2024年10月29日发(作者：谭从丹)
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１８１６一
Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｄｉａｔｍ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２０１１，Ｖｏｌ １５，Ｎｏ．１１
文章编号：１００７—４２８７（２０１１）１１—１８１６—０３
羟基磷灰石纳米颗粒对骨肉瘤ＭＧ６３
抑制作用的体外实验研究
冯卫 ，付莉 ，李冬松 ，刘建国
（１．吉林大学白求恩第一医院，吉林长春１３００２１；２．吉林大学白求恩第二医院）
摘要：目的探讨羟基磷灰石（Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ，ＨＡＰ）纳米颗粒对骨肉瘤ＭＧ６３的作用及相关机制。方法Ｍ＇ＩＴ法观
察不同浓度ＨＡＰ纳米颗粒对ＭＧ６３的抑制作用，测定ＨＡＰ纳米粒子对ＭＧ６３的时效曲线，、ｒ啶橙／溴化已啶细胞荧光
染色及流式细胞术检测ＨＡＰ纳米颗粒对ＭＧ６３细胞凋亡的影响。结果１Ⅵｒｒｒ法检测发现ＨＡＰ纳米颗粒浓度在１０—
４００ ｍｇ／Ｌ范围内，随着浓度的增高ＨＡＰ纳米颗粒对ＭＧ６３的抑制作用在７２ ｈ内逐渐增强，以后逐渐达到平台期。形
态学观察和流式细胞术检测可见ＨＡＰ纳米粒子有诱导细胞凋亡的趋势，实验组和对照组的细胞凋亡率（％）分别为
１９．０３±５．８０和１２．３２±３．８４，两组间差别显著（Ｐ＜０．０５）；实验组Ｇ０／Ｇ１期细胞明显多于对照组，而ｓ期细胞明显少于
对照组，两组间差别显著（Ｐ＜０．０５）。结论ＨＡＰ纳米颗粒可以诱导肿瘤细胞凋亡，对骨肉瘤ＭＧ６３有明显的抑制作
用。
关键词：羟基磷灰石；纳米颗粒；骨肉瘤
中图分类号：Ｒ７３８．１ 文献标识码：Ａ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｏｎ Ｏｓｔｅｏｓａｒｅｏｍａ ＭＧ６３ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＦＥＮＧ Ｗｅｉ，
刚丘，１１ Ｄｏｎｇ－ｓｏｎｇ，ｅｔ ａ１．（Ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆＪｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３（１０２１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（ＨＡＰ）ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｒｎａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＭＧ６３，ａｎｄ
ｈｔｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｍｅｃｌｍｎｉｓｍ ｗａｓ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ ｉｎｉｔｉａｌｌｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｎ ＨＡＰ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｏｎ ＭＧ６３ ｗａｓ ｏｂ—
ｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ＭＴＦ ａｓｓａｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｔｉｍｅ—ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｕｒｖｅ ａｎｄ ｄｏｓｅ—ｅｆｆｅｃｔ ｃｕｒｖｅ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ．Ｔｈｅ ａｐｅｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ＭＧ５３ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ｔｈｅ
ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｙｅｄ ｗｉｈｔ Ａｃｒｉｄｉｎｅ ｏｒａｎｇｅ ａｎｄ Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ．ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｗａｓ ａｌｓｏ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ＭＧ６３ Ｗａｓ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｗｉｈｔ ｔｈｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｎ ｏｆ ＨＡＰ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ７２ ｈｏｕｒｓ．Ｔｈｅ ｍｏｒ—
ｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｄｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＨＡＰ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｃｏｕｌｄ ｉｎｄｕｃｅ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ＭＧ６３ ｃｅｌ１．Ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｒａｔｅ ｏｆ ＨＡＰ
ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ Ｗａｓ １９．０３－１－５．８０ ａｎｄ １２．３２±３．８４．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｗｔｏ
ｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＜０．０５）．Ｉｎ ＨＡＰ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｃｅｎｓ ａｔ Ｇ０／Ｇ１ ｐｈａｓｅ ｗｅｅｒ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｈａｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ａｎｄ ｔｈｅ
ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｃｅＨｓ ａｔ Ｓ ｐｈａｓｅ ｗｅｒｅ ｉｎｆｅｉｒｏｒ ｔｈａｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ＨＡＰ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｃｏｕｌｄ ｉｎｄｕｃｅ ｔｈｅ ａｐｏｐ・
ｔｏｓｉｓ ｏｆｔｈｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｅｅｌｓ，ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆＭＧ６３．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ；ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ
（Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｄ／ａｇｎ，２０１１，１５：１８１６）
纳米羟基磷灰石（Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ，ＨＡＰ）作为一种
１材料与方法
新型生物医用材料，正在成为骨组织工程研究的热
１．１材料 羟基磷灰石纳米粒子由四川大学分析
点，用于骨缺损的治疗研究。研究表明纳米羟基磷 测试中心提供，长径为６０—８０ ｎｍ，直径为ｌ０—２０
灰石可以作为药物载体，先前研究表明纳米羟基磷
ｎｍ。骨肉瘤细胞ＭＧ６３细胞株由四川大学华西移植
灰石对正常细胞没有抑制作用＿１ Ｊ，而体外实验可以
免疫实验室提供。ＲＰＭＩ１６４０培养基（Ｇｉｂｃｏ公司），
抑制胃癌、喉癌肿瘤细胞【２，３Ｊ。但是对骨肉瘤的作
小牛血清（ＨｙＣｌｏｎｅ公司），、ｒ啶橙（ＡＯ）、溴化已啶
用还不十分清楚，本研究的目的是观察纳米羟基磷
（ＥＢ）及胰蛋白酶均购自Ｓｉｇｍａ公司。
灰石粒子对骨肉瘤细胞ＭＧ６３的作用，探讨其抑制
１．２ ＭＧ６３细胞培养ＭＧ ６３细胞培养于含１０％小
肿瘤细胞的作用机理。
牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养液中，３７℃、５％Ｃ０２、饱和
湿度下培养，隔日换液，每４天按１：３比例传代。
基金项目：吉林省科技厅科研课题（项目编号：２００７０５１１５）；高校博士
１．３ ＭＴＴ法检测不同浓度ＨＡＰ纳米粒子对ＭＧ
点专项基金（项目编号：２００８０１８３１１０９）
６３生长的抑制率 分别将ＨＡＰ纳米粒子用培养液
＊通讯作者
中国实验诊断学２０１１年１１月第１５卷第ｌ】期
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１８ｌ７一
配制成ｌ０、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ｒａｇ／
ｌ２．５０ ｍｇ／Ｌ、３９．１０ ｍｇ／Ｌ和８６．３ｌ ｒＩ１ｇ／Ｌ。
Ｌ ｌＯ种浓度。将ＭＧ６３细胞按１ Ｘ］ｏ３／￣Ｌ接种于９６
表１不同浓度ＨＡＰ纳米粒子对ＭＧ６３的
孔板中，每孑Ｌ加入培养基］８ｏｔＡ，于３７ｏＣ、５％Ｃ０２下
抑制作用（ ＝４９２ｎｍ）
培养２４ ｈ后仔细吸出孔内培养液，分别加入上述不
同浓度的ＨＡＰ纳米粒子，对照组加入等量培养液，
每浓度重复４孔。４８ ｈ后进行ＭＴｒ法检测，酶标仪
检测各孔ＯＤ值（ ＝４９２ ｎｍ），记录结果，计算每种
ＨＡＰ浓度对细胞的抑制率。并计算３０％抑制浓度
（３０％Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＩＣ３０） ５０％抑制浓度
（ＩＣ５０）和７０％抑制浓度（ＩＣ７０）。
抑制率＝１００％×（试验组ＯＤ值一对照组ＯＤ值）／
对照组ＯＤ值
１．４ ＩＣ３０、ＩＣ１０、ＩＣｒ０浓度ＨＡＰ对ＭＧ６３生长抑制
作用的时效曲线将ＭＧ ６３细胞接种于９６孔板中，
每孔接种１×ｌｏ３个细胞，２４ ｈ后随机分为ＩＣ３０组、
２．２ ＩＣ３０、ＩＣ５Ｏ、ＩＣ７Ｏ浓度ｌＩＡＰ对Ｍｅ 生长抑制
ＩＣ５０组、ＩＣ７０组和空白对照组，每组２４孔。分别加
作用的时效曲线见图１，这３种浓度ＨＡＰ对ＭＧ６３
入ＩＣ３０、ＩＣ５０、１Ｃ７０ ３种浓度ＨＡＰ，空白对照组加入
的抑制作用均随时间的延长而增加，在３天内抑制
培养液。随后每天每组４孔ＭＧ６３细胞进行ＭＴｒ检
率的增长快，而在３天之后，增加速度明显减慢，表
测，重复６天。按照上述公式计算抑制率，绘制这３
明ＨＡＰ纳米粒子对ＭＧ６３生长抑制作用主要发生在
种浓度ＨＡＰ对ＭＧ６３抑制作用时效曲线。
３天内。
１．５ ＡＩ）／ＥＢ染色观察ＨＡＰ作用后ＭＧ６３细胞形
２．３ ＡＯ／ＥＢ染色观察ＨＡＰ作用后ＭＧ６３细胞形
态学改变接种ＭＧ６３细胞于６孔板中，２４ ｈ后加
态学改变正常对照组的细胞数量较多，生长良好，
入ＩＣ５０浓度的ＨＡＰ，对照组加培养液。４８ ｈ后弃培
而ＨＡＰ作用后的细胞数量减少，凋亡细胞较多，凋
养液，加入含ＡＯ／ＥＢ（浓度为１００ ｍｇ／Ｌ）的培养液，
荧光显微镜观察ＨＡＰ作用后ＭＧ６３细胞的形态。
亡细胞早期表现为细胞核呈浓染的黄绿色荧光或黄
１．６流式细胞术分析收集经ＩＣ ５Ｏ浓度的ＨＡＰ作
绿色碎片，晚期表现为核碎裂呈浓染的红色碎片。
用４８ ｈ的细胞和对照组细胞，每组１Ｏ个标本，用预
—
◆＿１２．５ｍｇ／Ｌ—．卜－３９．１ｍｇ／ｇ
ｌ００
冷的７０％乙醇固定４８ ｈ，离心后弃上清，ＰＢＳ调整细
８Ｏ
胞密度至ｌ×１０９／ｍｌ，ＲＮＡ酶消化，５０ ｍｇ／Ｌ ＰＩ染色，
。 ６０
流式细胞仪检测，Ｍｕｌｔｉｃｙｃｌｅ软件分析各细胞周期比
碍
例，亚二倍体峰Ｇ１法分析细胞凋亡率。
囊４０
１．７统计学分析采用ＳＰＳＳ １０．０统计软件对实验
２０
数据进行统计学处理，进行ｔ检验、方差分析。计量
０
资料采用（ ±ｓ）表示。
０ｄ １ｄ ２ｄ ３ｄ ４ｄ ５ｄ ６ｄ时间
２结果
图１ ＨＡＰ纳米粒子作用于ＭＧ６３的时效曲线
２．１ ＭＩＴ法检测不同浓度Ｉ 纳米粒子对Ｍ
生长的抑制率 浓度在０—４０Ｏ ｍｇ／Ｌ范围内变化
２．４ 流式细胞术分析ＨＡＰ组的细胞凋亡率为
时，ＨＡＰ对ＭＧ６３均有不同程度抑制作用，见表１。
ｌ９．０３±５．８Ｏ，正常对照组为１２．３２±３．８４，两组间差
当ＨＡＰ浓度低于１５０ ｍｇ／Ｌ时，随着药物浓度增大，
异显著（Ｐ＜０．０５）。ＨＡＰ组Ｇ０／Ｇ１期细胞显著增
对细胞抑制率明显增加，ｌ０、２０、５０、１００ ｍｇ／Ｌ这４种
多，Ｓ期细胞显著减少，同正常对照组相比两组间差
浓度的抑制率之间有统计学差异，Ｐ＜０．０５。当
异显著（Ｐ＜０．０５）。
ＨＡＰ浓度大于１５０ ｍｇ／Ｌ后，抑制率不再明显增加，
３讨论
进人平台期，各浓度的抑制率之间无统计学差异，Ｐ
纳米羟基磷灰石（ＨＡＰ）由于颗粒尺寸的细微化
＞０．０５。根据内插法计算ＩＣ３０、ＩＣ５０、ＩＣ７０分别为
使比表面积急剧增加的特点，具备和普通羟基磷灰
一
１８１８一
石粒子不同的理化性能，如溶解度高、表面积大、生
物活性更好等，且近年来的研究发现纳米ＨＡ有抗
肝癌和舌癌等作用ｌ＿４．５ｊ，其抗癌普广、作用温和，还
可以作为药物载体用于疾病治疗，是一种生物相容
性更好的治疗材料。
将ＨＡＰ纳米粒子与ＭＧ６３共培养进行ＭＴＦ细
胞毒性试验，发现ＨＡＰ纳米粒子在不同浓度范围变
化时，对ＭＧ６３有不同程度的抑制作用生长，当浓度
低于１５０ ｍｇ／Ｌ时，随着药物浓度的增大，对细胞的
抑制率明显增大，呈量效依赖关系。在实验最初的
３天内ＨＡＰ对ＭＧ６３的生长抑制率明显增加，３天后
生长抑制率减慢并进入平台期，结果表明ＨＡＰ对
ＭＧ６３的生长抑制敏感期在３天内。实验结果提示
选定ＩＣ５０浓度为３９．１０ ｍｇ／Ｌ的ＨＡＰ纳米粒子进一
步进行实验研究。
目前对ＨＡＰ纳米粒子对肿瘤细胞的抑制作用
机理还不十分清楚，诱导肿瘤细胞凋亡是治疗恶性
肿瘤的一条有效途径。Ｂａｕｅｒ【６ｊ研究发现小于１００
ｎｍ的针状ＨＡＰ纳米粒子具有较低的结晶度和较高
的表面活化能，当ＨＡＰ纳米粒子与癌细胞表面接
触，ＨＡＰ纳米粒子是以能量依靠型网格蛋白介导的
细胞内吞噬作用方式进入细胞体内。Ｃｈｅｎ等＿７ Ｊ认
为由于肿瘤细胞的吞噬能力较强，纳米粒子以非受
体介导的直接吞噬方式进入肿瘤细胞内部，与线粒
体、溶酶体或高尔基体等结合发生化学反应，导致溶
酶体破裂或释放各种酶，启动细胞凋亡。其研究发
现纳米ＨＡＰ可以显著降低肿瘤细胞活性，诱导胃癌
ＳＧＣ．７９０１细胞凋亡，活化Ｃａｓｐａｓｅ一３和Ｃａｓｐａｓｅ一９。同
时研究发现ＨＡＰ纳米粒子的抗癌活性和诱导肿瘤
细胞凋亡能力与粒子的大小密切相关，粒子在２Ｏ一
８０ Ｉｌｌｎ范围内可以有效激活ｃａｓｐａｓｅ．３和Ｃａｓｐａｓｅ．９，
降低Ｂｃｌ一２蛋白水平，同时增加Ｂａｘ蛋白表达和细胞
色素ｃ的释放 ８。本研究所制备的ＨＡＰ纳米粒子
长径约为６０—８０ ＩＩ１＇１１，直径约为１０—２０ ｌｌｌＴＩ，我们推测
ＨＡＰ纳米粒子可能通过肿瘤细胞的直接吞噬作用
后进入细胞内部，与ＤＮＡ结合并诱导肿瘤细胞凋
Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｄｉａｎａ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２０１１，Ｖｏｌ １５，Ｎｏ．１１
亡。
通过荧光显微镜观察发现，经ＨＡＰ作用过的
ＭＧ６３细胞形态学方面出现凋亡特征，细胞核浓缩，
细胞核发生碎裂和浓染，结果提示ＨＡＰ可能损伤
ＤＮＡ，诱导ＭＧ６３细胞的凋亡。本研究通过流式细
胞术定量分析了ＨＡＰ组细胞的凋亡率（１９．０３±５．
８０）％，明显高于对照组。同时本研究发现ＨＡＰ组
的ｓ期细胞明显少于对照组，而Ｇ０／Ｇ１期细胞明显
多于对照组，因此认为ＨＡＰ纳米粒子对肿瘤细胞的
作用可能具有细胞周期特异性，作用于细胞的ｓ期，
损伤ＤＮＡ链、阻止ＤＮＡ的合成、复制，导致ｓ期细
胞凋亡，使细胞不能继续进入Ｇ２期，最终不能完成
细胞分裂和增殖。
综上所述，ＨＡＰ纳米颗粒对ＭＧ６３有明显的抑
制作用，并诱导肿瘤细胞凋亡。
作者简介：冯卫，博士，副教授，吉林大学第一医院骨关节外
科，主要研究方向为骨生物材料及骨肿瘤。
参考文献：
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ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｍａ－
ｔｅｒｉａｌｓ，０２１０，３１（４）：７３０．
（收稿日期：２０１１—０２—２８）
2024年10月29日发(作者：谭从丹)
一
１８１６一
Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｄｉａｔｍ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２０１１，Ｖｏｌ １５，Ｎｏ．１１
文章编号：１００７—４２８７（２０１１）１１—１８１６—０３
羟基磷灰石纳米颗粒对骨肉瘤ＭＧ６３
抑制作用的体外实验研究
冯卫 ，付莉 ，李冬松 ，刘建国
（１．吉林大学白求恩第一医院，吉林长春１３００２１；２．吉林大学白求恩第二医院）
摘要：目的探讨羟基磷灰石（Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ，ＨＡＰ）纳米颗粒对骨肉瘤ＭＧ６３的作用及相关机制。方法Ｍ＇ＩＴ法观
察不同浓度ＨＡＰ纳米颗粒对ＭＧ６３的抑制作用，测定ＨＡＰ纳米粒子对ＭＧ６３的时效曲线，、ｒ啶橙／溴化已啶细胞荧光
染色及流式细胞术检测ＨＡＰ纳米颗粒对ＭＧ６３细胞凋亡的影响。结果１Ⅵｒｒｒ法检测发现ＨＡＰ纳米颗粒浓度在１０—
４００ ｍｇ／Ｌ范围内，随着浓度的增高ＨＡＰ纳米颗粒对ＭＧ６３的抑制作用在７２ ｈ内逐渐增强，以后逐渐达到平台期。形
态学观察和流式细胞术检测可见ＨＡＰ纳米粒子有诱导细胞凋亡的趋势，实验组和对照组的细胞凋亡率（％）分别为
１９．０３±５．８０和１２．３２±３．８４，两组间差别显著（Ｐ＜０．０５）；实验组Ｇ０／Ｇ１期细胞明显多于对照组，而ｓ期细胞明显少于
对照组，两组间差别显著（Ｐ＜０．０５）。结论ＨＡＰ纳米颗粒可以诱导肿瘤细胞凋亡，对骨肉瘤ＭＧ６３有明显的抑制作
用。
关键词：羟基磷灰石；纳米颗粒；骨肉瘤
中图分类号：Ｒ７３８．１ 文献标识码：Ａ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｏｎ Ｏｓｔｅｏｓａｒｅｏｍａ ＭＧ６３ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＦＥＮＧ Ｗｅｉ，
刚丘，１１ Ｄｏｎｇ－ｓｏｎｇ，ｅｔ ａ１．（Ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆＪｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３（１０２１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（ＨＡＰ）ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｒｎａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＭＧ６３，ａｎｄ
ｈｔｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｍｅｃｌｍｎｉｓｍ ｗａｓ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ ｉｎｉｔｉａｌｌｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｎ ＨＡＰ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｏｎ ＭＧ６３ ｗａｓ ｏｂ—
ｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ＭＴＦ ａｓｓａｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｔｉｍｅ—ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｕｒｖｅ ａｎｄ ｄｏｓｅ—ｅｆｆｅｃｔ ｃｕｒｖｅ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ．Ｔｈｅ ａｐｅｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ＭＧ５３ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ｔｈｅ
ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｙｅｄ ｗｉｈｔ Ａｃｒｉｄｉｎｅ ｏｒａｎｇｅ ａｎｄ Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ．ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｗａｓ ａｌｓｏ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ＭＧ６３ Ｗａｓ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｗｉｈｔ ｔｈｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｎ ｏｆ ＨＡＰ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ７２ ｈｏｕｒｓ．Ｔｈｅ ｍｏｒ—
ｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｄｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＨＡＰ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｃｏｕｌｄ ｉｎｄｕｃｅ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ＭＧ６３ ｃｅｌ１．Ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｒａｔｅ ｏｆ ＨＡＰ
ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ Ｗａｓ １９．０３－１－５．８０ ａｎｄ １２．３２±３．８４．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｗｔｏ
ｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＜０．０５）．Ｉｎ ＨＡＰ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｃｅｎｓ ａｔ Ｇ０／Ｇ１ ｐｈａｓｅ ｗｅｅｒ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｈａｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ａｎｄ ｔｈｅ
ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｃｅＨｓ ａｔ Ｓ ｐｈａｓｅ ｗｅｒｅ ｉｎｆｅｉｒｏｒ ｔｈａｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ＨＡＰ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｃｏｕｌｄ ｉｎｄｕｃｅ ｔｈｅ ａｐｏｐ・
ｔｏｓｉｓ ｏｆｔｈｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｅｅｌｓ，ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆＭＧ６３．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ；ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ
（Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｄ／ａｇｎ，２０１１，１５：１８１６）
纳米羟基磷灰石（Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ，ＨＡＰ）作为一种
１材料与方法
新型生物医用材料，正在成为骨组织工程研究的热
１．１材料 羟基磷灰石纳米粒子由四川大学分析
点，用于骨缺损的治疗研究。研究表明纳米羟基磷 测试中心提供，长径为６０—８０ ｎｍ，直径为ｌ０—２０
灰石可以作为药物载体，先前研究表明纳米羟基磷
ｎｍ。骨肉瘤细胞ＭＧ６３细胞株由四川大学华西移植
灰石对正常细胞没有抑制作用＿１ Ｊ，而体外实验可以
免疫实验室提供。ＲＰＭＩ１６４０培养基（Ｇｉｂｃｏ公司），
抑制胃癌、喉癌肿瘤细胞【２，３Ｊ。但是对骨肉瘤的作
小牛血清（ＨｙＣｌｏｎｅ公司），、ｒ啶橙（ＡＯ）、溴化已啶
用还不十分清楚，本研究的目的是观察纳米羟基磷
（ＥＢ）及胰蛋白酶均购自Ｓｉｇｍａ公司。
灰石粒子对骨肉瘤细胞ＭＧ６３的作用，探讨其抑制
１．２ ＭＧ６３细胞培养ＭＧ ６３细胞培养于含１０％小
肿瘤细胞的作用机理。
牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养液中，３７℃、５％Ｃ０２、饱和
湿度下培养，隔日换液，每４天按１：３比例传代。
基金项目：吉林省科技厅科研课题（项目编号：２００７０５１１５）；高校博士
１．３ ＭＴＴ法检测不同浓度ＨＡＰ纳米粒子对ＭＧ
点专项基金（项目编号：２００８０１８３１１０９）
６３生长的抑制率 分别将ＨＡＰ纳米粒子用培养液
＊通讯作者
中国实验诊断学２０１１年１１月第１５卷第ｌ】期
一
１８ｌ７一
配制成ｌ０、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ｒａｇ／
ｌ２．５０ ｍｇ／Ｌ、３９．１０ ｍｇ／Ｌ和８６．３ｌ ｒＩ１ｇ／Ｌ。
Ｌ ｌＯ种浓度。将ＭＧ６３细胞按１ Ｘ］ｏ３／￣Ｌ接种于９６
表１不同浓度ＨＡＰ纳米粒子对ＭＧ６３的
孔板中，每孑Ｌ加入培养基］８ｏｔＡ，于３７ｏＣ、５％Ｃ０２下
抑制作用（ ＝４９２ｎｍ）
培养２４ ｈ后仔细吸出孔内培养液，分别加入上述不
同浓度的ＨＡＰ纳米粒子，对照组加入等量培养液，
每浓度重复４孔。４８ ｈ后进行ＭＴｒ法检测，酶标仪
检测各孔ＯＤ值（ ＝４９２ ｎｍ），记录结果，计算每种
ＨＡＰ浓度对细胞的抑制率。并计算３０％抑制浓度
（３０％Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＩＣ３０） ５０％抑制浓度
（ＩＣ５０）和７０％抑制浓度（ＩＣ７０）。
抑制率＝１００％×（试验组ＯＤ值一对照组ＯＤ值）／
对照组ＯＤ值
１．４ ＩＣ３０、ＩＣ１０、ＩＣｒ０浓度ＨＡＰ对ＭＧ６３生长抑制
作用的时效曲线将ＭＧ ６３细胞接种于９６孔板中，
每孔接种１×ｌｏ３个细胞，２４ ｈ后随机分为ＩＣ３０组、
２．２ ＩＣ３０、ＩＣ５Ｏ、ＩＣ７Ｏ浓度ｌＩＡＰ对Ｍｅ 生长抑制
ＩＣ５０组、ＩＣ７０组和空白对照组，每组２４孔。分别加
作用的时效曲线见图１，这３种浓度ＨＡＰ对ＭＧ６３
入ＩＣ３０、ＩＣ５０、１Ｃ７０ ３种浓度ＨＡＰ，空白对照组加入
的抑制作用均随时间的延长而增加，在３天内抑制
培养液。随后每天每组４孔ＭＧ６３细胞进行ＭＴｒ检
率的增长快，而在３天之后，增加速度明显减慢，表
测，重复６天。按照上述公式计算抑制率，绘制这３
明ＨＡＰ纳米粒子对ＭＧ６３生长抑制作用主要发生在
种浓度ＨＡＰ对ＭＧ６３抑制作用时效曲线。
３天内。
１．５ ＡＩ）／ＥＢ染色观察ＨＡＰ作用后ＭＧ６３细胞形
２．３ ＡＯ／ＥＢ染色观察ＨＡＰ作用后ＭＧ６３细胞形
态学改变接种ＭＧ６３细胞于６孔板中，２４ ｈ后加
态学改变正常对照组的细胞数量较多，生长良好，
入ＩＣ５０浓度的ＨＡＰ，对照组加培养液。４８ ｈ后弃培
而ＨＡＰ作用后的细胞数量减少，凋亡细胞较多，凋
养液，加入含ＡＯ／ＥＢ（浓度为１００ ｍｇ／Ｌ）的培养液，
荧光显微镜观察ＨＡＰ作用后ＭＧ６３细胞的形态。
亡细胞早期表现为细胞核呈浓染的黄绿色荧光或黄
１．６流式细胞术分析收集经ＩＣ ５Ｏ浓度的ＨＡＰ作
绿色碎片，晚期表现为核碎裂呈浓染的红色碎片。
用４８ ｈ的细胞和对照组细胞，每组１Ｏ个标本，用预
—
◆＿１２．５ｍｇ／Ｌ—．卜－３９．１ｍｇ／ｇ
ｌ００
冷的７０％乙醇固定４８ ｈ，离心后弃上清，ＰＢＳ调整细
８Ｏ
胞密度至ｌ×１０９／ｍｌ，ＲＮＡ酶消化，５０ ｍｇ／Ｌ ＰＩ染色，
。 ６０
流式细胞仪检测，Ｍｕｌｔｉｃｙｃｌｅ软件分析各细胞周期比
碍
例，亚二倍体峰Ｇ１法分析细胞凋亡率。
囊４０
１．７统计学分析采用ＳＰＳＳ １０．０统计软件对实验
２０
数据进行统计学处理，进行ｔ检验、方差分析。计量
０
资料采用（ ±ｓ）表示。
０ｄ １ｄ ２ｄ ３ｄ ４ｄ ５ｄ ６ｄ时间
２结果
图１ ＨＡＰ纳米粒子作用于ＭＧ６３的时效曲线
２．１ ＭＩＴ法检测不同浓度Ｉ 纳米粒子对Ｍ
生长的抑制率 浓度在０—４０Ｏ ｍｇ／Ｌ范围内变化
２．４ 流式细胞术分析ＨＡＰ组的细胞凋亡率为
时，ＨＡＰ对ＭＧ６３均有不同程度抑制作用，见表１。
ｌ９．０３±５．８Ｏ，正常对照组为１２．３２±３．８４，两组间差
当ＨＡＰ浓度低于１５０ ｍｇ／Ｌ时，随着药物浓度增大，
异显著（Ｐ＜０．０５）。ＨＡＰ组Ｇ０／Ｇ１期细胞显著增
对细胞抑制率明显增加，ｌ０、２０、５０、１００ ｍｇ／Ｌ这４种
多，Ｓ期细胞显著减少，同正常对照组相比两组间差
浓度的抑制率之间有统计学差异，Ｐ＜０．０５。当
异显著（Ｐ＜０．０５）。
ＨＡＰ浓度大于１５０ ｍｇ／Ｌ后，抑制率不再明显增加，
３讨论
进人平台期，各浓度的抑制率之间无统计学差异，Ｐ
纳米羟基磷灰石（ＨＡＰ）由于颗粒尺寸的细微化
＞０．０５。根据内插法计算ＩＣ３０、ＩＣ５０、ＩＣ７０分别为
使比表面积急剧增加的特点，具备和普通羟基磷灰
一
１８１８一
石粒子不同的理化性能，如溶解度高、表面积大、生
物活性更好等，且近年来的研究发现纳米ＨＡ有抗
肝癌和舌癌等作用ｌ＿４．５ｊ，其抗癌普广、作用温和，还
可以作为药物载体用于疾病治疗，是一种生物相容
性更好的治疗材料。
将ＨＡＰ纳米粒子与ＭＧ６３共培养进行ＭＴＦ细
胞毒性试验，发现ＨＡＰ纳米粒子在不同浓度范围变
化时，对ＭＧ６３有不同程度的抑制作用生长，当浓度
低于１５０ ｍｇ／Ｌ时，随着药物浓度的增大，对细胞的
抑制率明显增大，呈量效依赖关系。在实验最初的
３天内ＨＡＰ对ＭＧ６３的生长抑制率明显增加，３天后
生长抑制率减慢并进入平台期，结果表明ＨＡＰ对
ＭＧ６３的生长抑制敏感期在３天内。实验结果提示
选定ＩＣ５０浓度为３９．１０ ｍｇ／Ｌ的ＨＡＰ纳米粒子进一
步进行实验研究。
目前对ＨＡＰ纳米粒子对肿瘤细胞的抑制作用
机理还不十分清楚，诱导肿瘤细胞凋亡是治疗恶性
肿瘤的一条有效途径。Ｂａｕｅｒ【６ｊ研究发现小于１００
ｎｍ的针状ＨＡＰ纳米粒子具有较低的结晶度和较高
的表面活化能，当ＨＡＰ纳米粒子与癌细胞表面接
触，ＨＡＰ纳米粒子是以能量依靠型网格蛋白介导的
细胞内吞噬作用方式进入细胞体内。Ｃｈｅｎ等＿７ Ｊ认
为由于肿瘤细胞的吞噬能力较强，纳米粒子以非受
体介导的直接吞噬方式进入肿瘤细胞内部，与线粒
体、溶酶体或高尔基体等结合发生化学反应，导致溶
酶体破裂或释放各种酶，启动细胞凋亡。其研究发
现纳米ＨＡＰ可以显著降低肿瘤细胞活性，诱导胃癌
ＳＧＣ．７９０１细胞凋亡，活化Ｃａｓｐａｓｅ一３和Ｃａｓｐａｓｅ一９。同
时研究发现ＨＡＰ纳米粒子的抗癌活性和诱导肿瘤
细胞凋亡能力与粒子的大小密切相关，粒子在２Ｏ一
８０ Ｉｌｌｎ范围内可以有效激活ｃａｓｐａｓｅ．３和Ｃａｓｐａｓｅ．９，
降低Ｂｃｌ一２蛋白水平，同时增加Ｂａｘ蛋白表达和细胞
色素ｃ的释放 ８。本研究所制备的ＨＡＰ纳米粒子
长径约为６０—８０ ＩＩ１＇１１，直径约为１０—２０ ｌｌｌＴＩ，我们推测
ＨＡＰ纳米粒子可能通过肿瘤细胞的直接吞噬作用
后进入细胞内部，与ＤＮＡ结合并诱导肿瘤细胞凋
Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｄｉａｎａ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２０１１，Ｖｏｌ １５，Ｎｏ．１１
亡。
通过荧光显微镜观察发现，经ＨＡＰ作用过的
ＭＧ６３细胞形态学方面出现凋亡特征，细胞核浓缩，
细胞核发生碎裂和浓染，结果提示ＨＡＰ可能损伤
ＤＮＡ，诱导ＭＧ６３细胞的凋亡。本研究通过流式细
胞术定量分析了ＨＡＰ组细胞的凋亡率（１９．０３±５．
８０）％，明显高于对照组。同时本研究发现ＨＡＰ组
的ｓ期细胞明显少于对照组，而Ｇ０／Ｇ１期细胞明显
多于对照组，因此认为ＨＡＰ纳米粒子对肿瘤细胞的
作用可能具有细胞周期特异性，作用于细胞的ｓ期，
损伤ＤＮＡ链、阻止ＤＮＡ的合成、复制，导致ｓ期细
胞凋亡，使细胞不能继续进入Ｇ２期，最终不能完成
细胞分裂和增殖。
综上所述，ＨＡＰ纳米颗粒对ＭＧ６３有明显的抑
制作用，并诱导肿瘤细胞凋亡。
作者简介：冯卫，博士，副教授，吉林大学第一医院骨关节外
科，主要研究方向为骨生物材料及骨肿瘤。
参考文献：
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ｂｙ ｎａｎｏｓｃｌａｅ ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃ￣ｃｅｒ ＳＧＣ－７９０１ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．
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［８］Ｙ￣ａｎ Ｙ，Ｌｉｕ Ｃ，Ｑｉａｎ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｓｉｚｅ．ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ
ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｍａ－
ｔｅｒｉａｌｓ，０２１０，３１（４）：７３０．
（收稿日期：２０１１—０２—２８）