2024年9月1日发(作者：云芳蕙)
中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志
2019年
11
月第
12
卷第
6
期
CHIN
J
OSTEOPOROSIS
&
BONE
MINER
RES
Vol.
12
No.
6
November
10,
2019
•
595
•
DOI
：
10.
3969/.
1674-2591.
2019.
06.
007
•
基础研究
•
氯沙坦钾对棕植
］
酸所致骨骼肌细胞凋亡的干预作用
杨明
，
陈琳
，
潘凌
，
李丽
，
李思雨
，
彭永德
，游利
［
摘要
］
目的从细胞水平探索氯沙坦钾对骨骼肌损伤的保护作用及其机制
。
方法用
2%
马血清诱导
分化
L6
成肌细胞
；
CCK-8
试剂盒及
Western
Blot
确定合适的氯沙坦细胞处理浓度
。
实验分为
4
组
：
对照组，
二甲基亚枫组
，
棕桐酸
(
1
mmol/L)
组以及棕桐酸
(
1
mmol/L)
+
氯沙坦钾
(
50
|imol/L)
组
。
Western
Blot
检测凋亡相关蛋白(
cleaved
caspase-3
、
cleaved
PARP,
Bcl-2
、
Bax)
、
自噬相关蛋白
(LC3
、
Beclin
1),
实时荧
光定量
PCR
(
quantitative
real-time
PCR,
qPCR)
检测P53
和
P21
mRNA
表达水平
。
结果
显微镜下观察及
Western
Blot
检测
myogenin蛋白表达增加
，
证明骨骼肌细胞诱导分化成功
。
CCK-8
试剂盒检测示氯沙坦钾浓度
为
50、
100
、
200
、
400
jimol/L
时
L6
成肌细胞活力分别为
0.
87±0.087,
1.11
±0.037,
1.21
±0.099,
1.30±
0.068,
其中
50
jimol/L
时细胞活力最大
，
且对
cleaved
caspase-3
蛋白表达抑制最明显
。
与未作处理的对照组
比较
，
qPCR
显示棕桐酸处理组骨骼肌细胞
P53、P21
mRNA
表达量分别从0.36±0.03
、
0.
50±0,
05
±调至
0.
68±0.
08、
1.
07±0.
02
(
P<0.
05
)
,
cleaved
caspase3
、
cleaved
PARP
蛋白表达均增加
，
LC3U/LC3I
及
Beclin
1
蛋白表达减低
；
与棕稠酸单独处理组比较
，
氯沙坦钾与棕桐酸共处理组
P53
、
P21
mRNA
表达量分别从
0.68
士
0.08
、
1.
07±0.
02
下调至
0.44±0.01、
0.
67±0,
03
(
P<0.
05
)
,
cleaved
caspase-3
、
cleaved
PARP
蛋白表达减低
，
LC3H/LC3
I
及
Beclinl
蛋白无显著改变
。
结论
氯沙坦钾通过抑制
cleaved
caspase3
及其底物
cleaved
PARP
表
达抑制细胞凋亡
，
但这种保护效应并不是通过自噬途径实现的
。
［
关键词］
肌少症
；
氯沙坦钾
；
凋亡
；
自噬
中图分类号
：
R681
文献标志码
：
A
Effects
of
losartan
potassium
on
the
apoptosis
of
skeletal
muscle
cell
induced
by
palmitic
acid
YANG
Ming,
CHEN
Lin,
PAN
Ling,
U
Li,
LI
Si-yu,
PENG
Yong-de,
YOU
Li
Department
of
Endocrinology
and
Metabolism
,
Shanghai
General
Hospital
,
Shanghai
Jiao
Tong
University
School
of
Medicine
,
Shanghai
200080
,
China
[
Abstract
]
Objective
To
explore
the
protective
effects
of
losartan
potassium
on
skeletal
muscle
injury
and
its
mechanisms
at
the
cellular
level.
Methods
L6
myoblasts
were
differentiation
by
2%
horse
serum.
The
appropriate
con
centration
of
losartan
was
determined
by
CCK-8
kit
and
Western
Blot.
There
were
4
groups
:
control
group,
DMSO
group,
palmitic
acid
(
1
mmol/L)
group
and
palmitic
acid
(
1
mmol/L)
+
losartan
potassium
(50
|xmol/L)
group.
Western
Blot
was
used
to
detect
the
apoptosis-related
proteins
(
cleaved
caspase-3
,
cleaved
PARP
,
Bcl-2,
Bax)
,
and
autophagy-associ
ated
proteins
(
LC3
,
Beclin
1
)
；
quantitative
real-time
PCR
(
qPCR)
was
used
to
detect
the
levels
of
P53
and
P21
mRNA
expression.
Results
Microscopic
observation
and
Western
Blot
showed
the
increased
expression
of
myogenin
protein
,
which
indicated
that
L6
myoblasts
were
differentiation
successfully.
The
CCK-8
kit
assay
showed
that
the
cell
viability
was
0.
87±0.
087
,
1.
ll±0.
037,
1.
21±0.
099
and
1.
30±0.
068
when
the
concentration
of
losartan
potassium
was
50,
100,
200,
and
400
|xmol/L
,
respectively.
The
cell
viability
was
the
highest
at
50
pimol/L
and
the
most
inhibition
on
cleaved
基金项目
：
国家自然科学基金面上项目
(81570797)
作者单位
：
200080
±
海
，
上海交通大学附属第一人民医院内分泌代谢科骨质疏松亚专科
通信作者
：游利
，
:
youlisky2(X)2@
中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志
2019
年
11
月第
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6
期
・
596
・
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&
BONE
MINER
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Vol.
12
No.
6
November
10,
2019
caspase-3
protein
expression.
After
palmitic
acid
treatment
,
compared
with
the
untreated
control
group,
qPCR
showed
that,
the
expression
of
P53
,
P21
mRNA
was
up-regulated
from
0.
36±0.
03
,
0.
50
±
0.
05
to
0.
68
±
0.
08
,
1
.
07
±
0.
02
(
P<0.
05)
,
cleaved
caspase-3
,
cleaved
PARP
protein
expression
increased
,
LC3
U/LC3
I
and
Beclin
1
protein
expres
・
sion
decreased.
Compared
with
palmitic
acid
alone
treatment
,
the
expression
of
P53
and
P21
mRNA
were
down-regulated
from
0.
68±0.
08,
1.
07±0.
02
to
0.
44±0.
01
,
0.
67±0.
03
in
losartan
potassium
treated
group
(
P<0.
05)
,
the
expressions
of
cleaved
caspase
・
3,
cleaved
PARP
proteins
were
decreased
,
and
LC3
U/LC3
I
and
Beclin 1
proteins
were
not
changed.
Conclusion
Losartan
potassium
may
reduce
apoptosis
by
inhibiting
cleaved
caspase-3
and
its
substrate
cleaved
PARP
protein
expression
,
but
this
protective
effect
is
not
achieved
by
autophagy.
[
Key
words
]
sarcopenia
；
losartan
potassium
；
apoptosis
；
autophagy
肌少症
(
sarcopenia)
是一种与增龄相关的进
究所细胞库
；
棕植
I
酸购自美国
Sigma
公司
；
氯沙
坦钾购自上海陶素生化科技有限公司
；
CCK-8
检
行性全身肌量减少和(或)肌强度下降或肌肉生
理功能减退为特征的综合征⑴
，
目前尚无明确有
测试剂盒
(
cell
counting
kit
8)
购自日本
Dojindo
公司
；
反转录试剂盒
、
SYBR
Mix
购自德国罗氏公
效的防治肌少症的药物⑵
。
探索和开发作用于骨
骼肌细胞
，
预防肌少症的新药物
，
是当前肌少症
司
，
LC
3
抗体购自美国
sigama
公司
，
caspase-3
和
PARP
抗体购自美国
Cell
Signaling
Technology
公
研究的热点之一
。
棕稠酸可诱导细胞氧化应激
，
引起内质网
Ca"
释放导致细胞质和线粒体
Ca?*
超载
，
并可进
司
，
myogenin
、
R-actin
、
GAPDH
、
Bcl-2
、
Bax
、
Beclin
1
抗体购自英国
Abeam
公司
，
胎牛血清
一步加速线粒体中活性氧
(
reactive
oxygen
sprcies
,
ROS)
的产生并促进线粒体膜通透性转换孔开放
。
(
fatal
bovine
serum
,
FBS
)
购自美国
Gibco
公司
，
马血清
(
horse
bovine
serum
,
HBS
)
购自美国
Abbkine
公司
。
由于内质网
Ca"
持续释放引起了持续的钙过载
，
从而导致了钙池调控的钙离子通道的激活
，
ROS
的产生和
Ca
”
的恶性循环最终可激活细胞凋亡信
实验方法
细胞诱导分化
：
10%
FBS
的高糖培养基
(
dulbecco's
modified
media
,
DMEM
)
培养
L6
成肌
号⑶
。
血管紧张素受体是以血管紧张素作为配体
的
G
蛋白偶联受体
，
既往有临床研究表明对心力
衰竭患者进行氯沙坦钾治疗可提高其运动能
力⑷
，
同时有动物研究表明氯沙坦可以通过抑制
细胞至
80%
左右
，
换含
2%
HBS
的
DMEM
培养
5~7
d,
每
24
小时换一次液
。
细胞活性检测
：
将
L6
成肌细胞种于
96
孔板
中
，
每孔
15
000
个细胞
，
每孔加
100
“
L
含
10%
FBS
的
DMEM,
于
37
弋培养
24
h
。
然后用不含血
转化生长因子
0
(
transforming
growth
factor-p
,
TGF-p)
和丝裂原活化蛋白激酶
(
mitogen
・
activa
・
ted
protein
kinase
,
MAPK)
信号通路加速肌肉损
清的
DMEM
培养
4h,
之后加入不同浓度氯沙坦
伤后愈合
，
提升肌力同时减缓小鼠骨骼肌废用性
萎缩的发展⑸
，
但血管紧张素
II
受体拮抗剂在细
胞水平上对骨骼肌细胞影响及机制尚不清楚
。
本
钾
(
50
、
100
、
200
、
400
ixmol/L)
或不加入氯沙
坦钾继续
37
乜培养
24
h,
同时设立不含细胞的
DMEM
组
。
每孔加入
10
|
jl
L
CCK-8
试剂
，
37
七反
研究应用棕幅酸体外处理骨骼肌细胞
，
然后给予
血管紧张素
II
受体拮抗剂氯沙坦钾干预棕制酸导
致的骨骼肌细胞凋亡
，
观察氯沙坦钾对骨骼肌细
应
1
h,
用酶标仪于
450
nm
处测吸光度值
，
然后
计算细胞活力
。
实验分组
：
将实验分为
4
组
，
对照组、
二甲
基亚砚
(
dimethyl
sulfoxide
,
DMSO
)
处理组
、棕
胞的保护作用
。
材料与方法
材料
植
］
酸
(
1
mmol/L)
处理组以及棕植
I
酸
(
1
mmol/L)
和氯沙坦钾
(
50
jimol/L)
共同处理组
。
因为本
研究氯沙坦钾粉剂是溶于
DMSO
后用于处理细胞
的
，
故添加相同剂量
DMSO
组用以排除后续
大鼠成肌细胞
L6
购自中国科学院上海细胞研
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•
597
•
DMSO
对实验结果的影响
。
(
1
：
5
000)
,
myogenin
(
1
:
200)
,
Bcl-2
(
1
：
1
000
),
实时荧光定量
PCR
(
quantitative
real-time
PCR,
beclin
1(1
：
2
000)
,
Bax
(1
：
2
000),
GAPDH
qPCR)
检测
：
按照
Trizol
法提取
RNA
说明书指示进
(1
：
4
000)
—
抗工作液
4
七孵育过夜
，
TBST
清
行操作
；
并对
RNA
进行浓度测定
；
反转录为
cDNA
；
洗
10
minx3
次
，
然后加辣根过氧化物酶标记的二
所有引物均由上海杰李生物工程有限公司设计合成,
抗
(1
:
5
000),
室温孵育
1
h,
再
TBST
洗涤
GAPDH
作为内参
，
所用引物名称
、
序列见表
1
。
反
10
minx3
次
。
然后置入含化学发光试剂
A
、
B
的
应体系配置
：
cDNA
(反转录后稀释
10
倍)
2
|iL,
水溶液中激发荧光
，
天能
Tanon
5200
全自动化学
Forward
Primer
(
1
(
imol/L)
4
|j,L,
Reverse
Primer
发光成像分析仪扫描并行灰度值测定
。
实验重复
(
1
junol/L)
4
jxL,
SYBR
Mix
10
|
jl
L
o
按以下反应要
3
次
，
计算各条带的灰度值
，
结果以目的蛋白与
求设置条件
：
95
X
10
min
(预变性)
；
40
个循环:
内参蛋白灰度值之比表示
。
95
T
：
10
s,
60%
：
10
s
；
71
°C
10
s,
95
七
15
s,
60
T
统计学方法
15
s,
95
P
15
s,
4
P
保持
。
结果采用
2-
阿法计算
采用
SPSS
21.
0
统计软件对实验结果进行统
基因的相对表达水平
。
计学分析
，
数据以均数土标准差
(
X±5
)
表示
。
实
蛋白表达检测
：
采用
Western
Blot
法
，
裂解
验数据均进行正态分布检验及方差齐性检验
，
组
经过处理后的细胞
，
每个样本每孔加入
40
pg
蛋
间比较采用独立样本
t
检验
。
P<0.
05
为差异有统
白液
，
经
SDS-PAGE
胶电泳后转膜
，
用
5%
脱脂奶
计学意义
。
粉室温封闭
1
h,
caspase-3
(
1
：
1
000
)
,
p-actin
结
果
表
1
P53,
P21
和
GAPDH
引物序列
诱导成肌细胞
L6
分化为骨骼肌细胞
Table
1
Primer
sequences
of
P53
,
P21
and
GAPDH
用
2%
HBS
培养
L6
成肌细胞
5~7
d,
显微镜
名称
序列
长度
(bp)
下观察发现
L6
成肌细胞分化成为骨骼肌细胞后形
P53
GCGTTGCTCTGATGGTGAC
19
态发生改变
，
相互融合变细变长(图
1),
GCGTGATGATGGTAAGGATGG
21
P21
ACTCTGAAGATGTGCCTATGGT
22
Western
Blot
结果显示诱导分化后相比于未分化的
CGCTGAGGTCTCAATGAATGG
21
成肌细胞其
myogenin
蛋白表达水平显著增加
(P<
GAPDH
ATGCCATCACTGCCACTCA
19
0.05)
(图
2)
。
CCTGCTTCACCACCTTCTTG
20
确定合适的氯沙坦钾处理浓度
CCK-8
细胞活性检测结果可见
，
50
-
200
pmol/L
A
B
图
1
诱导分化后骨骼肌细胞和未分化成肌细胞形态
(x200)
Fig
1
Skeletal
muscle
cells
after
differentiation
and
undifferentiated
myoblast
morphology
(
x200)
A
：
诱导分化后的骨骼肌细胞
；
B
：
未分化的L6
成肌细胞
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氯沙坦钾均对分化后
L6
骨骼肌细胞无细胞毒性,
上调
（
P<0.05
）
,
而加入氯沙坦钾后
P53
、
P21
氯沙坦钾浓度为
400
、
200
、
100
和
50
“
mol/L
时
均有不同程度的下降
（
P<0.05
）
（
表
2
）
。
成肌细胞细胞活力分别为
0.87±0.087
、
1.11
土
氯沙坦钾对骨骼肌细胞凋亡蛋白的影响
0.037
、
1.21
±0.099.
1.
30±0.
068,
50
pmol/L
组
显微镜下观察
4
组细胞
，
与对照组相比
，
棕
与
100
jimol/L
组组间差异无统计学意义
（
P>
植
1
酸处理组可发现细胞大量死亡
，
Western
Blot
显
0.05
）
；
而
50
|imol/L
组和
200
pmol/L
组与
示棕植
1
酸处理组相比于对照组
，
cleaved
caspase-3
、
400
pmol/L
组之间细胞活力差异均有统计学意义
cleaved
PARP
表达均显著增加
（
P<0.05
）
,
而加
（
P<0.
05
）
（
图
3
）
。
同时用棕涧酸
（
1
mmol/L
）
入氯沙坦钾后可见细胞死亡略有减少
，
cleaved
处理骨骼肌细胞后
，
加入以上不同浓度氯沙坦钾
，
caspase-3
、
cleaved
PARP
蛋白相比于单加棕植
］
酸
Western
Blot
检测示氯沙坦钾
50
）
xmol/L
时
cleave
组有所减低
（
P<0.05
）
,
同时
4
组
Bcl-2/Bax
表达
caspase-3
表达抑制最显著
，
其对骨骼肌的保护作
均无差异
（
P>0.05
）
（
图
5
）
。
用最明显
（
图
4
）
,
因此后续实验氯沙坦钾浓度选
氯沙坦对骨骼肌细胞自噬蛋白的影响
择为
50（
xmol/L
0
与对照组相比
，
棕桐酸处理组
LC3
D/LC3
I
肌细胞衰老模型的构建及氯沙坦钾对其影响
及
Beclin
1
蛋白表达减低
（
P<0.05
）
；
但棕植
1
酸
与对照组相比
，
棕植
I
酸处理组
P53
、
P21
均
和氯沙坦钾共同处理组相比于棕植
I
酸组
LC3
n/
LC3
I
及
Beclin
1
无差异
（
P>0.
05
）
（
图
6
）
。
分化未分化
myogenm
p-actin
分化
未分化
A
B
图
2
分化前后骨骼肌细胞
myogenin
表达差异
图
4
不同浓度氯沙坦钾对棕稠酸处理后骨骼肌细胞
Fig
2
Differential
expression
of
myogenin
in
skeletal
cleaved
caspase-3
的影响
muscle
cells
before
and
after
differentiation
Fig
4
Effects
of
difTerent
concentrations
of
losartan
A
：
电泳图
；
B
：
细胞质中
myogenin
相对灰度值；
potassium
on
cleaved
caspase-3
of
skeletal
与分化后骨骼肌细胞组比较
，
*P<0.
05
muscle
cells
after
palmitate
treatment
PA：
棕桐酸
；
DMSO
：
二甲基亚矶
；
Con
：
对照组
表
2
氯沙坦钾对棕櫚酸干预骨骼肌细胞
P53
和
P21
mRNA
表达的影响
（
x±s
）
Table
2
Effects
of
losartan
potassium
exposure
on
P53
and
P21
mRNA
expression
of
palmitate
treated
skeletal
muscle
cell
(
x±s
)
组别
P53
P21
Con
组
0.
36±0,
03
0.
50±0.
05
图
3
不同浓度氯沙坦钾对成肌细胞细胞活力的
DMS
0
组
0.
30±0.
02
0.
45±0.
03
影响(丘
±5
)
PA
组
0.
68±0.
08
*
1.07±0.
02*
Fig
3
Effects
of
differrent
concentration
losartan
PA+Los
组
0.
44
士
0.01#
0.
67±0.
03#
potassium
on
myoblast
cell
viability
(x±s)
Con
：
对照组
；
DMSO
：
二甲基亚砚
；
PA
：
棕桐酸
；
Los
：
氯沙坦
与氯沙坦钾浓度为
50
pmol/L
组比较
，
-P<0.
05
钾
；
与对照组比较
，
*P<0.05
；
与棕舸酸处理组比较
，
*P<0.05
中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志
2019
年
11
月第
12
卷第
6
期
CHIN
J
OSTEOPOROSIS
&
BONE
MINER
RES
Vol.
12
No.
6
November
10,
2019
・
599
・
Con
DMSO
PA
PA+Los
图
5
氯沙坦钾对棕桶酸干预骨骼肌细凋亡蛋白表达的影响
Table
5
Effects
of
losartan
potassium
exposure
on
apoptotic
protein
expression
of
palmitate
treated
skeletal
muscle
cell
A
：
电泳图
；
B
：
细胞质中凋亡蛋白相对灰度值
；
Con
：
对照组
；
DMSO
：
二甲基亚砚
；
PA
：
棕桐酸
；
Los
：
氯沙
坦钾
；
与对照组比较
，*P<0.
05
；
与棕桐酸处理组比较
，
#
Pv0.05
LC3-I
LC3-U
GAPDH
A
图
6
氯沙坦钾对棕櫚酸干预骨骼肌细自噬蛋白表达的影响
Table
6
Effects
of
losartan
potassium
exposure
on
autophagy
protein
expression
of
palmitate
potassium
treated
skeletal
muscle
cell
A
：
电泳图
；
B
：
细胞质中自噬蛋白相对灰度值
；
Con
：
对照组
；
DMSO
：
二甲基亚枫
；
PA
：
棕桐酸
；
Los
：
氯沙
坦钾
；
与对照组比较
，
*P<0.05
讨
论
及
myogenin
蛋白检测可证明成肌细胞是否分化为
骨骼肌细胞
。
衰老是引起肌少症发生发展的主要
目前国内外对于肌少症的研究绝大多数聚焦
原因
，
构建骨骼肌细胞衰老模型是在细胞水平上
于临床以及动物实验
，
如何在细胞水平上构建骨
研究肌少症的必要条件
。
P53
作为一种抑癌基因
，
骼肌细胞衰老模型以及从细胞水平上研究肌少症
其在衰老过程中具有十分重要的作用
，
细胞有丝
治疗药物作用机制将给肌少症基础研究和临床治
分裂中的复制增殖压力会引起
DNA
损伤等
，
导致
疗提供新的思路
。
细胞周期停滞
，
同时端粒随细胞分裂呈现周期性
Myogenin
在肌生成中具有重要的作用
，
其表
和渐进性缩短
，
进而影响
P53
和
P21
基因
，
激活
达意味着成肌细胞增殖的结束
，
是骨骼肌细胞分
CDK
抑制因子
，
最终引起细胞复制性衰老
〔
7
列
。
化成熟的一个重要标志物国
。
通过显微镜观察以
本研究发现棕植
1
酸可以导致骨骼肌细胞
P53
和
中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志
2019
年11
月第
12
卷第
6
期
•
600
•
CHIN
J
OSTEOPOROSIS
&
BONE
MINER
RES
Vol.
12
No.
6
November
10,
2019
P21
基因表达上升
，
提示棕櫚酸可用于构建骨骼
肌细胞衰老模型
。
Bcl-2
和
Bax
是
Bcl-2
家族的主要成员
，
分别
起抗凋亡和促凋亡作用
，
可用其比值衡量凋亡水
平的大小
，
但凋亡程度的大小不仅与两种蛋白的
表达量相关
，
还与
Bax
细胞定位以及
Bcl-2
是否
磷酸化密切相关⑼
。
其下游
caspase-3
是细胞凋亡
的关键蛋白
，
其激活后可裂解为多种小分子底物
从而执行相关功能
，
最终导致细胞凋亡
〔
回
。
本研
究虽然发现棕稠酸可以使骨骼肌细胞凋亡增加
，
但
Bcl-2
和
Bax
并无显著变化
，
因此需要进一步
对其细胞定位以及磷酸化状态进行研究
。
血管
紧张素
U
1
型受体
(
angiotensin
U
type
1
receptor
,
AT1R)
增加
，
血管紧张素
II
2
型受体
(
angiotensin
D
type
2
receptor,
AT2R)
降低
，
可能会引起起四
肢骨骼肌的萎缩⑴)
。
先前动物研究表明血管紧张
素受体抑制剂治疗可导致衰老小鼠中
IL-6
和自由
基的产生减少"⑶
，
Burks
等
［
⑷发现给予经心肌
毒素处理后的小鼠氯沙坦后
，
其肌肉损伤后修复
能力及肌肉功能明显提升
，
同时发现氯沙坦不仅
减弱了经典的
TGF-p
级联信号
，
还调节了非经典
的
TGF-p
丝裂原活化蛋白激酶信号通路
。
Hwang
等发现氯沙坦可以增加
CCIA
处理后小鼠的
Pax
、
MyoD
和
myogenin
等肌肉损伤修复蛋白的表
达
，
同时还可以阻断
TGF-p
信号传导而促进这种
修复作用
。
不仅如此
，
Elbaz
等
M
还在
dy2J/dy2J
小鼠中发现氯沙坦不仅可以通过
TGF-p
信号以及
MAPK
信号提升肌肉强度减少纤维化
，
同时还可
以通过活化
NF-
k
B
信号来促进其下游靶基因
TRAF1
、
TRAF2
、
clAP2
和
FTH1
的表达抑制凋亡
从而发挥保护作用
。
本研究进一步在细胞水平上
发现氯沙坦钾可以抑制
cleaved
caspase-3
和
cleaved
PARP
的表达
，
提示氯沙坦钾对骨骼肌保
护效应可能通过凋亡途径实现
，
同时
qPCR
结果
还发现氯沙坦钾可以使棕植
1
酸处理后的骨骼肌细
胞
P53
和
P21
基因表达下调
，
提示这种保护效应
可能也与
P53
途径密切相关
。
自噬是一种保守的细胞内过程
，
但棕櫚酸对
于骨骼肌细胞自噬的影响尚存在争议
，
Chang
等的研究显示棕植
I
酸可增强骨骼肌细胞的自噬
作用
；
而
Chen
等的研究发现棕櫚酸可抑制骨
骼肌细胞的自噬
。
本研究通过对自噬起始的重要
调节因子
Beclin
1
和自噬体形成的标志蛋白
LC3
研究发现棕植酸可抑制骨骼肌细胞的自噬
，
这与
Chen
的研究结果一致
。
出现研究结果差异的原因
可能是由于细胞系的不同以及棕植
I
酸浓度的差异
。
本研究进一步研究了氯沙坦钾对棕植
1
酸改变的自
噬的影响
，
但结果并没有发现氯沙坦钾对棕涧酸
改变的自噬产生影响
，
提示氯沙坦钾可能并不通
过自噬途径发挥其对骨骼肌的保护作用
，
其保护
机制尚有待于进一步研究
。
综上所述
，
氯沙坦钾可通过抑制
cleaved
caspase-3
及其底物
cleaved
PARP
表达
，
使骨骼肌
细胞凋亡减少从而发挥保护效应
，
但这种保护效
应可能并不是通过影响自噬途径实现的
。
本研究
探索了肌少症研究细胞模型的建立
，
同时为肌少
症的治疗提供了新的思路和依据
。
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卷第
6
期
CHIN
J
OSTEOPOROSIS
&
BONE
MINER
RES
Vol.
12
No.
6
November
10,
2019
・
601
・
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pal
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,
2014,
58
:
（
收稿日期
：
2019-04-23
）
174-178.
2024年9月1日发(作者：云芳蕙)
中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志
2019年
11
月第
12
卷第
6
期
CHIN
J
OSTEOPOROSIS
&
BONE
MINER
RES
Vol.
12
No.
6
November
10,
2019
•
595
•
DOI
：
10.
3969/.
1674-2591.
2019.
06.
007
•
基础研究
•
氯沙坦钾对棕植
］
酸所致骨骼肌细胞凋亡的干预作用
杨明
，
陈琳
，
潘凌
，
李丽
，
李思雨
，
彭永德
，游利
［
摘要
］
目的从细胞水平探索氯沙坦钾对骨骼肌损伤的保护作用及其机制
。
方法用
2%
马血清诱导
分化
L6
成肌细胞
；
CCK-8
试剂盒及
Western
Blot
确定合适的氯沙坦细胞处理浓度
。
实验分为
4
组
：
对照组，
二甲基亚枫组
，
棕桐酸
(
1
mmol/L)
组以及棕桐酸
(
1
mmol/L)
+
氯沙坦钾
(
50
|imol/L)
组
。
Western
Blot
检测凋亡相关蛋白(
cleaved
caspase-3
、
cleaved
PARP,
Bcl-2
、
Bax)
、
自噬相关蛋白
(LC3
、
Beclin
1),
实时荧
光定量
PCR
(
quantitative
real-time
PCR,
qPCR)
检测P53
和
P21
mRNA
表达水平
。
结果
显微镜下观察及
Western
Blot
检测
myogenin蛋白表达增加
，
证明骨骼肌细胞诱导分化成功
。
CCK-8
试剂盒检测示氯沙坦钾浓度
为
50、
100
、
200
、
400
jimol/L
时
L6
成肌细胞活力分别为
0.
87±0.087,
1.11
±0.037,
1.21
±0.099,
1.30±
0.068,
其中
50
jimol/L
时细胞活力最大
，
且对
cleaved
caspase-3
蛋白表达抑制最明显
。
与未作处理的对照组
比较
，
qPCR
显示棕桐酸处理组骨骼肌细胞
P53、P21
mRNA
表达量分别从0.36±0.03
、
0.
50±0,
05
±调至
0.
68±0.
08、
1.
07±0.
02
(
P<0.
05
)
,
cleaved
caspase3
、
cleaved
PARP
蛋白表达均增加
，
LC3U/LC3I
及
Beclin
1
蛋白表达减低
；
与棕稠酸单独处理组比较
，
氯沙坦钾与棕桐酸共处理组
P53
、
P21
mRNA
表达量分别从
0.68
士
0.08
、
1.
07±0.
02
下调至
0.44±0.01、
0.
67±0,
03
(
P<0.
05
)
,
cleaved
caspase-3
、
cleaved
PARP
蛋白表达减低
，
LC3H/LC3
I
及
Beclinl
蛋白无显著改变
。
结论
氯沙坦钾通过抑制
cleaved
caspase3
及其底物
cleaved
PARP
表
达抑制细胞凋亡
，
但这种保护效应并不是通过自噬途径实现的
。
［
关键词］
肌少症
；
氯沙坦钾
；
凋亡
；
自噬
中图分类号
：
R681
文献标志码
：
A
Effects
of
losartan
potassium
on
the
apoptosis
of
skeletal
muscle
cell
induced
by
palmitic
acid
YANG
Ming,
CHEN
Lin,
PAN
Ling,
U
Li,
LI
Si-yu,
PENG
Yong-de,
YOU
Li
Department
of
Endocrinology
and
Metabolism
,
Shanghai
General
Hospital
,
Shanghai
Jiao
Tong
University
School
of
Medicine
,
Shanghai
200080
,
China
[
Abstract
]
Objective
To
explore
the
protective
effects
of
losartan
potassium
on
skeletal
muscle
injury
and
its
mechanisms
at
the
cellular
level.
Methods
L6
myoblasts
were
differentiation
by
2%
horse
serum.
The
appropriate
con
centration
of
losartan
was
determined
by
CCK-8
kit
and
Western
Blot.
There
were
4
groups
:
control
group,
DMSO
group,
palmitic
acid
(
1
mmol/L)
group
and
palmitic
acid
(
1
mmol/L)
+
losartan
potassium
(50
|xmol/L)
group.
Western
Blot
was
used
to
detect
the
apoptosis-related
proteins
(
cleaved
caspase-3
,
cleaved
PARP
,
Bcl-2,
Bax)
,
and
autophagy-associ
ated
proteins
(
LC3
,
Beclin
1
)
；
quantitative
real-time
PCR
(
qPCR)
was
used
to
detect
the
levels
of
P53
and
P21
mRNA
expression.
Results
Microscopic
observation
and
Western
Blot
showed
the
increased
expression
of
myogenin
protein
,
which
indicated
that
L6
myoblasts
were
differentiation
successfully.
The
CCK-8
kit
assay
showed
that
the
cell
viability
was
0.
87±0.
087
,
1.
ll±0.
037,
1.
21±0.
099
and
1.
30±0.
068
when
the
concentration
of
losartan
potassium
was
50,
100,
200,
and
400
|xmol/L
,
respectively.
The
cell
viability
was
the
highest
at
50
pimol/L
and
the
most
inhibition
on
cleaved
基金项目
：
国家自然科学基金面上项目
(81570797)
作者单位
：
200080
±
海
，
上海交通大学附属第一人民医院内分泌代谢科骨质疏松亚专科
通信作者
：游利
，
:
youlisky2(X)2@
中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志
2019
年
11
月第
12
卷第
6
期
・
596
・
CHIN
J
OSTEOPOROSIS
&
BONE
MINER
RES
Vol.
12
No.
6
November
10,
2019
caspase-3
protein
expression.
After
palmitic
acid
treatment
,
compared
with
the
untreated
control
group,
qPCR
showed
that,
the
expression
of
P53
,
P21
mRNA
was
up-regulated
from
0.
36±0.
03
,
0.
50
±
0.
05
to
0.
68
±
0.
08
,
1
.
07
±
0.
02
(
P<0.
05)
,
cleaved
caspase-3
,
cleaved
PARP
protein
expression
increased
,
LC3
U/LC3
I
and
Beclin
1
protein
expres
・
sion
decreased.
Compared
with
palmitic
acid
alone
treatment
,
the
expression
of
P53
and
P21
mRNA
were
down-regulated
from
0.
68±0.
08,
1.
07±0.
02
to
0.
44±0.
01
,
0.
67±0.
03
in
losartan
potassium
treated
group
(
P<0.
05)
,
the
expressions
of
cleaved
caspase
・
3,
cleaved
PARP
proteins
were
decreased
,
and
LC3
U/LC3
I
and
Beclin 1
proteins
were
not
changed.
Conclusion
Losartan
potassium
may
reduce
apoptosis
by
inhibiting
cleaved
caspase-3
and
its
substrate
cleaved
PARP
protein
expression
,
but
this
protective
effect
is
not
achieved
by
autophagy.
[
Key
words
]
sarcopenia
；
losartan
potassium
；
apoptosis
；
autophagy
肌少症
(
sarcopenia)
是一种与增龄相关的进
究所细胞库
；
棕植
I
酸购自美国
Sigma
公司
；
氯沙
坦钾购自上海陶素生化科技有限公司
；
CCK-8
检
行性全身肌量减少和(或)肌强度下降或肌肉生
理功能减退为特征的综合征⑴
，
目前尚无明确有
测试剂盒
(
cell
counting
kit
8)
购自日本
Dojindo
公司
；
反转录试剂盒
、
SYBR
Mix
购自德国罗氏公
效的防治肌少症的药物⑵
。
探索和开发作用于骨
骼肌细胞
，
预防肌少症的新药物
，
是当前肌少症
司
，
LC
3
抗体购自美国
sigama
公司
，
caspase-3
和
PARP
抗体购自美国
Cell
Signaling
Technology
公
研究的热点之一
。
棕稠酸可诱导细胞氧化应激
，
引起内质网
Ca"
释放导致细胞质和线粒体
Ca?*
超载
，
并可进
司
，
myogenin
、
R-actin
、
GAPDH
、
Bcl-2
、
Bax
、
Beclin
1
抗体购自英国
Abeam
公司
，
胎牛血清
一步加速线粒体中活性氧
(
reactive
oxygen
sprcies
,
ROS)
的产生并促进线粒体膜通透性转换孔开放
。
(
fatal
bovine
serum
,
FBS
)
购自美国
Gibco
公司
，
马血清
(
horse
bovine
serum
,
HBS
)
购自美国
Abbkine
公司
。
由于内质网
Ca"
持续释放引起了持续的钙过载
，
从而导致了钙池调控的钙离子通道的激活
，
ROS
的产生和
Ca
”
的恶性循环最终可激活细胞凋亡信
实验方法
细胞诱导分化
：
10%
FBS
的高糖培养基
(
dulbecco's
modified
media
,
DMEM
)
培养
L6
成肌
号⑶
。
血管紧张素受体是以血管紧张素作为配体
的
G
蛋白偶联受体
，
既往有临床研究表明对心力
衰竭患者进行氯沙坦钾治疗可提高其运动能
力⑷
，
同时有动物研究表明氯沙坦可以通过抑制
细胞至
80%
左右
，
换含
2%
HBS
的
DMEM
培养
5~7
d,
每
24
小时换一次液
。
细胞活性检测
：
将
L6
成肌细胞种于
96
孔板
中
，
每孔
15
000
个细胞
，
每孔加
100
“
L
含
10%
FBS
的
DMEM,
于
37
弋培养
24
h
。
然后用不含血
转化生长因子
0
(
transforming
growth
factor-p
,
TGF-p)
和丝裂原活化蛋白激酶
(
mitogen
・
activa
・
ted
protein
kinase
,
MAPK)
信号通路加速肌肉损
清的
DMEM
培养
4h,
之后加入不同浓度氯沙坦
伤后愈合
，
提升肌力同时减缓小鼠骨骼肌废用性
萎缩的发展⑸
，
但血管紧张素
II
受体拮抗剂在细
胞水平上对骨骼肌细胞影响及机制尚不清楚
。
本
钾
(
50
、
100
、
200
、
400
ixmol/L)
或不加入氯沙
坦钾继续
37
乜培养
24
h,
同时设立不含细胞的
DMEM
组
。
每孔加入
10
|
jl
L
CCK-8
试剂
，
37
七反
研究应用棕幅酸体外处理骨骼肌细胞
，
然后给予
血管紧张素
II
受体拮抗剂氯沙坦钾干预棕制酸导
致的骨骼肌细胞凋亡
，
观察氯沙坦钾对骨骼肌细
应
1
h,
用酶标仪于
450
nm
处测吸光度值
，
然后
计算细胞活力
。
实验分组
：
将实验分为
4
组
，
对照组、
二甲
基亚砚
(
dimethyl
sulfoxide
,
DMSO
)
处理组
、棕
胞的保护作用
。
材料与方法
材料
植
］
酸
(
1
mmol/L)
处理组以及棕植
I
酸
(
1
mmol/L)
和氯沙坦钾
(
50
jimol/L)
共同处理组
。
因为本
研究氯沙坦钾粉剂是溶于
DMSO
后用于处理细胞
的
，
故添加相同剂量
DMSO
组用以排除后续
大鼠成肌细胞
L6
购自中国科学院上海细胞研
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2019
年11
月第
12
卷第
6
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&
BONE
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12
No.
6
November
10,
2019
•
597
•
DMSO
对实验结果的影响
。
(
1
：
5
000)
,
myogenin
(
1
:
200)
,
Bcl-2
(
1
：
1
000
),
实时荧光定量
PCR
(
quantitative
real-time
PCR,
beclin
1(1
：
2
000)
,
Bax
(1
：
2
000),
GAPDH
qPCR)
检测
：
按照
Trizol
法提取
RNA
说明书指示进
(1
：
4
000)
—
抗工作液
4
七孵育过夜
，
TBST
清
行操作
；
并对
RNA
进行浓度测定
；
反转录为
cDNA
；
洗
10
minx3
次
，
然后加辣根过氧化物酶标记的二
所有引物均由上海杰李生物工程有限公司设计合成,
抗
(1
:
5
000),
室温孵育
1
h,
再
TBST
洗涤
GAPDH
作为内参
，
所用引物名称
、
序列见表
1
。
反
10
minx3
次
。
然后置入含化学发光试剂
A
、
B
的
应体系配置
：
cDNA
(反转录后稀释
10
倍)
2
|iL,
水溶液中激发荧光
，
天能
Tanon
5200
全自动化学
Forward
Primer
(
1
(
imol/L)
4
|j,L,
Reverse
Primer
发光成像分析仪扫描并行灰度值测定
。
实验重复
(
1
junol/L)
4
jxL,
SYBR
Mix
10
|
jl
L
o
按以下反应要
3
次
，
计算各条带的灰度值
，
结果以目的蛋白与
求设置条件
：
95
X
10
min
(预变性)
；
40
个循环:
内参蛋白灰度值之比表示
。
95
T
：
10
s,
60%
：
10
s
；
71
°C
10
s,
95
七
15
s,
60
T
统计学方法
15
s,
95
P
15
s,
4
P
保持
。
结果采用
2-
阿法计算
采用
SPSS
21.
0
统计软件对实验结果进行统
基因的相对表达水平
。
计学分析
，
数据以均数土标准差
(
X±5
)
表示
。
实
蛋白表达检测
：
采用
Western
Blot
法
，
裂解
验数据均进行正态分布检验及方差齐性检验
，
组
经过处理后的细胞
，
每个样本每孔加入
40
pg
蛋
间比较采用独立样本
t
检验
。
P<0.
05
为差异有统
白液
，
经
SDS-PAGE
胶电泳后转膜
，
用
5%
脱脂奶
计学意义
。
粉室温封闭
1
h,
caspase-3
(
1
：
1
000
)
,
p-actin
结
果
表
1
P53,
P21
和
GAPDH
引物序列
诱导成肌细胞
L6
分化为骨骼肌细胞
Table
1
Primer
sequences
of
P53
,
P21
and
GAPDH
用
2%
HBS
培养
L6
成肌细胞
5~7
d,
显微镜
名称
序列
长度
(bp)
下观察发现
L6
成肌细胞分化成为骨骼肌细胞后形
P53
GCGTTGCTCTGATGGTGAC
19
态发生改变
，
相互融合变细变长(图
1),
GCGTGATGATGGTAAGGATGG
21
P21
ACTCTGAAGATGTGCCTATGGT
22
Western
Blot
结果显示诱导分化后相比于未分化的
CGCTGAGGTCTCAATGAATGG
21
成肌细胞其
myogenin
蛋白表达水平显著增加
(P<
GAPDH
ATGCCATCACTGCCACTCA
19
0.05)
(图
2)
。
CCTGCTTCACCACCTTCTTG
20
确定合适的氯沙坦钾处理浓度
CCK-8
细胞活性检测结果可见
，
50
-
200
pmol/L
A
B
图
1
诱导分化后骨骼肌细胞和未分化成肌细胞形态
(x200)
Fig
1
Skeletal
muscle
cells
after
differentiation
and
undifferentiated
myoblast
morphology
(
x200)
A
：
诱导分化后的骨骼肌细胞
；
B
：
未分化的L6
成肌细胞
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•
598
•
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November
10,
2019
氯沙坦钾均对分化后
L6
骨骼肌细胞无细胞毒性,
上调
（
P<0.05
）
,
而加入氯沙坦钾后
P53
、
P21
氯沙坦钾浓度为
400
、
200
、
100
和
50
“
mol/L
时
均有不同程度的下降
（
P<0.05
）
（
表
2
）
。
成肌细胞细胞活力分别为
0.87±0.087
、
1.11
土
氯沙坦钾对骨骼肌细胞凋亡蛋白的影响
0.037
、
1.21
±0.099.
1.
30±0.
068,
50
pmol/L
组
显微镜下观察
4
组细胞
，
与对照组相比
，
棕
与
100
jimol/L
组组间差异无统计学意义
（
P>
植
1
酸处理组可发现细胞大量死亡
，
Western
Blot
显
0.05
）
；
而
50
|imol/L
组和
200
pmol/L
组与
示棕植
1
酸处理组相比于对照组
，
cleaved
caspase-3
、
400
pmol/L
组之间细胞活力差异均有统计学意义
cleaved
PARP
表达均显著增加
（
P<0.05
）
,
而加
（
P<0.
05
）
（
图
3
）
。
同时用棕涧酸
（
1
mmol/L
）
入氯沙坦钾后可见细胞死亡略有减少
，
cleaved
处理骨骼肌细胞后
，
加入以上不同浓度氯沙坦钾
，
caspase-3
、
cleaved
PARP
蛋白相比于单加棕植
］
酸
Western
Blot
检测示氯沙坦钾
50
）
xmol/L
时
cleave
组有所减低
（
P<0.05
）
,
同时
4
组
Bcl-2/Bax
表达
caspase-3
表达抑制最显著
，
其对骨骼肌的保护作
均无差异
（
P>0.05
）
（
图
5
）
。
用最明显
（
图
4
）
,
因此后续实验氯沙坦钾浓度选
氯沙坦对骨骼肌细胞自噬蛋白的影响
择为
50（
xmol/L
0
与对照组相比
，
棕桐酸处理组
LC3
D/LC3
I
肌细胞衰老模型的构建及氯沙坦钾对其影响
及
Beclin
1
蛋白表达减低
（
P<0.05
）
；
但棕植
1
酸
与对照组相比
，
棕植
I
酸处理组
P53
、
P21
均
和氯沙坦钾共同处理组相比于棕植
I
酸组
LC3
n/
LC3
I
及
Beclin
1
无差异
（
P>0.
05
）
（
图
6
）
。
分化未分化
myogenm
p-actin
分化
未分化
A
B
图
2
分化前后骨骼肌细胞
myogenin
表达差异
图
4
不同浓度氯沙坦钾对棕稠酸处理后骨骼肌细胞
Fig
2
Differential
expression
of
myogenin
in
skeletal
cleaved
caspase-3
的影响
muscle
cells
before
and
after
differentiation
Fig
4
Effects
of
difTerent
concentrations
of
losartan
A
：
电泳图
；
B
：
细胞质中
myogenin
相对灰度值；
potassium
on
cleaved
caspase-3
of
skeletal
与分化后骨骼肌细胞组比较
，
*P<0.
05
muscle
cells
after
palmitate
treatment
PA：
棕桐酸
；
DMSO
：
二甲基亚矶
；
Con
：
对照组
表
2
氯沙坦钾对棕櫚酸干预骨骼肌细胞
P53
和
P21
mRNA
表达的影响
（
x±s
）
Table
2
Effects
of
losartan
potassium
exposure
on
P53
and
P21
mRNA
expression
of
palmitate
treated
skeletal
muscle
cell
(
x±s
)
组别
P53
P21
Con
组
0.
36±0,
03
0.
50±0.
05
图
3
不同浓度氯沙坦钾对成肌细胞细胞活力的
DMS
0
组
0.
30±0.
02
0.
45±0.
03
影响(丘
±5
)
PA
组
0.
68±0.
08
*
1.07±0.
02*
Fig
3
Effects
of
differrent
concentration
losartan
PA+Los
组
0.
44
士
0.01#
0.
67±0.
03#
potassium
on
myoblast
cell
viability
(x±s)
Con
：
对照组
；
DMSO
：
二甲基亚砚
；
PA
：
棕桐酸
；
Los
：
氯沙坦
与氯沙坦钾浓度为
50
pmol/L
组比较
，
-P<0.
05
钾
；
与对照组比较
，
*P<0.05
；
与棕舸酸处理组比较
，
*P<0.05
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2019
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12
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6
November
10,
2019
・
599
・
Con
DMSO
PA
PA+Los
图
5
氯沙坦钾对棕桶酸干预骨骼肌细凋亡蛋白表达的影响
Table
5
Effects
of
losartan
potassium
exposure
on
apoptotic
protein
expression
of
palmitate
treated
skeletal
muscle
cell
A
：
电泳图
；
B
：
细胞质中凋亡蛋白相对灰度值
；
Con
：
对照组
；
DMSO
：
二甲基亚砚
；
PA
：
棕桐酸
；
Los
：
氯沙
坦钾
；
与对照组比较
，*P<0.
05
；
与棕桐酸处理组比较
，
#
Pv0.05
LC3-I
LC3-U
GAPDH
A
图
6
氯沙坦钾对棕櫚酸干预骨骼肌细自噬蛋白表达的影响
Table
6
Effects
of
losartan
potassium
exposure
on
autophagy
protein
expression
of
palmitate
potassium
treated
skeletal
muscle
cell
A
：
电泳图
；
B
：
细胞质中自噬蛋白相对灰度值
；
Con
：
对照组
；
DMSO
：
二甲基亚枫
；
PA
：
棕桐酸
；
Los
：
氯沙
坦钾
；
与对照组比较
，
*P<0.05
讨
论
及
myogenin
蛋白检测可证明成肌细胞是否分化为
骨骼肌细胞
。
衰老是引起肌少症发生发展的主要
目前国内外对于肌少症的研究绝大多数聚焦
原因
，
构建骨骼肌细胞衰老模型是在细胞水平上
于临床以及动物实验
，
如何在细胞水平上构建骨
研究肌少症的必要条件
。
P53
作为一种抑癌基因
，
骼肌细胞衰老模型以及从细胞水平上研究肌少症
其在衰老过程中具有十分重要的作用
，
细胞有丝
治疗药物作用机制将给肌少症基础研究和临床治
分裂中的复制增殖压力会引起
DNA
损伤等
，
导致
疗提供新的思路
。
细胞周期停滞
，
同时端粒随细胞分裂呈现周期性
Myogenin
在肌生成中具有重要的作用
，
其表
和渐进性缩短
，
进而影响
P53
和
P21
基因
，
激活
达意味着成肌细胞增殖的结束
，
是骨骼肌细胞分
CDK
抑制因子
，
最终引起细胞复制性衰老
〔
7
列
。
化成熟的一个重要标志物国
。
通过显微镜观察以
本研究发现棕植
1
酸可以导致骨骼肌细胞
P53
和
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•
600
•
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BONE
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12
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6
November
10,
2019
P21
基因表达上升
，
提示棕櫚酸可用于构建骨骼
肌细胞衰老模型
。
Bcl-2
和
Bax
是
Bcl-2
家族的主要成员
，
分别
起抗凋亡和促凋亡作用
，
可用其比值衡量凋亡水
平的大小
，
但凋亡程度的大小不仅与两种蛋白的
表达量相关
，
还与
Bax
细胞定位以及
Bcl-2
是否
磷酸化密切相关⑼
。
其下游
caspase-3
是细胞凋亡
的关键蛋白
，
其激活后可裂解为多种小分子底物
从而执行相关功能
，
最终导致细胞凋亡
〔
回
。
本研
究虽然发现棕稠酸可以使骨骼肌细胞凋亡增加
，
但
Bcl-2
和
Bax
并无显著变化
，
因此需要进一步
对其细胞定位以及磷酸化状态进行研究
。
血管
紧张素
U
1
型受体
(
angiotensin
U
type
1
receptor
,
AT1R)
增加
，
血管紧张素
II
2
型受体
(
angiotensin
D
type
2
receptor,
AT2R)
降低
，
可能会引起起四
肢骨骼肌的萎缩⑴)
。
先前动物研究表明血管紧张
素受体抑制剂治疗可导致衰老小鼠中
IL-6
和自由
基的产生减少"⑶
，
Burks
等
［
⑷发现给予经心肌
毒素处理后的小鼠氯沙坦后
，
其肌肉损伤后修复
能力及肌肉功能明显提升
，
同时发现氯沙坦不仅
减弱了经典的
TGF-p
级联信号
，
还调节了非经典
的
TGF-p
丝裂原活化蛋白激酶信号通路
。
Hwang
等发现氯沙坦可以增加
CCIA
处理后小鼠的
Pax
、
MyoD
和
myogenin
等肌肉损伤修复蛋白的表
达
，
同时还可以阻断
TGF-p
信号传导而促进这种
修复作用
。
不仅如此
，
Elbaz
等
M
还在
dy2J/dy2J
小鼠中发现氯沙坦不仅可以通过
TGF-p
信号以及
MAPK
信号提升肌肉强度减少纤维化
，
同时还可
以通过活化
NF-
k
B
信号来促进其下游靶基因
TRAF1
、
TRAF2
、
clAP2
和
FTH1
的表达抑制凋亡
从而发挥保护作用
。
本研究进一步在细胞水平上
发现氯沙坦钾可以抑制
cleaved
caspase-3
和
cleaved
PARP
的表达
，
提示氯沙坦钾对骨骼肌保
护效应可能通过凋亡途径实现
，
同时
qPCR
结果
还发现氯沙坦钾可以使棕植
1
酸处理后的骨骼肌细
胞
P53
和
P21
基因表达下调
，
提示这种保护效应
可能也与
P53
途径密切相关
。
自噬是一种保守的细胞内过程
，
但棕櫚酸对
于骨骼肌细胞自噬的影响尚存在争议
，
Chang
等的研究显示棕植
I
酸可增强骨骼肌细胞的自噬
作用
；
而
Chen
等的研究发现棕櫚酸可抑制骨
骼肌细胞的自噬
。
本研究通过对自噬起始的重要
调节因子
Beclin
1
和自噬体形成的标志蛋白
LC3
研究发现棕植酸可抑制骨骼肌细胞的自噬
，
这与
Chen
的研究结果一致
。
出现研究结果差异的原因
可能是由于细胞系的不同以及棕植
I
酸浓度的差异
。
本研究进一步研究了氯沙坦钾对棕植
1
酸改变的自
噬的影响
，
但结果并没有发现氯沙坦钾对棕涧酸
改变的自噬产生影响
，
提示氯沙坦钾可能并不通
过自噬途径发挥其对骨骼肌的保护作用
，
其保护
机制尚有待于进一步研究
。
综上所述
，
氯沙坦钾可通过抑制
cleaved
caspase-3
及其底物
cleaved
PARP
表达
，
使骨骼肌
细胞凋亡减少从而发挥保护效应
，
但这种保护效
应可能并不是通过影响自噬途径实现的
。
本研究
探索了肌少症研究细胞模型的建立
，
同时为肌少
症的治疗提供了新的思路和依据
。
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