2024年6月14日发(作者：庾冰海)
Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd
Tel: 400-968-6088
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NAD-苹果酸脱氢酶（NAD-MDH）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
货号：BC1040
规格：50T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称
提取液
试剂一
试剂二
试剂三
溶液的配制：
1、试剂二：临用前加入360 μL双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存；
2、试剂三：临用前加入327 μL双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存。
产品说明：
MDH（EC 1.1.1.37）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一，
催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物，连接多条
重要的代谢途径。因此，MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬
氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性，MDH分为NAD
-
依赖的MDH和NADP
-
依赖的MDH，
细菌中通常只含有NAD-MDH，在真核细胞中，NAD-MDH分布于细胞质和线粒体中。
NAD-MDH催化NADH还原草酰乙酸生成苹果酸，导致340nm处光吸收下降。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者
增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心弃上清，按照每200万细菌或细胞加入400μL提取液，
超声波破碎细菌或细胞（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次），8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：称取约0.05g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
血清（浆）样本：直接检测。
二、测定步骤
1、紫外分光光度计提前预热30min，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、试剂一37℃预热15min。
3、样本测定：
规格
液体50 mL×1瓶
液体40 mL×1瓶
粉剂×2支
粉剂×2支
保存条件
4℃保存
4℃保存
-20℃保存
-20℃保存
第 1 页，共 3 页
试剂名称（µL）
样本
蒸馏水
试剂一
试剂二
试剂三
测定管
20
-
760
10
10
空白管
-
20
760
10
10
将上述试剂按顺序加入1mL石英比色皿中，充分吸打混匀后立即在340nm波长下记录初始吸光度A1和反应
1min后的吸光度A2，尽量保持反应温度为37℃。计算ΔA=A1-A2。记录ΔA测定、ΔA空白。（空白管测1-2管
即可）
三、NAD-MDH活力单位的计算
1.血清（浆）NAD-MDH活力的计算
单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/mL）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷V样本÷T =6431×(ΔA测定-ΔA空白)
2.组织中NAD-MDH活力的计算
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/mg prot）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(V样本×Cpr)÷T=6431×(ΔA测定-ΔA空白) ÷Cpr
（2）按样本质量计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/g 质量）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(W÷V提取×V样本)÷T=6431×(ΔA测定-ΔA空白)
÷W
3.细菌或培养细胞中NAD-MDH活力的计算
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/mg prot）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(V样本×Cpr)÷T=6431×(ΔA测定-ΔA空白) ÷Cpr
（2）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/10
4
cell）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(500×V样本)÷T=13×(ΔA测定-ΔA空白)
V反总：反应总体积，0.8mL；V样本：加入样本体积，0.02mL；V提取：提取液体积，1mL；ε：NADH摩尔
消光系数，6.22×10
-3
mL/nmol/cm；d：比色皿光径，1cm；T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；500：
细菌或细胞密度，500万/mL；W：样本质量，g。
注意事项：
1、粗酶液的提取必须在0℃- 4℃中操做完成，以防止酶变性失活。
2、实验时，试剂二、试剂三和样本在冰上放置，以免变性和失活。
3、当初始读值小于0.7或者ΔA大于0.5时建议稀释后测量。
4、建议一人加样一人比色。
第 2 页，共 3 页
实验实例：
1、取0.05g大鼠肝脏加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，测得计算ΔA测定管=A1测
定-A2测定=0.917-0.293=0.624，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.789-0.784=0.005，按样本质量计算酶活得：
NAD-MDH（U/g 质量）=6431×(ΔA测定-ΔA空白) ÷W=6431×0.619 ÷0.05=79616 U/g 质量。
2、取0.05g柳树叶加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，测得计算ΔA测定管=A1测定-A2
测定=0.812-0.741=0.071，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.789-0.784=0.005，按样本质量计算酶活：
NAD-MDH（U/g 质量）=6431×(ΔA测定-ΔA空白) ÷W=6431×0.066 ÷0.05=8489 U/g 质量。
3、取20μL小鼠血浆直接按照测定步骤操作，测得计算ΔA测定管=A1测定-A2测定=0.855-0.789=0.066，ΔA空
白管=A1空白-A2空白=0.789-0.784=0.005，按血清/血浆体积计算酶活得：
NAD-MDH（U/mL）=6431×(ΔA测定-ΔA空白)=6431×0.061=392 U/mL。
参考文献：
[1]Yao Y X, Li M, Zhai H, et al. Isolation and characterization of an apple cytosolic malate dehydrogenase gene
reveal its function in malate synthesis[J]. Journal of plant physiology, 2011, 168(5): 474-480.
相关系列产品：
BC0310/BC0315
BC1030/BC1035
BC0630/BC0635
BC1130/BC1135
辅酶Ⅰ NAD（H）含量检测试剂盒
NAD激酶（NADK）活性检测试剂盒
NADH氧化酶（NOX）活性检测试剂盒
NAD-苹果酸酶（NAD-ME）活性检测试剂盒
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货号：BC1040
规格：50T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称
提取液
试剂一
试剂二
试剂三
溶液的配制：
1、试剂二：临用前加入360 μL双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存；
2、试剂三：临用前加入327 μL双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存。
产品说明：
MDH（EC 1.1.1.37）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一，
催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物，连接多条
重要的代谢途径。因此，MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬
氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性，MDH分为NAD
-
依赖的MDH和NADP
-
依赖的MDH，
细菌中通常只含有NAD-MDH，在真核细胞中，NAD-MDH分布于细胞质和线粒体中。
NAD-MDH催化NADH还原草酰乙酸生成苹果酸，导致340nm处光吸收下降。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者
增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心弃上清，按照每200万细菌或细胞加入400μL提取液，
超声波破碎细菌或细胞（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次），8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：称取约0.05g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
血清（浆）样本：直接检测。
二、测定步骤
1、紫外分光光度计提前预热30min，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、试剂一37℃预热15min。
3、样本测定：
规格
液体50 mL×1瓶
液体40 mL×1瓶
粉剂×2支
粉剂×2支
保存条件
4℃保存
4℃保存
-20℃保存
-20℃保存
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试剂名称（µL）
样本
蒸馏水
试剂一
试剂二
试剂三
测定管
20
-
760
10
10
空白管
-
20
760
10
10
将上述试剂按顺序加入1mL石英比色皿中，充分吸打混匀后立即在340nm波长下记录初始吸光度A1和反应
1min后的吸光度A2，尽量保持反应温度为37℃。计算ΔA=A1-A2。记录ΔA测定、ΔA空白。（空白管测1-2管
即可）
三、NAD-MDH活力单位的计算
1.血清（浆）NAD-MDH活力的计算
单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/mL）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷V样本÷T =6431×(ΔA测定-ΔA空白)
2.组织中NAD-MDH活力的计算
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/mg prot）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(V样本×Cpr)÷T=6431×(ΔA测定-ΔA空白) ÷Cpr
（2）按样本质量计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/g 质量）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(W÷V提取×V样本)÷T=6431×(ΔA测定-ΔA空白)
÷W
3.细菌或培养细胞中NAD-MDH活力的计算
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/mg prot）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(V样本×Cpr)÷T=6431×(ΔA测定-ΔA空白) ÷Cpr
（2）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/10
4
cell）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(500×V样本)÷T=13×(ΔA测定-ΔA空白)
V反总：反应总体积，0.8mL；V样本：加入样本体积，0.02mL；V提取：提取液体积，1mL；ε：NADH摩尔
消光系数，6.22×10
-3
mL/nmol/cm；d：比色皿光径，1cm；T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；500：
细菌或细胞密度，500万/mL；W：样本质量，g。
注意事项：
1、粗酶液的提取必须在0℃- 4℃中操做完成，以防止酶变性失活。
2、实验时，试剂二、试剂三和样本在冰上放置，以免变性和失活。
3、当初始读值小于0.7或者ΔA大于0.5时建议稀释后测量。
4、建议一人加样一人比色。
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实验实例：
1、取0.05g大鼠肝脏加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，测得计算ΔA测定管=A1测
定-A2测定=0.917-0.293=0.624，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.789-0.784=0.005，按样本质量计算酶活得：
NAD-MDH（U/g 质量）=6431×(ΔA测定-ΔA空白) ÷W=6431×0.619 ÷0.05=79616 U/g 质量。
2、取0.05g柳树叶加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，测得计算ΔA测定管=A1测定-A2
测定=0.812-0.741=0.071，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.789-0.784=0.005，按样本质量计算酶活：
NAD-MDH（U/g 质量）=6431×(ΔA测定-ΔA空白) ÷W=6431×0.066 ÷0.05=8489 U/g 质量。
3、取20μL小鼠血浆直接按照测定步骤操作，测得计算ΔA测定管=A1测定-A2测定=0.855-0.789=0.066，ΔA空
白管=A1空白-A2空白=0.789-0.784=0.005，按血清/血浆体积计算酶活得：
NAD-MDH（U/mL）=6431×(ΔA测定-ΔA空白)=6431×0.061=392 U/mL。
参考文献：
[1]Yao Y X, Li M, Zhai H, et al. Isolation and characterization of an apple cytosolic malate dehydrogenase gene
reveal its function in malate synthesis[J]. Journal of plant physiology, 2011, 168(5): 474-480.
相关系列产品：
BC0310/BC0315
BC1030/BC1035
BC0630/BC0635
BC1130/BC1135
辅酶Ⅰ NAD（H）含量检测试剂盒
NAD激酶（NADK）活性检测试剂盒
NADH氧化酶（NOX）活性检测试剂盒
NAD-苹果酸酶（NAD-ME）活性检测试剂盒
第 3 页，共 3 页
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