2024年10月26日发(作者：罕琳怡)

应用技术

DOI

:

10.12161/.1005-6521.2021.03.016

食品研究与开发

2021

年

2

月

第

42

卷第

3

期

97^

火麻仁蛋白的提取分离及理化性质研究

徐鹏伟

",

刘家宁",

常森林

",

王晓东

1

，

常坦然

",

于朝晖

3

,

赵庆生

11

■

，

赵兵

1

*

(

1.

中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室

，

北京

100190

；

.

中国科学院大学

，

北京

100049

；

3.

云南汉盟制药股份有限公司，

云南昆明

650000

)

摘

要

：

以脱脂火麻仁粉

(

defattedhempseedmeal

,

HPM

)为原料

，

采用两种方法进行火麻仁蛋白

(

hempseedprotein

isolate

,

HPI

)

的提取分离

，

碱提

/

酸沉法制备得到碱提蛋白

(

hemp

seed

protein

isolate-alkaline

extraction

,

HPI-AE

)

,

盐溶

/

盐析法制备得到盐提蛋白

(

hemp

seed

protein

isolate-salt

extraction

,

HPI-SE

)

O

HPI-SE 的蛋白含量

(

94.8%)

高于

HPI-

AE

的蛋白含量

(

85.9%

:并且

HPI-SE

的外观色泽更加亮白

。

蛋白质凝胶电泳

(

sodium

dodecyl

sulfate

polyacrylamide

gel

electrophoresis

,

SDS-PAGE

)

结果表明

，

两种方法提取的火麻仁蛋白主要成分均为火麻仁球蛋白

，

二者氨基酸组成

相似

，

均含有丰富的精氨酸

。

不同

pH

值条件下

，HPI

的溶解性曲线均呈

U

型

，

但是在相同

pH

值条件下

，

二者的溶解

性存在较大的差异

。

火麻仁蛋白的起泡性和蛋白质的溶解性呈现出正相关

，

当

pH

值远离等电点时

，

同种电荷的静电

斥力提高了蛋白质的溶解性

，

从而改善了蛋白质的起泡性

。荧光光谱显示

，

在不同

pH

值条件下

，

HPI

的蛋白构象不随

pH

值变化发生明显改变

，

但

HPI-SE

的荧光强度高于

HPI-AE

的荧光强度

，

显示

HPI-SE

的蛋白质聚集程度高于

HPI-AE。

关键词

:

火麻

；

火麻仁蛋白

；

提取

；

理化性质

；

功能性

The

Extraction

of

Hemp

Seed

Protein

and

Its

Physicochemical

Properties

XU

Peng-wei

1,2

,

LIU

Jia-ning

1,2

,

CHANG

Sen-lin

1

，

,

WANG

Xiao-dong

1

,

CHANG

Tan-ran

1,2

,

YU

Zhao-hui

3

,

ZHAO

Qing-sheng

1

*

,

ZHAO

Bing

1

*

(

1.

National

Key

Laboratory

of

Biochemical

Engineering

,

Institute

of

Process

Engineering

,

Chinese

Academy

of

Sciences

,

Beijing

100190

,

China

;

2.

University

of

Chinese

Academy

of

Sciences

,

Beijing

100049

,

China

;

3.

Yunnan

Hanmeng

Pharmaceutical

Co.

,

Ltd.

,

Kunming

650000

,

Yunnan

,

China

)

Abstract

:

Hemp

seed

protein

isolate

/

HPI

)

from

defatted

hemp

seed

meal

/

HPM

)

were

prepared

using

the

methods

of

alkaline

extraction/acid

precipitation

(

HPI-AE

)

and

salt

extraction/salt

precipitation

(

HPI-SE

)

.

The

protein

content

of

HPI-SE

(

94.8%

)

was

higher

than

that

of

HPI-AE

(

85.9%

)

.

The

sodium

dodecyl

sulfate

polyacrylamide

gel

electrophoresis

/

SDS

-PAGE

)

indicated

that

the

main

component

of

HPI

was

hemp

seed

globulin

,

both

of

which

had

similar

amino

acid

composition

and

were

rich

in

arginine.

The

solubility

curves

of

HPI

were

U

-shaped

under

different

pH

conditions

,

however

,

there

was

a

difference

in

solubility

of

HPI

under

the

same

pH

condition.

The

foaming

ability

of

HPI

was

positively

related

to

the

solubility

of

the

protein.

When

the

pH

value

was

away

from

the

isoelectric

point

,

the

electrostatic

repulsion

increased

the

solubility

of

the

HPI

,

thereby

the

foaming

ability

of

the

HPI

was

improved.

The

fluorescence

spectrum

indicated

that

the

conformation

of

HPI

did

not

change

significantly

with

the

change

of

pH

,

but

the

fluorescence

intensity

of

HPI-SE

was

higher

than

that

of

HPI-AE

,

showing

that

the

protein

aggregation

degree

of

HPI-SE

was

higher

than

that

of

HPI-AE.

Key

words

:

hemp

;

hemp

seed

protein

;

extraction

;

physicochemical

property

;

functional

property

作者简介:徐鹏伟

（

1994

—

）

,

男

（

汉

）

，

硕士研究生

，

研究方向:化学工程

。

*

通信作者:赵庆生

（

1982

—

）

,

男

，

副研究员

，

博士

，

研究方向:天然产物研究与开发;赵兵

（

1966

—

）

,

男,研究员

，

博士

，

研究方向:天然产物研究与

开发

。

—

98

引文格式

：

2021

年

2

月

第

42

卷第

3

期

食品研究与开发

应用技术

徐鹏伟

，

刘家宁

，

常森林

，

等

.

火麻仁蛋白的提取分离及理化性质研究

［

J

］

.

食品研究与开发

,

2021

,

42(3

)

：

97-104.

XU

Pengwei

,

LIU

Jianing

,

CHANG

Senlin

,

et

al.

The

Extraction

of

Hemp

Seed

Protein

and

Its

Physicochemical

Properties[J].

Food

Research

and

Development

,2021,42(3

)

：

97-104.

大麻/

Cannabis

sativa

L.

)

广泛种植于亚洲

、

欧洲及

南美等地

，

由于大麻中的四氢大麻酚具有致幻成瘾的

特性

，

因此许多国家将其列为毒品而被禁止种植

，

但

是不同大麻品种中的四氢大麻酚

/

tetrahydrocannabi

­

nol,

THC

)

含量差别很大,

THC

含量低于

0.3%

的品种

被列为工业大麻

［

1

］

。

工业大麻

，

又称火麻

，

在我国大量

种植

。火麻的种子仁富含不饱和脂肪酸

、

微量元素和

蛋白质，

是一种营养价值极高的农作物

［

2-5］

。

火麻仁蛋白

(

hemp

seed

protein

isolate

,

HPI

)

因易

于消化而闻名

，

体外模拟人体胃肠道消化表明

，

火麻

仁蛋白易于被胃蛋白酶和胰蛋白酶消化

,

其消化率高

达

88%~91%

［

6

-

8

］

。

火麻仁蛋白由两种蛋白(火麻仁球蛋

白和麻仁白蛋白)组成

［

9

］

，

包含所有人体所需氨基酸

，

且精氨酸含量丰富㈣,研究证明,火麻仁蛋白粉可以改

善运动员的耐力和增强力量

［

11

］

。

火麻仁蛋白不仅营养

价值很高

，

且没有致敏因子

［

7

］

。

火麻仁蛋白作为植物蛋

白的来源,具有很高的开发潜力

［

12

］

。

常见的植物蛋白通常是通过碱提

/

酸沉法制备

》

15

］

。

文献报道，

氯化钠溶液可用于提取分离植物球蛋白吟

17］

,

对于火麻仁蛋白而言

，

球蛋白含量高于

70%

问,是主要

的储藏蛋白

，

与人体免疫功能有关，

因此利用氯化钠

溶液提取分离火麻仁蛋白也是开发利用火麻仁蛋白

的一个重要途径

。

Hadnadev

等

［

呵报道,通过氯化钠溶

液溶解火麻仁蛋白

，

然后通过透析袋脱盐

,

将蛋白质

沉淀下来

,

试验的局限性在于提取量小且试验操作复

杂

，

因此

，

仍需要在此基础上

,

深入研究氯化钠溶液的

提取温度对火麻仁蛋白溶解性的影响

。

本研究旨在确定两种分离方法对于制备得到的

火麻仁蛋白理化性质、

功能特性以及微观结构的影

响

，

从多方面评价分离方法

,

为火麻仁蛋白产业化生

产提供理论依据

。

1

材料与方法

1.1

材料与试剂

火麻仁:云南汉盟制药股份有限公司

。

氢氧化钠

、

盐酸

、

亚硫酸钠:北京化工厂;石油醚

、

三

(羟甲基)氨基甲烷

［

tris

(

hydroxymethyl

/

aminomethane

,

Tris

］

、

甘氨酸

/

glycine

,

Gly

)、乙二胺四乙酸

/

ethylene

diamine

tetraacetic

acid

,

EDTA)

、

尿素

(

urea)

:

国药集团

化学试剂有限公司

;5,5'-

二硫代双

(

2

-

硝基苯甲酸)

［

5,5'

-dithiobis-

(

2-nitrobenzoic

acid

)

,

DTNB

］

,

异硫氰

酸苯酯

、

二硫苏糖醇

(

dithio

threitol,DTT

)

:

阿拉丁试剂

公司;氯化钠、

结晶乙酸钠:天津市福晨化学试剂厂;蛋

白质凝胶电脉

(

sodium

dodecyl

sulfate

polyacylamide

gel

electrophoresis

,

SDS-PAGE

/试剂盒

：

北京索莱宝科技

有限公司

；

以上试剂均为分析纯

。

1.2

仪器与设备

KDN-520

凯氏定氮仪:徐州华纳精密仪器有限公

司

;WF2UV-2802H

分光光度计:上海尤尼柯仪器有限

公司

；

F-4600

荧光分光光度计

：

日立高新技术公司

；

LC-20AT

液相色谱:岛津公司

。

1.3

溶液配制

缓

冲溶液

A

：

0.086

mol/L

Tris

、

0.09

mol/L

Gly

、

0.004

mol/L

EDTA

(

Tris-Gly,pH

8.0

)

、

8

mol/L

尿素

。

缓冲溶液

B

：

0.086

mol/L

Tris

、

0.09

mol/L

Gly

、

0.004

mol/L

EDTA,

8

mol/L

尿素和

0.1

mol/L

Na

2

SO

(

pH

9.5

)

。

2

-

硝基

-5

-

硫代磺基苯甲酸酯

(

2-nitro-5-thiosul-

fobenzoate,NTSB

)

储备溶液

：

将

0.1

g

DTNB

溶解于

10

mL

1

mol/L

Na

2

SO

3

中

，

pH

值调至

7.5

。将氧气连续

引入离心管中

，

水浴条件下维持温度

37

益

，

直到溶液

颜色从红色变为浅黄色为止

，

证明了

NTSB

的生成

。

NTSB

测试溶液:用缓冲溶液

B

25

益

(

100

：

1,

体积

比)稀释

NTSB

储备溶液

,

制备

NTSB

测试溶液

。

1.4

试验方法

1.4.1

脱脂火麻仁粉

(

defatted

hemp

seed

meal,

HPM

)

的制备

通过机械压榨(脱壳)火麻仁以脱除油脂,然后将

脱除油脂的火麻仁粉和正己烷

［

(1

：

20

(

g/mL)］

混合

，

25

益

下充分搅拌脱除剩余油脂

，

得到脱脂火麻仁粉

(

HPM)

。

1.4.2

碱提

/

酸沉法制备火麻仁碱提蛋白

(

hempseed

protein

isolate-alkaline

extraction

,

HPI-AE

/

将

HPM

分散在去离子水

［

料液比

1

:

20

(g/mL)

］

中

,

pH

值调至

9.5,50

益

下充分搅拌

，

离心收集上清液。

将

上清液

pH

值调至

5.0

,

使蛋白质充分沉淀

，

离心获得

应用技术

食品研究与开发

2021

年

2

月

第

42

卷第

3

期

沉淀物

。

将沉淀物分散在去离子水中

，

将

pH

值调至

7.0

,

然后冷冻干燥获得

HPI-AE

。

1.4.3

盐溶

/

盐析法制备火麻仁盐提蛋白

(

hempseed

protein

isolate-salt

extraction

,

HPI-SE

)

将

HPM

分散在

5%

NaCl

溶液

[

料液比

1

:

15

(

g/mL

)

]

中

,

0

益条件下充分搅拌

2h

。

趁热离心获得上清液

。

将上清液在

4

益

下保存

24h

,

然后离心获得沉淀物

。

将

沉淀物分散在去离子水中

，

洗涤后经离心以便脱除氯

化钠

。

然后将沉淀物冷冻干燥获得

HPI-SE

。

1.4.4

理化性质

1.4.4.1

蛋白含量的测定及蛋白回收率计算

采用凯氏定氮法确定样品蛋白含量

。

将蛋白样品

与浓硫酸和催化剂硫酸钾一同置于消化炉加热消化,

使蛋白质分解

，

分解后的氨和硫酸结合生成硫酸铵,

然后碱化蒸馏使氨游离出来

，

用硼酸吸收后再以盐酸

标准溶液滴定

，

根据盐酸的消耗量乘以换算系数

，

换算

成蛋白质含量

。

蛋白含量计算公式如下

。

X=

AVxCxa°

14

xFx

100

M

式中:

X

为蛋白含量,

％

；

AV

为试样消耗盐酸标

准滴定液的体积

,mL

;

C

为盐酸浓度

,

mol/L

;

0.014

为

1.0

mL

盐酸

(

1.0

mol/L

)

标准滴定液相当于氮元素的

质量

,

g;M

为试样质量

,

g;F

为换算系数

，

本研究选择

系数

F=5.9

。

回收率计算公式如下

。

R=

MM™*

血

伊

100

M

HPM

X

x

HPM

式中:

R

为蛋白回收率

,

％

；

M

hpi

为提取分离获得

的

HPI

的质量

,

g

；

X

HH

为

HPI

中蛋白含量

,

％

；

M

hpm

为

用于提取分离蛋白的

HPM

的质量,

g;

X

HfM

为

HPM

中

蛋白含量

，

%

。

1.4.4.2

外观色泽

HPI

的颜色测量通过将蛋白质溶解于

1

mol/L

氢

氧化钠溶液中

，

配制成

20

mg/mL

的蛋白质溶液

，

在

420

、

520

、

620

nm

条件下测吸光值

。经过公式计算确定

了参数

L

*

(

亮度),

a

*

(红

-

绿色)和

b

*

(黄

-

蓝色)的值

。

计算公式如下

。

t

=10

-

a

X

=18.075

4

子

420

皿+

10.276

0

子

520

皿+

67.971

厶子嗣皿

Y

=1.891

5

子

420

皿+

66.510

4

子520

皿+

31.600

厶子嗣皿

Z=85.957

5

子

420^

+5.299

1

子厶叽

99

-

—

L

*

=116x

蓸

蔀

丄

-16

式中

：

为吸光值

；

为透光率;

X

。

为

97.285

；

Y

0

为

100

；

为

116.145

。

1.4.4.3

巯基

(

SH

)

和二硫键

(

S-S)

含量

巯基可分为总巯基

(

SH

t

)

、

游离巯基(

SH

f

)

。

SH

t

的测定方法:将火麻仁蛋白溶解于缓冲溶液

a

中

(

5mg/mL

)

,

充分混合后离心

10min

，

收集上清液

，

梯

度稀释获得不同浓度的火麻仁蛋白溶液

；

将

80

滋

L

Ellman

试剂

(

4

mg/mL

DNTB

)

添加到火麻仁蛋白溶

液

(

2

mL)

中，

充分混合

5

min

后

，

在

412

nm

处测量吸

光度

。

SH

f

的测定方法

：

将火麻仁蛋白溶解到缓冲溶液

B

(

5

mg/mL)

中

,

充分混合

10

min

后离心

,

收集上清液

。

用

NTSB

测试溶液线性稀释火麻仁蛋白溶液以获得不

同浓度的蛋白质溶液

,412

nm

处测量吸光度

。

巯基含量计算公式如下

。

C

SH

=

73

.53xA

412

伊

d

二硫键含量计算公式如下

。

C

S-S

_

=

C

sh

t

2

-

C

sh

f

式中:

C

SH

为

SH

含量

，

滋

mol/g

;

C

S-S

为

S-S

含量

,

滋

mol/g;

；

412

为

412

nm

处的吸光度

;C

为样品浓度

,

mg/mL

；

D

为稀释系数

；

73.53

为

10

6

/(1.36

伊

10

4

)

,

其中

1.36X10

4

为摩尔吸收率

,

10

6

为转化因子

。

1.4.4.4

SDS-PAGE

非还原状态下的蛋白质电泳分离胶浓度为

12%

,

浓缩胶浓度为

5%

。

方法如下,将样品

(

2

mg/mL)

分散

于不含二硫苏糖醇非还原性缓冲液中

,

5

益

条件下加

热

15min

后冷却

，

电泳时蛋白上样

10

滋

L

。

还原状态下的蛋白质电泳分离胶浓度为

15%

,

浓

缩胶浓度为

5%

。

方法如下,将样品

(

2

mg/mL)

分散于

含

DTT

的还原性缓冲液中

,

5

益

条件下加热

15

min

后冷却

，

电泳时蛋白上样

10

滋

L

。

凝胶采用考马斯亮蓝染色

,

最后用脱色液脱色至

背景无色

。

1.4.4.5

氨基酸组成

氨基酸通过柱前衍生

-

高效液相色谱法测定问

。

适

量样品置于密圭寸管中

，

用

16mL6mol/L

盐酸预处理

，

110

益

条件下消化

24

h

,

蛋白质完全水解

，

获得氨基酸

溶液

。

使用异硫氰酸苯酯对氨基酸衍生化

，

液相检测

。

100

2021

年

2

月

第

42

卷第

3

期

食品研究与开发

算公式如下

。

应用技术

酸性条件下水解蛋白质会导致色氨酸被破坏

，

因

此蛋白质需要在碱性条件下水解㈣

。

110

益

下碱性环境

水解

24h

,

获得色氨酸溶液

,

无需柱前衍生

,

直接液相

FC

/%=

V

初

伊

100

V

液

检测。

氨基酸含量计算公式如下

。

式中:

FC

为蛋白质起泡性

,

％

；

V

初

为泡沫的初始

Cl%=

兽

伊

100

M

总

式中

:

C

为氨基酸含量,

％

;M

为单一氨基酸质量

，

体积,

mL;V

液

为溶液体积

,mL

。

泡沫静置

30

min

,记录稳定泡沫体积。泡沫稳定性

计算公式如下

。

mg;M

总

为所有氨基酸质量之和

,

mg

。

FS

/%=

V

稳

伊

100

V

初

1.4.5

火麻仁蛋白功能性

1.4.5.1

溶解性

依据文献

［

21

］

报道

，

不同

pH

值条件下

,

火麻仁蛋

式中:

FS

为泡沫稳定性

,％;

V

稳

为稳定泡沫体积

,

mL

;

V

初

为初始泡沫体积

,mL

。

白的溶解性

(

protein

solubility,PS

)

测定方法如下:将蛋

白样品

(

0.1

g)

溶解在

10

mL

0.1

mol/L

NaOH

溶液中

“

1.4.6

荧光光谱

蛋白质分子中含有的色氨酸

(Trp)

、

酪氨酸

(

Tyr

)

和苯丙氨酸

(

Phe

)

3

种芳香族氨基酸残基

，

在紫外光的

测定的蛋白含量作为样品蛋白的总含量(对照);将

10

mg/mL

火麻仁蛋白样品

pH

值分别调节为

3.0

〜

11.0

,

充分搅拌

1h

,

000

g

条件下离心

30

min

得上清液

。

使

用

Bradford

方法分析上清液中的蛋白含量

。

蛋白质溶

照射下会发射荧光

。

在固定激发波长的照射下

，荧光

光谱利用蛋白质中芳香族氨基酸的荧光波长随外界

环境变化而改变的特点

，

用于研究蛋白质的构象变

化

。

在

0.1

mol/L

磷酸钠缓冲液(

pH7.

4

冲制备蛋白质

储备溶液

(

10mg/

mL)

,

然后将

pH

值调节至

3.0

、

5.0

、

解度计算公式如下

。

PS

/%=

—

上清

伊

100

M

总

式中:

PS

为蛋白质溶解度,

％

;

M

上清

为上清液中蛋

白的质量

,g;M

总

为总的蛋白质质量

,

g

。

7.0

、

9.0

和

11.0

。

用缓冲液将储备溶液稀释至

0.01%,

在

荧光分光光度计上记录荧光光谱

。

激发波长

:275nm

;

发射波长:

290

nm

〜

450

nm

。

1.4.5.2

起泡性

/

泡沫稳定性

火麻仁蛋白在不同

pH

值条件下的起泡性

(

foam­

2

结果和分析

2.1

理化性质

2.1.1

理化参数

ing

capacity

,

FC

)

和泡沫稳定性

(foaming

stability

,

FS

)

测定方法如下

，

将

10

mg/mL

蛋白样品

pH

值分别调为

3.0

〜

11.0

。

高速乳化机快速剪切搅拌

10min

,

使蛋白溶

液充分起泡

，

记录溶液体积和初始泡沫体积

。

FC

计

表

1

理化参数

HPI

的理化参数如表

1

所示

。

从表

1

中可以看出蛋白质是

HPM

的主要成分

；

Table

1

Physicochemical

properties

项目

HPM

HPI-AE

HPI-SE

蛋白含量

/%

69.5±0.25

85.9±0.3

蛋白回收率

/%

—

83.43

59.06

1

：

—

62.5

85.25

a

*

游离巯基(

滋

mol/g

)

总巯基/(

滋

mol/g

)

—

50.77±0.38

59.10±0.35

二硫键

/(

滋

mol/g

—

14.17

—

-0.79

-2.16

—

39.92

—

22.44±0.48

26.49±0.39

94.8±0.2

10.8

16.33

注:一为未检测

。

HPI-SE

的蛋白含量

(

94.8%

)

高于

HPI-AE

的蛋白含

量

(

85.9%)

。

氯化钠溶液常用于提取植物球蛋白

，

并且

质分子携带大量的同种电荷阻碍了蛋白质分子的聚

集沉淀

，

从而提高了蛋白质的溶解性

；

等电点沉淀蛋

白质时

，

蛋白质分子之间静电斥力消失

，

蛋白质分子

聚集沉淀

。

等电点沉淀过程中

，

大部分蛋白沉淀下来

火麻仁蛋白中球蛋白含量较高购

，

通过氯化钠提取火

麻仁蛋白具有广阔前景

;

盐溶

/

盐析过程中

,

溶液温度

的改变对于火麻仁球蛋白的溶解性影响较大

,

其它物

质的溶解性没有明显变化

，

因而盐溶

/

盐析法更利于提

取火麻仁球蛋白

,

因此

HPI-SE

的蛋白含量更高

。

HPI-

的同时

，

也有部分其它物质沉淀下来

，

从而导致

HPI-

AE

中蛋白回收率较高

，

蛋白含量较

HPI-SE

低

。

由表

1

可知

,

HPI-SE

具有高的

L

*

值

、

较低的

a

值

AE

的蛋白回收率为

83.43%

,

高于

HPI-SE

蛋白回收

率

59.06%

。

对于碱提

/

酸沉法而言

，

碱提蛋白时

，

蛋白

和

b

*

值

；

说明了

HPI-SE

的外观色泽比

HPI-AE

的外

观色泽更亮白

。

碱提

/

酸沉法提取火麻仁过程中，

羰基

应用技术

食品研究与开发

2021

年

2

月

第

42

卷第

3

期

101

—

化合物(还原糖类)和氨基化合物(蛋白质/间的美拉

低构象熵

，

从而提高热稳定性

[22]

;

分子间二硫键的形

德反应生成棕色的大分子类物质

，

等电点沉淀过程

中,这些物质也沉淀下来

，

从而导致

HPI-AE

外观呈现

成,会导致蛋白质分子更易聚集沉淀

。

火麻仁蛋白中

游离巯基的含量高于木瓜种子蛋白中游离巯基的含

量

9.73

滋

mol/g

[23]

,

也高于三叶木通蛋白中游离巯基的

浅黄色

。

游离巯基

、

总巯基和二硫键含量测试结果显示

，

含量

10.82

滋

mol/g

[24]

,

因此巯基含量高可能是导致火麻

仁蛋白溶解性差的原因之一

。

HPI-SE

中游离巯基

、

总巯基和二硫键的含量分别为

26.49,59.10,16.33

滋

mol/g

；

含量均略高于

HPI-AE

，

后

者游离巯基

、

总巯基和二硫键的含量分别为

22.44

、

2.1.2

蛋白质电泳

HPM

和

HPI

在非还原状态和还原状态条件下的

蛋白质电泳见图

1

。

50.77

、

14.17

滋

mol/g

。

巯基和二硫键是蛋白质构象中的

重要官能团

，

二硫键可以保持折叠构象的稳定性并降

Marker

非还原状态

HPI-AE

HPI-SE

如图

1

所示

，

非还原状态下

HPM

和

HPI

的主要

还原状态

Marker

HPM

HPI-AE

HPI-SE

HPM

100

kDa

75

kDa

63

kDa

48

kDa

35

kDa

24

5

k

D

a

135

kDa

75

k

D

a

63

kDa

48

kDa

35kDa

25

kDa

20

kDa

17

kDa

25

kDa

20

kDa

17

kDa

11

kDa

11

kDa

图

1

-SE

和

HPM

在非还原状态和还原状态条件下的蛋白质电泳

Fig.1

SDS-PAGE

of

HPI-AE

,

HPI-SE

and

HPM

under

non-reducing

and

reducing

conditions

肽链分子量均为

55

kDa

;

还原状态下

HPM

和

HPI

主

表

2

HPM

和

HPI

的氨基酸组成

Table

2

The

amino

acid

composition

ofHPM

and

HPI

要肽链分子量均为

34

、

19

、

18kDa

。

结果发现

HPM

和

HPI

具有相同的蛋白组成

，

成分均是火麻仁球蛋白

。

本

研究中

，

火麻仁球蛋白由

6

个分子量为

55

kDa

的亚基

氨基酸

天冬氨酸

火麻仁粕

/%

10.52

碱提蛋白

/%

13.35

盐提蛋白

/%

11.23

20.70

4.70

组成

，

每个亚基由一个酸性基团和一个碱性基团通过

谷氨酸

丝氨酸

19.8

17.50

二硫键连接组成

;

还原状态下

，

亚基的二硫键被打开

，

形成一个分子量为

34

kDa

的酸性基团和分子量为

4.73

4.70

3.91

2.81

甘氨酸

组氨酸

精氨酸

4.11

3.07

13.9

3.76c

19

kDa

或

18

kDa

碱性基团。

其中酸性基团由单一肽链

构成，

分子量为

34

kDa;

碱性基团有两种肽链形式

，

分

子量分别为

19

、

18kDa

。

在非还原状态下

，

有少量分子量为

35

、

19

、

18kDa

2.66

13.83

4.39

15.09

4.22

丙氨酸

脯氨酸

4.32

3.91

3.65

3.99

3.69

5.35

3.35

酪氨酸

苏氨酸

*

缬氨酸

*

甲硫氨酸

*

4.11

3.98

5.22

2.62

3.93

3.38

5.32

2.29

4.69

的肽链

，

表明在非还原状态下

，

依然有少量亚基的二

硫键被打开

。

非还原状态下

,HPI

中出现了少量分子量

大于

100

kDa

的条带

，

但未在

HPM

中出现

。

表明了在

2.43

4.56

6.62

异亮氨酸

*

亮氨酸

*

4.4

提取分离蛋白过程

，

由于温度等一些外在因素导致了

6.31

4.46

3.54

1.00

31.53

6.41

4.69

2.64

部分蛋白质变性

,

从而交联形成了聚合物

。

苯丙氨酸

*

赖氨酸

*

4.71

3.36

2.1.3

氨基酸组成

HPM

和

HPI

的氨基酸组成见表

2

。

由表

2

所示

,

HPI

和

HPM

的氨基酸组成相近

,

意

色氨酸

*

EAA

BCAA

1.17

31.89

0.97

30.38

16.42

味着两种分离过程只是富集了火麻仁蛋白质,未引起

15.93

3.93

16.53

4.11

N

5.72

蛋白质组成太大变化

。

和其它植物蛋白相比㈣,火麻仁

蛋白中含有丰富的精氨酸

，

尤其

HPI-SE

精氨酸含量

注

：

为必需氨基酸(

essential

amino

acid,EAA

)

;BCAA

为支链氨基酸

/

branched

chain

amino

acid);N

为精氨酸与赖氨酸比值

。

2021

年

2

月

第

42

卷第

3

期

食品研究与开发

应用技术

102

高达

15.09%

；

已有研究表明

，

饮食中精氨酸

/

赖氨酸的

比值越高

,

降低胆固醇的作用越明显

，

有利于心血管健

康閃,

HPI-SE

的精氨酸

/

赖氨酸的值高达

5.72,

与

HPI-

AE

相比

,

HPI-SE

可能对改善心血管健康有更好的积

极作用

。

支链氨基酸能够直接为肌肉提供能量

，

在运

动过程中被直接消耗供能，

减少肌肉的过度分解，

起

到保护肌肉的作用

［

9

］

,火麻仁蛋白的必需氨基酸

（

EAA

）

含量均高于

30%,

支链氨基酸含量均高于

16%,

以上结果表明

，

火麻仁蛋白是一种优质的植物蛋白

。

2.2

火麻仁蛋白功能性

2.2.1

蛋白质溶解

不同

pH

值条件下

HPI

的溶解性见图

2

。

2n

1

u

•

HPI-AE

0

o

・

9

o

HPI-SE

8

o

7

o

6

o

5

o

4

o

3

o

o

2

o

1

o

o

4

6

8

10

12

pH

值

图

2

不同

pH

值条件下火麻仁蛋白的溶解性

Fig.2

Protein

solubility

of

HPI

at

different

pH

蛋白溶解性是蛋白其它功能特性的基础,影响蛋

白在食品领域的应用

，

因此探究火麻仁蛋白的溶解曲

线是进一步研究蛋白其它功能特性的基础

。

由图

2

可

知

，

在

pH3.0~11.0

的范围内

，

HPI

的溶解性呈现出相

同的趋势

，

均呈

U

型

。

但是

HPI

具有相异的等电点;

HPI-AE

在

pH

6.0

时溶解度最小

，

为

1.34%

；

而

HPI-

SE

在

pH7.0

时溶解度最小，

为

0.65%

。

当

pH

值接近

等电点时,静电斥力的丧失有助于蛋白质聚集体的形

成

，

从而导致火麻仁蛋白的溶解性降低閃;当

pH

值远

离等电点时

，

火麻仁蛋白携带相同电荷

，

由于静电斥

力的作用

，

导致蛋白质聚集程度下降

，

从而蛋白质的

溶解性提高

。

与

HPI-AE

相比

,

HPI-SE

在

pH<5

的条

件下溶解度更高,相反地

，

当

pH>9.0

,,

HPI-AE

的溶

解度略高于

HPI-SE

。

2.2.2

起泡性

/

泡沫稳定性

不同

pH

值条件下

HPI

的起泡能力和泡沫稳定性

见图

3

。

蛋白的起泡性在蛋白质某些产品开发过程中极

为关键

，

例如蛋糕制作过程中

，

蛋白的起泡性能直接

决定产品的成败

，

因而有必要研究火麻仁蛋白的起泡

性

。

比较图

3

和图

2

得知在不同的

pH

值条件下

，

蛋白

图

3

HPI

在不同

pH

值条件下的起泡能力和泡沫稳定性

Fig.3

Foaming

capacity

and

foaming

stability

of

HPI

at

different

质的起泡性/

泡沫稳定性和蛋白质溶解性呈正相关

。

其

中

HPI-AE

和

HPI-SE

均在溶液

pH

1.0

时起泡能力最

强

，

分别为

113.33%

和

103.35%

；

在等电点附近,

HPI

的

起泡能力和稳定均最差

。

当

pH

值远离等电点时

，

蛋白

质的起泡性

/

泡沫稳定性迅速增加

，

说明蛋白良好的溶

解性是获得较好起泡能力和泡沫稳定性的前提

。

蛋白

质的起泡过程意味着蛋白质被吸附在空气

-

水界面

上

，

并通过分子间相互作用重新排列形成弹性薄膜

［

叫

火麻仁蛋白是生物大分子,具有天然的疏水性;溶解

性改善后的火麻仁蛋白亲水性增强;此时蛋白质分子

更易吸附在空气

-

水界面上

，

这有助于泡沫的形成

，

并

使泡沫稳定性增强

。

2.3

荧光光谱

不同

pH

值条件下

HPI

的荧光光谱见图

4

。

溶液的

pH

值决定着

HPI

的溶解性和起泡性

，

但

是在不同

pH

值条件下

，蛋白质的微观结构是否因此

而改变值得探讨

。

在不同

pH

值条件下,荧光光谱通过

探究芳香族氨基酸残基的微观环境是否改变,可以部

分解释溶液

pH

值对于火麻仁蛋白结构的影响

。

由图

4

可知

，

试验过程未观察到

300

nm~310

nm

处的酪氨酸

的发射光谱

,

这可能是由于强烈的蛋白质

-

蛋白质相

互作用导致酪氨酸

-

色氨酸能量转移增加

，

进而导致

酪氨酸的发射光谱被色氨酸的发射光谱覆盖

［

心

。

HPI

的最大发射波长

（

姿

mJ

均小于

335

nm,

这表明在不同

应用技术

食品研究与开发

2021

年

2

月

第

42

卷第

3

期

103

—

pH

值条件下

，

色氨酸残基均位于疏水性较强的内部,

蛋白质保持一个较为致密的结构

。

火麻仁蛋白的最大发

射波长

（姿喚

）

随着溶液酸性

/

碱性增强而略有红移

，

意

味着部分色氨酸残基从疏水性强的内部向亲水性强

的表面转移

，

蛋白质结构逐渐变得松散

，

原因是当

pH

值逐渐远离等电点时，

静电斥力的加强导致蛋白质的

聚集程度降低

，

部分色氨酸暴露在蛋白质分子表面

。

在

pH

值逐渐接近等电点的过程中

，

荧光强度加

强预示着色氨酸

-

色氨酸相互作用加强

，表明了蛋白

5

W

饕

是

发射波长

/nm

图

4

不同

pH

值条件下

HPI-AE

和

HPI-SE

的荧光光谱

Fig.4

Fluorescence

emission

spectrum

of

HPI-AE

and

HPI-SE

at

different

pH

values

质聚集程度加强

;

当

pH

值接近等电点时

，

蛋白质的聚

集程度达到最大

，

火麻仁蛋白的溶解度最低

,

进而导

致荧光强度降低

。

在相同

pH

值条件下

,

HPI-SE

的荧

光强度高于

HPI-AE

的荧光强度

，

说明

HPI-SE

的色

氨酸

-

色氨酸相互作用较

HPI-AE

更强

，

预示着它的蛋

白质聚集程度较大

。

3

结论

两种分离方法对火麻仁蛋白的氨基酸组成影响

2021

年

2

月

第

42

卷第

3

期

食品研究与开发

应用技术

104

较小

，

二者氨基酸组成相似且均含有丰富的精氨酸;

SDS-PAGE

表明二者蛋白质组成均主要为火麻仁球蛋

白

。

碱提

/

酸沉法得到的

HPI-AE

蛋白回收率高

，

但蛋

白含量低,外观呈淡黄色

；

相反

，

盐溶

/

盐析法得到的

HPI-SE

蛋白回收率低，

但蛋白含量高

,

外观呈亮白色

。

因而

HPI-SE

更适合掺入到高蛋白含量的食物中

。

研

究证明蛋白质分离过程会影响火麻仁蛋白的功能性

，

二者虽具有相似的溶解性曲线

，

但是在相同

pH

值条

件下

，

二者的溶解性存在较大的差异

。

试验发现蛋白

质的起泡性

/

泡沫稳定性和蛋白质溶解性呈正相关

，

证

实了良好的溶解性是蛋白质增强起泡性的前提

。

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of

Agricultural

and

Food

Chemistry,2006,54(23):

8945-8950.

[13]

CHEN

Y

X,CHEN

J

C,CHANG

C,et

al.

Physicochemical

and

func­

tional

properties

of

proteins

extracted

from

three

microalgal

species

[J].

Food

Hydrocolloids,2019,96:

510-517.

[14]

ABUGOCH

L

E,

ROMERO

N,

TAPIA

C

A,

et

al.

Study

of

some

physicochemical

and

functional

properties

of

quinoa

(Chenopodium

quinoa

willd)

protein

isolates

[J].

Journal

of

Agricultural

and

Food

Chemistiy,200

&

56(12):

4745-4750.

[15]

DENG

Y

J,

HUANG

L

X,

ZHANG

C

H,

et

al.

Physicochemical

and

functional

properties

of

Chinese

quince

seed

protein

isolate[J].

Food

Chemistiy,2019,283:

539-548.

[16]

Hadnadev

M,Dap5evic-Hadnadev

T,Lazaridou

A,et

al.

Hempseed

meal

protein

isolates

prepared

by

different

isolation

techniques.

Part

I.

physicochemical

properties[J].

Food

Hydrocolloids,2018,79:

526

—

533.

[17]

AJIBOLA

C

F,MAL0M0

S

A,FAGBEMI

T

N,et

al.

Polypeptide

composition

and

functional

properties

ofAfrican

yambeanseed

(

Sphe-

nostylis

stenocarpa)

albumin,

globulin

and

protein

concentrate

[J].

Food

Hydrocolloids

,2016,56:

189-200.

[18]

Jum

—

ji.

Isolation

and

characterization

of

edsion

from

hemp[J].

ap-

,2011,54

⑵

：

84-88.

[19]

BIDLINGMEYER

B

A,C0HEN

S

A,TARVIN

T

L.

Rapid

analysis

of

amino

acids

using

pre-column

derivatization

[J].

Journal

of

Chro­

matography

B:

Biomedical

Sciences

and

Applications,1984,336

(1):

93-104.

[20]

LANDRY

J,DELHAYE

S.

Simplified

procedure

for

the

determina

­

tion

of

tryptophan

of

foods

and

feed

stuffs

from

barytic

hydrolysis[J].

Journal

of

Agricultural

and

Food

Chemistry,

1992,40(5):

776-779.

[21]

DENG

Q

C,WANG

L,WEI

F,et

al.

Functional

properties

of

protein

isolates,

globulin

and

albumin

extracted

from

Ginkgo

biloba

seeds[J].

Food

Chemistry,2011,124

(4):

1458-1465.

[22]

HU

X

Z,

CHENG

Y

Q,

FAN

J

F,

et

al.

Effects

of

drying

method

on

physicochemical

and

functional

properties

of

soy

protein

isolates

[J].

Journal

of

Food

Processing

and

Preservation,2010,34(3):

520

—540.

[23]

MENG

G

T,MA

C

Y.

Characterization

of

globulin

from

Phaseolus an-

gularis

(red

bean)

[J].

International

Journal

of

Food

Science

and

Technology,2002,37(6):

687-695.

[24]

DU

Y

X,YAN

J,ZHU

X

M,et

al.

Physicochemical

and

functional

properties

of

the

protein

isolate

and

major

fractions

prepared

from

Akebia

trifoliata

var.

Australia

seed

[J].

Food

Chemistry,2012,

133

(3)

：

923-929.

[25]

GIROUX

I,

KUROWSKA

E

M,FREEMAN

D

J,et

al.

Addition

of

arginine

but

not

glycine

to

lysine

plus

methionine

—

enriched

diets

modulates

serum

cholesterol

and

liver

phospholipids

in

rabbits

[J].

The

Journal

ofNutrition,1999,129(10):

1807-1813.

[26]

SINGH

N,KAUR

M,SANDHU

K

S.

Physicochemical

and

functional

properties

of

freeze

—

dried

and

oven

dried

corn

gluten

meals

[J].

Drying

Technology,2005

,23(4):

975-988.

[27]

ALUKO

R

E,YADA

R

Y.

Some

physicochemical

and

functional

properties

of

cowpea

(

Vigna

unguiculata

)

isoelectric

protein

isolate

as

a

function

of

pH

and

salt

concentration

[J].

International

Journal

of

Food

Sciences

and

Nutrition,1997,48(1):

31-39.

[28]

LJAROTIMI

0

S,

MALOMO

S

A,

FAGBEMI

T

N,

et

al.

Structural

and

functional

properties

of

Buchholzia

coriacea

seed

flour

and

pro

­

tein

concentrate

at

different

pH

and

protein

concentrations

[J].

Food

Hydrocolloids,2018,74:

275-288.

加工编辑:姚骏

收稿日期

：

2020-03-20

2024年10月26日发(作者：罕琳怡)

应用技术

DOI

:

10.12161/.1005-6521.2021.03.016

食品研究与开发

2021

年

2

月

第

42

卷第

3

期

97^

火麻仁蛋白的提取分离及理化性质研究

徐鹏伟

",

刘家宁",

常森林

",

王晓东

1

，

常坦然

",

于朝晖

3

,

赵庆生

11

■

，

赵兵

1

*

(

1.

中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室

，

北京

100190

；

.

中国科学院大学

，

北京

100049

；

3.

云南汉盟制药股份有限公司，

云南昆明

650000

)

摘

要

：

以脱脂火麻仁粉

(

defattedhempseedmeal

,

HPM

)为原料

，

采用两种方法进行火麻仁蛋白

(

hempseedprotein

isolate

,

HPI

)

的提取分离

，

碱提

/

酸沉法制备得到碱提蛋白

(

hemp

seed

protein

isolate-alkaline

extraction

,

HPI-AE

)

,

盐溶

/

盐析法制备得到盐提蛋白

(

hemp

seed

protein

isolate-salt

extraction

,

HPI-SE

)

O

HPI-SE 的蛋白含量

(

94.8%)

高于

HPI-

AE

的蛋白含量

(

85.9%

:并且

HPI-SE

的外观色泽更加亮白

。

蛋白质凝胶电泳

(

sodium

dodecyl

sulfate

polyacrylamide

gel

electrophoresis

,

SDS-PAGE

)

结果表明

，

两种方法提取的火麻仁蛋白主要成分均为火麻仁球蛋白

，

二者氨基酸组成

相似

，

均含有丰富的精氨酸

。

不同

pH

值条件下

，HPI

的溶解性曲线均呈

U

型

，

但是在相同

pH

值条件下

，

二者的溶解

性存在较大的差异

。

火麻仁蛋白的起泡性和蛋白质的溶解性呈现出正相关

，

当

pH

值远离等电点时

，

同种电荷的静电

斥力提高了蛋白质的溶解性

，

从而改善了蛋白质的起泡性

。荧光光谱显示

，

在不同

pH

值条件下

，

HPI

的蛋白构象不随

pH

值变化发生明显改变

，

但

HPI-SE

的荧光强度高于

HPI-AE

的荧光强度

，

显示

HPI-SE

的蛋白质聚集程度高于

HPI-AE。

关键词

:

火麻

；

火麻仁蛋白

；

提取

；

理化性质

；

功能性

The

Extraction

of

Hemp

Seed

Protein

and

Its

Physicochemical

Properties

XU

Peng-wei

1,2

,

LIU

Jia-ning

1,2

,

CHANG

Sen-lin

1

，

,

WANG

Xiao-dong

1

,

CHANG

Tan-ran

1,2

,

YU

Zhao-hui

3

,

ZHAO

Qing-sheng

1

*

,

ZHAO

Bing

1

*

(

1.

National

Key

Laboratory

of

Biochemical

Engineering

,

Institute

of

Process

Engineering

,

Chinese

Academy

of

Sciences

,

Beijing

100190

,

China

;

2.

University

of

Chinese

Academy

of

Sciences

,

Beijing

100049

,

China

;

3.

Yunnan

Hanmeng

Pharmaceutical

Co.

,

Ltd.

,

Kunming

650000

,

Yunnan

,

China

)

Abstract

:

Hemp

seed

protein

isolate

/

HPI

)

from

defatted

hemp

seed

meal

/

HPM

)

were

prepared

using

the

methods

of

alkaline

extraction/acid

precipitation

(

HPI-AE

)

and

salt

extraction/salt

precipitation

(

HPI-SE

)

.

The

protein

content

of

HPI-SE

(

94.8%

)

was

higher

than

that

of

HPI-AE

(

85.9%

)

.

The

sodium

dodecyl

sulfate

polyacrylamide

gel

electrophoresis

/

SDS

-PAGE

)

indicated

that

the

main

component

of

HPI

was

hemp

seed

globulin

,

both

of

which

had

similar

amino

acid

composition

and

were

rich

in

arginine.

The

solubility

curves

of

HPI

were

U

-shaped

under

different

pH

conditions

,

however

,

there

was

a

difference

in

solubility

of

HPI

under

the

same

pH

condition.

The

foaming

ability

of

HPI

was

positively

related

to

the

solubility

of

the

protein.

When

the

pH

value

was

away

from

the

isoelectric

point

,

the

electrostatic

repulsion

increased

the

solubility

of

the

HPI

,

thereby

the

foaming

ability

of

the

HPI

was

improved.

The

fluorescence

spectrum

indicated

that

the

conformation

of

HPI

did

not

change

significantly

with

the

change

of

pH

,

but

the

fluorescence

intensity

of

HPI-SE

was

higher

than

that

of

HPI-AE

,

showing

that

the

protein

aggregation

degree

of

HPI-SE

was

higher

than

that

of

HPI-AE.

Key

words

:

hemp

;

hemp

seed

protein

;

extraction

;

physicochemical

property

;

functional

property

作者简介:徐鹏伟

（

1994

—

）

,

男

（

汉

）

，

硕士研究生

，

研究方向:化学工程

。

*

通信作者:赵庆生

（

1982

—

）

,

男

，

副研究员

，

博士

，

研究方向:天然产物研究与开发;赵兵

（

1966

—

）

,

男,研究员

，

博士

，

研究方向:天然产物研究与

开发

。

—

98

引文格式

：

2021

年

2

月

第

42

卷第

3

期

食品研究与开发

应用技术

徐鹏伟

，

刘家宁

，

常森林

，

等

.

火麻仁蛋白的提取分离及理化性质研究

［

J

］

.

食品研究与开发

,

2021

,

42(3

)

：

97-104.

XU

Pengwei

,

LIU

Jianing

,

CHANG

Senlin

,

et

al.

The

Extraction

of

Hemp

Seed

Protein

and

Its

Physicochemical

Properties[J].

Food

Research

and

Development

,2021,42(3

)

：

97-104.

大麻/

Cannabis

sativa

L.

)

广泛种植于亚洲

、

欧洲及

南美等地

，

由于大麻中的四氢大麻酚具有致幻成瘾的

特性

，

因此许多国家将其列为毒品而被禁止种植

，

但

是不同大麻品种中的四氢大麻酚

/

tetrahydrocannabi

­

nol,

THC

)

含量差别很大,

THC

含量低于

0.3%

的品种

被列为工业大麻

［

1

］

。

工业大麻

，

又称火麻

，

在我国大量

种植

。火麻的种子仁富含不饱和脂肪酸

、

微量元素和

蛋白质，

是一种营养价值极高的农作物

［

2-5］

。

火麻仁蛋白

(

hemp

seed

protein

isolate

,

HPI

)

因易

于消化而闻名

，

体外模拟人体胃肠道消化表明

，

火麻

仁蛋白易于被胃蛋白酶和胰蛋白酶消化

,

其消化率高

达

88%~91%

［

6

-

8

］

。

火麻仁蛋白由两种蛋白(火麻仁球蛋

白和麻仁白蛋白)组成

［

9

］

，

包含所有人体所需氨基酸

，

且精氨酸含量丰富㈣,研究证明,火麻仁蛋白粉可以改

善运动员的耐力和增强力量

［

11

］

。

火麻仁蛋白不仅营养

价值很高

，

且没有致敏因子

［

7

］

。

火麻仁蛋白作为植物蛋

白的来源,具有很高的开发潜力

［

12

］

。

常见的植物蛋白通常是通过碱提

/

酸沉法制备

》

15

］

。

文献报道，

氯化钠溶液可用于提取分离植物球蛋白吟

17］

,

对于火麻仁蛋白而言

，

球蛋白含量高于

70%

问,是主要

的储藏蛋白

，

与人体免疫功能有关，

因此利用氯化钠

溶液提取分离火麻仁蛋白也是开发利用火麻仁蛋白

的一个重要途径

。

Hadnadev

等

［

呵报道,通过氯化钠溶

液溶解火麻仁蛋白

，

然后通过透析袋脱盐

,

将蛋白质

沉淀下来

,

试验的局限性在于提取量小且试验操作复

杂

，

因此

，

仍需要在此基础上

,

深入研究氯化钠溶液的

提取温度对火麻仁蛋白溶解性的影响

。

本研究旨在确定两种分离方法对于制备得到的

火麻仁蛋白理化性质、

功能特性以及微观结构的影

响

，

从多方面评价分离方法

,

为火麻仁蛋白产业化生

产提供理论依据

。

1

材料与方法

1.1

材料与试剂

火麻仁:云南汉盟制药股份有限公司

。

氢氧化钠

、

盐酸

、

亚硫酸钠:北京化工厂;石油醚

、

三

(羟甲基)氨基甲烷

［

tris

(

hydroxymethyl

/

aminomethane

,

Tris

］

、

甘氨酸

/

glycine

,

Gly

)、乙二胺四乙酸

/

ethylene

diamine

tetraacetic

acid

,

EDTA)

、

尿素

(

urea)

:

国药集团

化学试剂有限公司

;5,5'-

二硫代双

(

2

-

硝基苯甲酸)

［

5,5'

-dithiobis-

(

2-nitrobenzoic

acid

)

,

DTNB

］

,

异硫氰

酸苯酯

、

二硫苏糖醇

(

dithio

threitol,DTT

)

:

阿拉丁试剂

公司;氯化钠、

结晶乙酸钠:天津市福晨化学试剂厂;蛋

白质凝胶电脉

(

sodium

dodecyl

sulfate

polyacylamide

gel

electrophoresis

,

SDS-PAGE

/试剂盒

：

北京索莱宝科技

有限公司

；

以上试剂均为分析纯

。

1.2

仪器与设备

KDN-520

凯氏定氮仪:徐州华纳精密仪器有限公

司

;WF2UV-2802H

分光光度计:上海尤尼柯仪器有限

公司

；

F-4600

荧光分光光度计

：

日立高新技术公司

；

LC-20AT

液相色谱:岛津公司

。

1.3

溶液配制

缓

冲溶液

A

：

0.086

mol/L

Tris

、

0.09

mol/L

Gly

、

0.004

mol/L

EDTA

(

Tris-Gly,pH

8.0

)

、

8

mol/L

尿素

。

缓冲溶液

B

：

0.086

mol/L

Tris

、

0.09

mol/L

Gly

、

0.004

mol/L

EDTA,

8

mol/L

尿素和

0.1

mol/L

Na

2

SO

(

pH

9.5

)

。

2

-

硝基

-5

-

硫代磺基苯甲酸酯

(

2-nitro-5-thiosul-

fobenzoate,NTSB

)

储备溶液

：

将

0.1

g

DTNB

溶解于

10

mL

1

mol/L

Na

2

SO

3

中

，

pH

值调至

7.5

。将氧气连续

引入离心管中

，

水浴条件下维持温度

37

益

，

直到溶液

颜色从红色变为浅黄色为止

，

证明了

NTSB

的生成

。

NTSB

测试溶液:用缓冲溶液

B

25

益

(

100

：

1,

体积

比)稀释

NTSB

储备溶液

,

制备

NTSB

测试溶液

。

1.4

试验方法

1.4.1

脱脂火麻仁粉

(

defatted

hemp

seed

meal,

HPM

)

的制备

通过机械压榨(脱壳)火麻仁以脱除油脂,然后将

脱除油脂的火麻仁粉和正己烷

［

(1

：

20

(

g/mL)］

混合

，

25

益

下充分搅拌脱除剩余油脂

，

得到脱脂火麻仁粉

(

HPM)

。

1.4.2

碱提

/

酸沉法制备火麻仁碱提蛋白

(

hempseed

protein

isolate-alkaline

extraction

,

HPI-AE

/

将

HPM

分散在去离子水

［

料液比

1

:

20

(g/mL)

］

中

,

pH

值调至

9.5,50

益

下充分搅拌

，

离心收集上清液。

将

上清液

pH

值调至

5.0

,

使蛋白质充分沉淀

，

离心获得

应用技术

食品研究与开发

2021

年

2

月

第

42

卷第

3

期

沉淀物

。

将沉淀物分散在去离子水中

，

将

pH

值调至

7.0

,

然后冷冻干燥获得

HPI-AE

。

1.4.3

盐溶

/

盐析法制备火麻仁盐提蛋白

(

hempseed

protein

isolate-salt

extraction

,

HPI-SE

)

将

HPM

分散在

5%

NaCl

溶液

[

料液比

1

:

15

(

g/mL

)

]

中

,

0

益条件下充分搅拌

2h

。

趁热离心获得上清液

。

将上清液在

4

益

下保存

24h

,

然后离心获得沉淀物

。

将

沉淀物分散在去离子水中

，

洗涤后经离心以便脱除氯

化钠

。

然后将沉淀物冷冻干燥获得

HPI-SE

。

1.4.4

理化性质

1.4.4.1

蛋白含量的测定及蛋白回收率计算

采用凯氏定氮法确定样品蛋白含量

。

将蛋白样品

与浓硫酸和催化剂硫酸钾一同置于消化炉加热消化,

使蛋白质分解

，

分解后的氨和硫酸结合生成硫酸铵,

然后碱化蒸馏使氨游离出来

，

用硼酸吸收后再以盐酸

标准溶液滴定

，

根据盐酸的消耗量乘以换算系数

，

换算

成蛋白质含量

。

蛋白含量计算公式如下

。

X=

AVxCxa°

14

xFx

100

M

式中:

X

为蛋白含量,

％

；

AV

为试样消耗盐酸标

准滴定液的体积

,mL

;

C

为盐酸浓度

,

mol/L

;

0.014

为

1.0

mL

盐酸

(

1.0

mol/L

)

标准滴定液相当于氮元素的

质量

,

g;M

为试样质量

,

g;F

为换算系数

，

本研究选择

系数

F=5.9

。

回收率计算公式如下

。

R=

MM™*

血

伊

100

M

HPM

X

x

HPM

式中:

R

为蛋白回收率

,

％

；

M

hpi

为提取分离获得

的

HPI

的质量

,

g

；

X

HH

为

HPI

中蛋白含量

,

％

；

M

hpm

为

用于提取分离蛋白的

HPM

的质量,

g;

X

HfM

为

HPM

中

蛋白含量

，

%

。

1.4.4.2

外观色泽

HPI

的颜色测量通过将蛋白质溶解于

1

mol/L

氢

氧化钠溶液中

，

配制成

20

mg/mL

的蛋白质溶液

，

在

420

、

520

、

620

nm

条件下测吸光值

。经过公式计算确定

了参数

L

*

(

亮度),

a

*

(红

-

绿色)和

b

*

(黄

-

蓝色)的值

。

计算公式如下

。

t

=10

-

a

X

=18.075

4

子

420

皿+

10.276

0

子

520

皿+

67.971

厶子嗣皿

Y

=1.891

5

子

420

皿+

66.510

4

子520

皿+

31.600

厶子嗣皿

Z=85.957

5

子

420^

+5.299

1

子厶叽

99

-

—

L

*

=116x

蓸

蔀

丄

-16

式中

：

为吸光值

；

为透光率;

X

。

为

97.285

；

Y

0

为

100

；

为

116.145

。

1.4.4.3

巯基

(

SH

)

和二硫键

(

S-S)

含量

巯基可分为总巯基

(

SH

t

)

、

游离巯基(

SH

f

)

。

SH

t

的测定方法:将火麻仁蛋白溶解于缓冲溶液

a

中

(

5mg/mL

)

,

充分混合后离心

10min

，

收集上清液

，

梯

度稀释获得不同浓度的火麻仁蛋白溶液

；

将

80

滋

L

Ellman

试剂

(

4

mg/mL

DNTB

)

添加到火麻仁蛋白溶

液

(

2

mL)

中，

充分混合

5

min

后

，

在

412

nm

处测量吸

光度

。

SH

f

的测定方法

：

将火麻仁蛋白溶解到缓冲溶液

B

(

5

mg/mL)

中

,

充分混合

10

min

后离心

,

收集上清液

。

用

NTSB

测试溶液线性稀释火麻仁蛋白溶液以获得不

同浓度的蛋白质溶液

,412

nm

处测量吸光度

。

巯基含量计算公式如下

。

C

SH

=

73

.53xA

412

伊

d

二硫键含量计算公式如下

。

C

S-S

_

=

C

sh

t

2

-

C

sh

f

式中:

C

SH

为

SH

含量

，

滋

mol/g

;

C

S-S

为

S-S

含量

,

滋

mol/g;

；

412

为

412

nm

处的吸光度

;C

为样品浓度

,

mg/mL

；

D

为稀释系数

；

73.53

为

10

6

/(1.36

伊

10

4

)

,

其中

1.36X10

4

为摩尔吸收率

,

10

6

为转化因子

。

1.4.4.4

SDS-PAGE

非还原状态下的蛋白质电泳分离胶浓度为

12%

,

浓缩胶浓度为

5%

。

方法如下,将样品

(

2

mg/mL)

分散

于不含二硫苏糖醇非还原性缓冲液中

,

5

益

条件下加

热

15min

后冷却

，

电泳时蛋白上样

10

滋

L

。

还原状态下的蛋白质电泳分离胶浓度为

15%

,

浓

缩胶浓度为

5%

。

方法如下,将样品

(

2

mg/mL)

分散于

含

DTT

的还原性缓冲液中

,

5

益

条件下加热

15

min

后冷却

，

电泳时蛋白上样

10

滋

L

。

凝胶采用考马斯亮蓝染色

,

最后用脱色液脱色至

背景无色

。

1.4.4.5

氨基酸组成

氨基酸通过柱前衍生

-

高效液相色谱法测定问

。

适

量样品置于密圭寸管中

，

用

16mL6mol/L

盐酸预处理

，

110

益

条件下消化

24

h

,

蛋白质完全水解

，

获得氨基酸

溶液

。

使用异硫氰酸苯酯对氨基酸衍生化

，

液相检测

。

100

2021

年

2

月

第

42

卷第

3

期

食品研究与开发

算公式如下

。

应用技术

酸性条件下水解蛋白质会导致色氨酸被破坏

，

因

此蛋白质需要在碱性条件下水解㈣

。

110

益

下碱性环境

水解

24h

,

获得色氨酸溶液

,

无需柱前衍生

,

直接液相

FC

/%=

V

初

伊

100

V

液

检测。

氨基酸含量计算公式如下

。

式中:

FC

为蛋白质起泡性

,

％

；

V

初

为泡沫的初始

Cl%=

兽

伊

100

M

总

式中

:

C

为氨基酸含量,

％

;M

为单一氨基酸质量

，

体积,

mL;V

液

为溶液体积

,mL

。

泡沫静置

30

min

,记录稳定泡沫体积。泡沫稳定性

计算公式如下

。

mg;M

总

为所有氨基酸质量之和

,

mg

。

FS

/%=

V

稳

伊

100

V

初

1.4.5

火麻仁蛋白功能性

1.4.5.1

溶解性

依据文献

［

21

］

报道

，

不同

pH

值条件下

,

火麻仁蛋

式中:

FS

为泡沫稳定性

,％;

V

稳

为稳定泡沫体积

,

mL

;

V

初

为初始泡沫体积

,mL

。

白的溶解性

(

protein

solubility,PS

)

测定方法如下:将蛋

白样品

(

0.1

g)

溶解在

10

mL

0.1

mol/L

NaOH

溶液中

“

1.4.6

荧光光谱

蛋白质分子中含有的色氨酸

(Trp)

、

酪氨酸

(

Tyr

)

和苯丙氨酸

(

Phe

)

3

种芳香族氨基酸残基

，

在紫外光的

测定的蛋白含量作为样品蛋白的总含量(对照);将

10

mg/mL

火麻仁蛋白样品

pH

值分别调节为

3.0

〜

11.0

,

充分搅拌

1h

,

000

g

条件下离心

30

min

得上清液

。

使

用

Bradford

方法分析上清液中的蛋白含量

。

蛋白质溶

照射下会发射荧光

。

在固定激发波长的照射下

，荧光

光谱利用蛋白质中芳香族氨基酸的荧光波长随外界

环境变化而改变的特点

，

用于研究蛋白质的构象变

化

。

在

0.1

mol/L

磷酸钠缓冲液(

pH7.

4

冲制备蛋白质

储备溶液

(

10mg/

mL)

,

然后将

pH

值调节至

3.0

、

5.0

、

解度计算公式如下

。

PS

/%=

—

上清

伊

100

M

总

式中:

PS

为蛋白质溶解度,

％

;

M

上清

为上清液中蛋

白的质量

,g;M

总

为总的蛋白质质量

,

g

。

7.0

、

9.0

和

11.0

。

用缓冲液将储备溶液稀释至

0.01%,

在

荧光分光光度计上记录荧光光谱

。

激发波长

:275nm

;

发射波长:

290

nm

〜

450

nm

。

1.4.5.2

起泡性

/

泡沫稳定性

火麻仁蛋白在不同

pH

值条件下的起泡性

(

foam­

2

结果和分析

2.1

理化性质

2.1.1

理化参数

ing

capacity

,

FC

)

和泡沫稳定性

(foaming

stability

,

FS

)

测定方法如下

，

将

10

mg/mL

蛋白样品

pH

值分别调为

3.0

〜

11.0

。

高速乳化机快速剪切搅拌

10min

,

使蛋白溶

液充分起泡

，

记录溶液体积和初始泡沫体积

。

FC

计

表

1

理化参数

HPI

的理化参数如表

1

所示

。

从表

1

中可以看出蛋白质是

HPM

的主要成分

；

Table

1

Physicochemical

properties

项目

HPM

HPI-AE

HPI-SE

蛋白含量

/%

69.5±0.25

85.9±0.3

蛋白回收率

/%

—

83.43

59.06

1

：

—

62.5

85.25

a

*

游离巯基(

滋

mol/g

)

总巯基/(

滋

mol/g

)

—

50.77±0.38

59.10±0.35

二硫键

/(

滋

mol/g

—

14.17

—

-0.79

-2.16

—

39.92

—

22.44±0.48

26.49±0.39

94.8±0.2

10.8

16.33

注:一为未检测

。

HPI-SE

的蛋白含量

(

94.8%

)

高于

HPI-AE

的蛋白含

量

(

85.9%)

。

氯化钠溶液常用于提取植物球蛋白

，

并且

质分子携带大量的同种电荷阻碍了蛋白质分子的聚

集沉淀

，

从而提高了蛋白质的溶解性

；

等电点沉淀蛋

白质时

，

蛋白质分子之间静电斥力消失

，

蛋白质分子

聚集沉淀

。

等电点沉淀过程中

，

大部分蛋白沉淀下来

火麻仁蛋白中球蛋白含量较高购

，

通过氯化钠提取火

麻仁蛋白具有广阔前景

;

盐溶

/

盐析过程中

,

溶液温度

的改变对于火麻仁球蛋白的溶解性影响较大

,

其它物

质的溶解性没有明显变化

，

因而盐溶

/

盐析法更利于提

取火麻仁球蛋白

,

因此

HPI-SE

的蛋白含量更高

。

HPI-

的同时

，

也有部分其它物质沉淀下来

，

从而导致

HPI-

AE

中蛋白回收率较高

，

蛋白含量较

HPI-SE

低

。

由表

1

可知

,

HPI-SE

具有高的

L

*

值

、

较低的

a

值

AE

的蛋白回收率为

83.43%

,

高于

HPI-SE

蛋白回收

率

59.06%

。

对于碱提

/

酸沉法而言

，

碱提蛋白时

，

蛋白

和

b

*

值

；

说明了

HPI-SE

的外观色泽比

HPI-AE

的外

观色泽更亮白

。

碱提

/

酸沉法提取火麻仁过程中，

羰基

应用技术

食品研究与开发

2021

年

2

月

第

42

卷第

3

期

101

—

化合物(还原糖类)和氨基化合物(蛋白质/间的美拉

低构象熵

，

从而提高热稳定性

[22]

;

分子间二硫键的形

德反应生成棕色的大分子类物质

，

等电点沉淀过程

中,这些物质也沉淀下来

，

从而导致

HPI-AE

外观呈现

成,会导致蛋白质分子更易聚集沉淀

。

火麻仁蛋白中

游离巯基的含量高于木瓜种子蛋白中游离巯基的含

量

9.73

滋