,2009,89:23-40.
［12］Rodon J,Iniesta MD,Papadopoulos pment of PARP inhibitors in oncology
［J］.ExpertOpin Investig Drugs,2009,18(1): 31-43.